Физико-химические свойства и механизм расщепления РНК соединениями, не содержащими функциональных групп, катализирующих реакцию трансэтерификации

ДиссертацияПомощь в написанииУзнать стоимостьмоей работы

Вещества, способные эффективно и специфично расщеплять РНК в физиологических условиях могут найти важные применения в молекулярной биологии и биотехнологии. Молекулы небольшого размера, способные эффективно расщеплять РНК могут быть использованы для изучения пространственной структуры РНК и белково-нуклеиновых взаимодействий. Кроме того, такие соединения могут стать основой для создания… Читать ещё >

Содержание

Список сокращений

Глава 1. Роль гидрофобных взаимодействий в РНК-белковых комплексах (Обзор литературы)

1.1 Характеристика ван дер Ваальсовых и стэкинг-взаимодействий

1.2. Общие закономерности образования РНК-белковых контактов

1.3. Роль гидрофобных взаимодействий в связывании РНК различными белками

1.3.1. Часто встречающиеся РНК-связывающие мотивы

1.3.1.1. РНК-распознающий мотив (RRM)

1.3.1.1.1. U1A и U2B" белки

1.3.1.1.2. RRM в комплексе с ДНК

1.3.1.2. Мотив, связывающийся с двухцепочечной РНК (dsRBD)

1.3.1.2.1. dsRBD в РНКазе III

1.3.1.2.2. dsRBD в Staufen белке

1.3.1.3. К-гомологичный (КН) домен 27 1.3.1.3.1. КН домен в белке SF

1.3.2. Рибосомные белки 29 1.3.2.1. Взаимодействие 5S рРНК с рибосомными белками

1.3.3. Белки, взаимодействующие с тРНК

1.3.3.1. Образование псевдоуридина из уридина

1.3.3.2. Взаимодействие тРНК с аминоацил-тРНК-синтетазами

1.3.4. Белки-регуляторы различных процессов в жизненных циклах клетки и вирусов

1.3.4.1. Sm белок

1.3.4.2. Белок оболочки вируса MS

1.3.4.3. Роль гидрофобных взаимодействий в узнавании кэпированной РНК и инициации трансляции

1.3.4.4. Белки, связывающиеся с TAR РНК

1.3.4.5. Гидрофобные взаимодействия при связывании белков с IRES

1.3.4.6. Антитерминация транскрипции в фаге X

1.3.4.7. Роль гидрофобных взаимодействий в токсичности рицина 46 1.3.5. Роль гидрофобных взаимодействий во взаимодействии РНКаз с РНК

1.3.5.1. РНКазаЕ

1.3.5.2. РНКаза HI

1.3.5.3. РНКазаН

1.3.5.4. РНКаза Р 50

Заключение

Глава 2. Экспериментальная часть

2.1. Материалы

2.1.1. Реактивы и препараты

2.1.2. Плазмиды

2.1.3. Олигорибонуклеотиды и РНК

2.1.4. Буферные растворы, использованные в работе

2.2. Методы 57 2.2.1. Электрофорез в ПААГ в денатурирующих условиях 57 2.2.2 Исследование комплексов PHK/Dpl2 с использованием светорассеяния

2.2.2.1 Определение критической концентрации мицеллообразования Dpl

2.2.2.2 Исследования кинетики взаимодействия Dpi2 с РНК

2.2.2.3 Определения молекулярных параметров комплексов (Dpl2 + РНК)

2.2.3. Получение РНК с помощью реакции транскрипции in vitro

2.2.3.1. Получение линейной формы плазмиды

2.2.3.2. Транскрипция in vitro

2.2.3.3. Очистка РНК-транскриптов

2.2.4. Введение [JZP]

-метки по 5 '-концу РНК

2.2.5. Частичный гидролиз РНК в денатурирующих условиях

2.2.6. Расщепление РНК искусственными рибонуклеазами

2.2.7. Измерение кинетических параметров реакции расщепления олигонуклеотида ON21 в присутствии или в отсутствие веществ, ускоряющих расщепление

3. Глава 3. Физико-химические свойства и механизм расщепления РНК соединениями, не содержащими функциональных групп, катализирующих реакцию трансэтерификации

Результаты и обсуждение)

3.1. Общая структура новых искусственных рибонуклеаз

3.2. Структура РНК-мишеней, использовавшихся в работе

3.3. Комбинаторные библиотеки химических рибонуклеаз

3.3.1 Дизайн и синтез комбинаторных библиотек

3.3.2. Рибонуклеазная активность комбинаторных библиотек

3.3.2.1. Рибонуклеазная активность полных библиотек

3.3.2.2. Рибонуклеазная активность усеченных комбинаторных библиотек

3.4. Сравнение рибонуклеазной активности индивидуальных соединений Dp6, Dp 12, Dp2/12 и детергентов

3.4.1. Свойства новых искусственных рибонуклеаз

3.4.2 Зависимости степени расщепления РНК от концентрации искусственных рибонуклеаз

3.4.3. Кинетика расщепления РНК искусственными рибонуклеазазми 83 3.4.4 Расщепление РНК в присутствии детергентов 85 3.4.5. Определение констант скорости расщепления РНК

3.5 Влияние условий реакций на расщепление РНК соединением Dp

3.5.1. Влияние рН на скорость расщепления РНК соединением Dpl

3.5.2. Влияние концентрации имидазола

3.5.3. Обсуждение влияния рН и имидазола

3.5.4. Влияние буфера

3.5.5. Влияние одновалентных катионов

3.5.6. Обсуждение влияния буферов и одновалентных катионов

3.5.7. Синергизм в расщеплении РНК соединением Dpl

3.6 Изучение взаимодействия молекул Dp 12 с фрагментами РНК различной длины методом статического и динамического светорассеяния

3.6.1 Определение критической концентрации мицеллообразования Dp

3.6.2 Исследования кинетики взаимодействия Dpi2 с РНК

3.6.3 Определения молекулярных параметров комплексов (Dp 12 + РНК)

3.7. Сиквенс-специфичность расщепления РНК соединениями Dpl2 и Dp2/

3.8. Предположительный механизм расщепления РНК соединением Dp 12 105

Выводы 107

Список литературы

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ В настоящей работе использованы следующие сокращения: оцРНК (ss), Одноцепочечная РНК (ДНК) оцДНК дцРНК (ds), Двуцепочечная РНК (ДНК) дцДНК тРНК Транспортная РНК мРНК Матричная РНК рРНК Рибосомная РНК

РНКаза Рибонуклеаза

HEPES 4-(2-гидроксиэтил)-1 -пиперазинэтансульфокислота

Трис, Tris Трис-(оксиметил)-аминометан

EDTA Этилендиаминтетрауксусная кислота

DABCO 1,4-диазабицикло[2.2.2]октан

ПААГ Полиакриамидный гель

SDS Додецилсульфат натрия

HIV Вирус иммунодефицита человека

MDR1 Ген множественной лекарственной устойчивости

Y Y=C, U — пиримидины

R R=G, А — пурины

К K=G, U

X X = A, G, U

Физико-химические свойства и механизм расщепления РНК соединениями, не содержащими функциональных групп, катализирующих реакцию трансэтерификации (реферат, курсовая, диплом, контрольная)

Вещества, способные эффективно и специфично расщеплять РНК в физиологических условиях могут найти важные применения в молекулярной биологии и биотехнологии [1,2]. Молекулы небольшого размера, способные эффективно расщеплять РНК могут быть использованы для изучения пространственной структуры РНК и белково-нуклеиновых взаимодействий. Кроме того, такие соединения могут стать основой для создания высокоэффективных противовирусных и противоопухолевых препаратов. РНК расщепляется с помощью ряда простых соединений [3−20], которые могут быть разделены на два класса: (1) комплексы переходных металлов (Си2+ [3,4], Zn2+ [5−7], Eu3+ [8,9], Pb2+ [10,11]), и (2) органические молекулы, такие как биогенные амины [12,13], некоторые пептиды [14−17], и детергенты [18,19]. Расщепление РНК соединениями из второй группы часто приводят к образованию 2', 3'-циклофосфата и 5'-гидроксильной группы в сайте расщепления [13,20]. Были предприняты попытки синтезировать небольшие катализаторы расщепления РНК путем копирования активных центров природных рибонуклеаз [21,22]. Аминокислоты, найденные в каталитических центрах этих ферментов, были присоединены к молекулам, способным связываться с РНК, например катионным структурам [23,26−28], интеркалирующим молекулам [23−25] или олигонуклеотидам [2931]. Некоторые из этих конъюгатов проявляли достаточно высокую рибонуклеазную активность [23,26,30].

Недавно в нашей лаборатории были синтезированы искусственные рибонуклеазыконъюгаты 1,4-диазабицикло[2.2.2]октана и имидазола [26,27]. Эти искусственные рибонуклеазы состояли из четырех фрагментов: гидрофобного (тридецильного радикала, обозначенного А), РНК-связывающего (диазабициклооктана, обозначенного В), линкера различной длины (олигометиленовый мостик, обозначенного Ц, где к=1−4) и каталитического фрагмента (обозначенного Ст, где т-различные производные имидазола). Было показано [26], что синтетические конструкции ABLkCm обладают относительно высокой рибонуклеазной активностью, причем их активность зависит от структуры, и наиболее активные из них количественно расщепляют РНК за 24 часа. Кроме того, авторами была исследована рибонуклеазная активность контрольных соединений, в которых отсутствовали один или несколько вышеперечисленных фрагментов. Оказалось, что соединение BL3C3, содержащее как РНК-связывающий, так и каталитический фрагменты практически не расщепляет РНК, тогда как активность соединения АВ, в котором присутствовали гидрофобный и РНК-связывающий фрагменты, но отсутствовал каталитический фрагмент, оказалась всего в 3−5 раз ниже, чем у соединений, содержащих все фрагменты. На основании этих данных был сделан вывод, что активность соединений.

ABLicCm в значительной степени определяется наличием гидрофобного фрагмента. Эти данные хорошо коррелируют с немногочисленными работами по расщеплению РНК гидрофобными соединениями. Так, в работе [32] было показано, что при инкубации олигорибонуклеотида, имеющего структуру шпильки, в присутствии неионного детергента Brij 58, происходит его расщепление по связям Y-A.

В работе [19] расщепление фосфодиэфирных связей в С-А и U-A мотивах, расположенных в петлях, происходило под действием неионных детергентов, (Triton X-100), или цвиттерионных детергентов, но не в присутствии анионных детергентов.

Таким образом, возникла идея о создании искусственных рибонуклеаз путем объединения в одной молекуле только гидрофобных и катионных структур.

Как известно, активный центр природных рибонуклеаз состоит из РНК-связывающего и каталитического центров. При проведении аналогии искусственных рибонуклеаз с природными, можно сказать, что в данных конъюгатах катионная часть выполняет функцию связывающего центра, а гидрофобная — каталитического центра. Известно, что каталитический центр многих ферментов действует частично путем приближения конформации субстрата к конформации переходного состояния с помощью образования специфических водородных и вандерваальсовых связей, при этом гидрофобные взаимодействия играют важную роль при взаимодействиях белков с нуклеиновыми кислотами. Основные взаимодействия происходят между гидрофобными остатками в белках и гетероциклическими основаниями нуклеиновых кислот. В результате этих взаимодействий происходит перестройка структуры как фермента, так и субстрата, причем конформация субстрата приближается к конформации переходного состояния, а фермента — к активной для катализа конформации.

Таким образом, целью настоящей работы являлся поиск наиболее эффективных искусственных рибонуклеаз — конъюгатов гидрофобных и катионных структур и исследование механизма расщепления РНК данными рибонуклеазами. В ходе исследования решались следующие задачи: 1) изучение рибонуклеазной активности комбинаторных библиотек химических рибонуклеаз — конъюгатов гидрофобных и катионных структур, 2) выявление закономерностей в строении соединений, влияющих на их активность, 3) изучение активности индивидуальных соединений, идентифицмрованных путем анализа наиболее активных комбинаторных библиотек, 4) с помощью различных физических и биохимических методов установление механизма расщепления РНК соединениями не содержащими групп, способных катализировать расщепление фосфодиэфирных сязей.

Выводы.

1. Исследованы РНК-расщепляющне свойства комбинаторных библиотек новых химических рибонуклеаз — конъюгатов гидрофобных и катионных фрагментов, в которых отсутствуют группы, традиционно участвующие в катализе реакции трансэтерификации фосфодиэфирных связей в РНК.

Показано, что комбинаторные библиотеки новых химических рибонуклеаз эффективно расщепляют РНК. При этом наибольшую активность проявляют соединения, в которых два бискватернизованных остатка 1,4-диазабициклооктана находятся в пара-положении бензольного кольца, а для проявления высокой рибонуклеазной активности в структуре соединений необходим хотя бы один додекаметиленовый фрагмент.

2. В результате анализа библиотек выявлены индивидуальные соединения, обладающие наибольшей рибонуклеазной активностью. Исследована зависимость активности новых соединений от их строения, измерены кинетические константы расщепления РНК данными соединениями.

Показано, что наиболее активное исследованное соединение, в котором с кватернизованными атомами азота остатков 1,4-диазабициклооктана связаны додекаметиленовые фрагменты (Dp 12), ускоряет самопроизвольное расщепление РНК в 20 миллионов раз.

3. Исследованы физико-химические свойства новой химической рибонуклеазы Dp 12. Показано, что.

— Dp 12 катализирует расщепление 9 из 16 возможных типов фосфодиэфирных связей, причем эффективность расщепления различных связей совпадает с литературными данными по скорости самопроизвольного расщепления этих фосфодиэфирных связей в водном растворе.

— условий реакции оказывают серьезное влияние на эффективность расщепления РНК соединением Dp 12. Имидазол в концентрации 10 мМ, одновалентные катионы, увеличение рН раствора повышают эффективность расщепления РНК соединением Dp 12 в 3−10 раз.

— Dp 12 при расщеплении РНК находится в форме индивидуальных молекул. На начальной стадии процесса расщепления молекулы Dp 12 связываются с фрагментом РНК, образуя надмолекулярные комплексы, при этом, чем больше размер фрагмента РНК, тем больше образующийся комплекс. Затем, по мере расщепления РНК происходит постепенное уменьшение размеров комплекса.

4. Предложен механизм расщепления РНК соединением Dpi2, заключающийся в следующем: при взаимодействии этого соединения с межнуклеотидными фосфатами, происходит изменение конформации фосфодиэфирной связи и нарушается сеть водородных связей, образованных межнуклеотидными фосфатами и связанными молекулами воды. При этом конформация РНК приближается к оптимальной для процесса расщепления, а молекулы воды выступают в качестве катализаторов расщепления РНК и являются источниками гидроксильных групп для реакции трансэтерификации.

Заключение

Гидрофобные взаимодействия играют важную роль в РНК-белковых комплексах. Роль этих взаимодействий в большинстве случаев определяется структурой РНК, белка или самого комплекса. Так, из приведенных примеров с РНКазой III или с рибосомными белками видно, что в комплексах, образованных белками и дцРНК, гидрофобные взаимодействия играют гораздо менее важную роль, чем в комплексах с оцРНК. Это в первую очередь обусловлено структурированностью дцРНК, где снаружи находятся гидрофильный рибозофосфатный остов, а гидрофобные основания «спрятаны» внутри спирали. В этом случае функция неполярных аминокислотных остатков в белках сводится к образованию гидрофобных карманов для оснований в петлях. В большинстве случаев связывание дцРНК с белками происходит неспецифически, однако есть примеры, когда белками узнаются петли (например, тетрапетля AGNN в случае РНКазы III или UUCG в случае Staufen-белка). Есть случаи, когда наблюдается интеркаляция ароматических аминокислот внутрь спирали с образованием стэкинг-взаимодействий. Это, например, происходит в случае РНКазы Н, взаимодействующей с гетеродуплексом РНК/ДНК, имеющим А-форму спирали. Консервативный остаток триптофана в этом белке встраивается в спираль, в то время как два консервативных остатка лизина образуют водородные связи в малой бороздке гетеродуплекса.

При связывании белков с оцРНК, гидрофобные остатки очень важны. Например, в КН-домене образуется множество Ван дер Ваальсовых контактов с РНК, однако в отличие от дцРНК-связывающихся белков, большинство контактов в этом домене происходит с основаниями, что позволяет проявлять этому мотиву специфичность. Также важную роль играет образование ароматическими и разветвленными неполярными боковыми цепями аминокислот гидрофобных карманов как, например, в случае с аминоацил-тРНК синтетазами. Однако самую важную функцию при связывании с оцРНК выполняют ароматические боковые цепи, которые вступают в стэкинг-взаимодействия с основаниями в РНК. Наиболее эффективное и специфичное узнавание фрагментов РНК происходит в случае сопряжения стэкинг-взаимодействий с сетью водородных связей. При отсутствии или малом количестве полярных аминокислот в сайте узнавания РНК, как, например, в случае с РНКазой Р или белками, узнающими IRES-элементы, специфического узнавания какой-либо определенной последовательности в РНК не происходит. В первом случае, РНКаза Р узнает большое число лидирующих участков, без какого-либо сходства в последовательностях, во втором случае, вероятнее всего, большее влияние на узнавание IRES-элемента оказывает его вторичная и третичная, чем первичная структуры.

При сопряжении стэкинга с водородными связями, происходит специфичное узнавание последовательностей в РНК, как например в случае с аминоацил-тРНК синтетазами (узнавание структурных детерминантов в тРНК), с белком Sm (узнавание урацила, но не других оснований), с РНКазой Т1 (узнавание нуклеотида в сайте расщепления).

Однако самое специфичное узнавание в комплексах РНК-белок при сопряжении сети водородных связей с тройным стэкингом (сэндвичподобной структурой), как, например, в случае TruB белка, узнающего основание U55 в тРНК, рицина, узнающего аденозин в позиции 4324 в 28S рРНК или фактора инициации трансляции eIF4E, узнающего кэп в мРНК. Стэкинг в случае РНКазы А, и сэндвич-подобные структуры в случае РНКаз Е и Т1 влияют на ускорение реакций путем благоприятной для катализа ориентации РНК или каталитических групп в белке. К этому можно добавить, что не только в ферментах, но и в других белках при образовании важных стэкинг взаимодействий происходит стабилизация как всего комплекса, так и правильной структуры его участников, как например, в случае белка-хамелеона, связывающегося с участком BIV TAR или белка оболочки бактериофага MS2 — с фаговой РНК. Более того, стабилизация структуры всего комплекса и его участников зависит также и от правильного окружения аминокислоты, образующей стэкинг-контакт. Например, в случае с белком N из фага X, показано, что стэкинг-взаимодействия, а соответственно и прочность комплекса РНК-белок, напрямую зависят от окружающих аминокислот, и могут либо ослабляться, например, вследствие появления электростатического отталкивания либо усиливаться, благодаря конформационным сдвигам.

Все эти данные свидетельствуют о важной роли гидрофобных, и в частности, ароматических аминокислот при связывании белков с РНК. Во многих работах показано, что аминокислоты, образующие гидрофобные взаимодействия, являющиеся необходимыми для правильного образования комплекса, сами являются или консервативными, или даже инвариантными. Так происходит в случае с ароматическими аминокислотами в U1A белке, в РНКазе Р и других белках, консервативными в большинстве видов. Путем эволюционного анализа можно выделить белки, имеющие сходные структурные мотивы, содержащие необходимые стэкинг-взаимодействия, и не изменяющиеся в разных организмах от эукариотах до вирусов, как, например, в случае с кэп-связывающимися белками, что говорит о строгой консервативности, и, соответственно, важности этих мотивов.

ГЛАВА 2. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.

2.1. Материалы.

2.1.1. Реактивы и препараты.

В работе использовали рибонуклеозидтрифосфаты, акриламид, N-N'-метиленбисакриламид, агарозу, LiC104, DTT, MgCb, EDTA, Трис, TEMED, BSA, бромфеноловый синий, ксиленцианол, краситель «Stains-All» производства фирмы «Sigma» (США) — SDS, имидазол, формамид, персульфат аммония фирмы «Fluka» (Швейцария) — мочевину фирмы «ICN» (США). Прочие реактивы были отечественного производства марки «о.с.ч» или «х.ч» .

Ферменты: Т4 полинуклеотид-киназа, РНКаза Т1 фирмы «Sigma» (США) — бактериальная щелочная фосфатаза производства «Boehringer Mannheim» (Германия) — эндонуклеазы рестрикции Dra I, Smal, Fok 1 и Bst2UI производства «Сибэнзим» (Россия), РНК-полимераза фага Т7 производства Лаборатории биоорганической химии ферментов ИХБФМ СО РАН. y^PJATP с удельной активностью ~ 4000 Ки/ммоль производства «Биосан» (Россия).

В работе использовали спектрофотометр «Милихром» (НПО «Научприбор», г. Орел, Россия), вакуумную сушку для акриламидных гелей «LABCONCO» (США), рН-метр «Orion 41 OA» (США), счетчик радиоактивности «Canberra Packard» (США), фосфоримиджер «Molecular Imager FX» фирмы «Bio-Rad» (США), центрифуги «Eppendorf 5415» (Германия), аппарат для измерения светорассеяния VA Instruments Со Ltd LS-01 (Россия, Санкт-Петербург).

Искусственные рибонуклеазы, использованные в работе, были синтезированы в Лаборатории органического синтеза ИХБФМ СО РАН, аспирантом Бураковой Е. А. под руководством д.х.н. В. Н. Сильникова.

Для приготовления всех буферных растворов и реакционных проб использовали воду, очищенную на установке MilliQ фирмы Millipore (США). Все буферы подвергали стерилизации фильтрованием через нитроцеллюлозный фильтр (0,22 мкм) фирмы Millipore (США).

2.1.2. Плазмиды.

Для получения фрагментов MDR1 мРНК, HIV-1 РНК и тРНКРНе в реакции транскрипции in vitro использовали плазмиды pBluescriptMDR670, pHIV2 и dYF90, соответственно, из коллекции ИХБФМ СО РАН.

2.1.3. Олигорибонуклеотиды и РНК.

Олигорибонуклеотид ON21, r (UCGAAUUUCCACAGAAUUCGU) был синтезирован в группе химии олигорибонуклеотидов ИХБФМ СО РАН фосфитамидным методом на синтезаторе ASM-102U (ТОО «БИОССЕТ», Новосибирск) и очищен ионообменной и обращеннофазовой хроматографией или препаративным электрофорезом в денатурирующих условиях. Чистоту олигонуклеотида проверяли с помощью электрофореза в 15% ПААГ в денатурирующих условиях, визуализацию олигонуклеотида в геле проводили с помощью окраски Stains-All. В качестве носителя при работе с меченными РНК транскриптами использовали суммарную тРНК из E. coli фирмы Вектор (Россия).

2.1.4. Буферные растворы, использованные в работе.

Буфер В «Сибэнзим»: 10 мМ Трис-HCl, рН 7.6,10 мМ MgCl2,1 мМ DTT.

Т7-буфер: 40 мМ Трис-HCl, рН 7.5, 16 мМ MgCl2, 2 мМ спермидин, 10 mMDTT.

Т4-ПНК: 50 мМ Трис-HCl,'рН 7.6, 10 мМ MgCl2, 1 мМ DTT, 0.1 мМ спермидин.

ТВЕ: 100 мМ Трис-борат, рН 8.3,2 мМ EDTA.

ТЕ: 10 мМ Трис-HCl, рН 8.0,1 мМ EDTA.

Буфер D: 6 М мочевина, 25 мМ цитрат натрия, рН 4.5 — 4.8,1 мМ EDTA, 100 мкг/мл суммарной тРНК Е. coli.

Буфер Е: 2 М имидазол, рН 7.0, 1 мМ EDTA, 250 мкг/мл суммарной тРНК Е. coli.

Буфер А: 50 мМ Na-ацетат, 0.2 М КС1, 0.1 мМ EDTA.

Буфер М: 50 мМ MES, 0.2 М КС1,0.1 мМ EDTA, рН 7.0.

Буфер Н: 50 мМ HEPES, рН 7.0, 0.2 М КС1, 0.1 мМ EDTA.

Буфер Т: 50 мМ Трис-HCl, 0.2 М КС1, 0.1 мМ EDTA.

Буфер С: 50 мМ какодилат натрия, 0.2 М КС1, 0.1 мМ EDTA.

Буфер Р: 25 мМ Na2HP04- 25 мМ NaH2P04- 0.2 М КС1- 0.1 мМ EDTAрН 7.0.

Буфер для нанесения на гель 7 М мочевина, 0.025%-ный бромфеноловый синий, 0.025%-ный ксиленцианол.

2.2. Методы.

2.2.1. Электрофорез в ПААГ в денатурирующих условиях.

Во всех экспериментах для разделения фрагментов РНК использовали электрофорез в 8 — 15%-ном ПААГ при соотношении акриламид: N, N'-MeTnneH-бисакриламид = 20: 1 в денатурирующих условиях (в присутствии 8 М мочевины) в буфере ТВЕ при напряженности электрического поля 30 — 45 В/см.

2.2.2 Исследование комплексов PHK/Dpl2 с использованием светорассеяния.

Исследование комплексов PHK/Dpl2 с использованием светорассеяния проводили с помощью аппарата VA Instruments Со Ltd LS-01 (Россия, Санкт-Петербург) калиброванного с помощью очищенного бензола (RgQ = 11.84×10см~1).

2.2.2.1 Определение критической концентрации мицеллообразования Dpl2.

Критическая концентрации мицеллообразования (ККМ) соединения Dp 12 была определена методом статического светорассеяния с помощью аппарата VA Instruments Со Ltd LS-01. Интенсивность светорассеяния (I90) была измерена с помощью вертикально поляризованного света (633 нм) при угле 6 = 90°.

Измерение интенсивности светорассеяния (I90) проводили следующим образом: в кювету объемом 1500 мл вносили раствор Dp 12 в минимальной концентрации в буфере Т объемом 1000 мл. После первого измерения, к раствору добавляли раствор Dpi2 в концентрации, необходимой для получения следующей концентрации. После второго измерения, все действия повторяли снова до достижения последней концентрации Dpl2. Далее строили график зависимости отношения I90/I0 от концентрации, где 1оинтенсивность падающего света. Резкий рост величины I90/I0 наблюдался после достижения соединением Dp 12 ККМ.

2.2.2.2 Исследования кинетики взаимодействия Dpl2 с РНК.

Кинетика взаимодействия РНК с соединением Dp 12 была определена методом статического светового рассеяния. Поскольку величина отношения I90/I0 прямо пропорциональна молярной массе и размеру частиц, присутствующих в растворе, то изменения интенсивности светового рассеяния от времени была измерена при угле 0 = 90°. Измерение интенсивности светорассеяния (I90) проводили следующим образом: в кювету объемом 1500 мл вносили раствор Dp 12 (10 цМ) в буфере Т объемом 1000 мл. После измерения интенсивности светорассеяния раствора в отсутствие РНК (в нулевой точке), в раствор добавляли одну из РНК в конечной концентрации 5 цМ. Измерение интенсивности светорассеяния (I90) в присутствии РНК проводили каждые 10 мин в течение 4 часов, измеряя, таким образом, кинетику процессов, происходящих в растворе.

2.2.2.3 Определения молекулярных параметров комплексов (Dpl2 + РНК).

Средневесовая молекулярная масса Mw, радиус вращения Rg, и второй вириальный коэффициэнт Аг для комплексов Dp 12 с РНК были определены с помощью метода многоуглового светорассеяния в стандартных условиях реакции. Отношение Рэлея Rq было измерено с использованием вертикального поляризованного света (633 пш) на углах в диапазоне 40° < 9 < 140° (13 углов) на аппарате VA Instruments Со Ltd LS-01.

Измерение интенсивности светорассеяния (I90) проводили следующим образом: в кювету объемом 1500 мл вносили раствор Dpi2 (10 цМ) в буфере Т объемом 1000 мл и одну из РНК в конечной концентрации 5 (J.M. Измерение интенсивности светорассеяния (I90) в присутствии РНК проводили не более 30 мин, в течение которых интенсивность светорассеяния (I90) была максимальной и находилась приблизительно на Платовых значениях или различалась не более чем на 10% (по результатам измерения кинетики взаимодействия см. 2.2.2.2), что позволяло сравнивать данные при разных углах.

Полученные данные были использованы для построения угловой и концентрационной зависимостей отношения ЯС/М0 по методу Цимма [183], где С концентрация вещества (г/мл) М0. — увеличение, по сравнению с растворителем,.

2 2 2 4 светорассеяния при угле 0, а Н — оптическая константа, равная 4тг п v IN^k, где NA. число Авогадро, Я — длина волны падающего света, п — показатель преломления растворителя, и v — вклад вещества в показатель преломления. Значения средневесовой молекулярной массы Mw были определены как средние при определении из концентрационной зависимости HC/AR" при 0 -" 0 (экстраполяция была произведена по.

13 углам), и угловой зависимости ЯС/М0 при С -> 0 (экстраполяция была произведена по 5−8 концентрациям). Значения радиуса вращения Rq были получены из угла наклона угловой зависимости ЯС/АЛ0 при С 0. Значения второго вириального коэффициента Арт. рг были получены из угла наклона угловой зависимости #С/Д/?0 ПрИ 0 0. Второй вириальный коэффициент характеризует термодинамическое сродство частиц комплексов Dpl2/PHK к раствору (буфер Т) (оно мало, если Арт. рг < 0, и, наоборот, оно велико, если Арт. рг > 0 и идеально, если Арг. рт = 0) [184], таким образом, показывая гидрофобность/гидрофильность поверхности комплексов.

Полученные значения Mw, Apt. pr и Rq являются средним по данным как минимум двух повторений каждого эксперимента. Ошибка эксперимента при определении Mw и Арг. рг была ± 10%. Ошибка в определении Rq была ± 5%.

Значения вклада показателя преломления для комплексов Dpl2/PHK (96, 668 нт) были определены при 37 °C и 635 нм с использованием дифференциального рефрактометра Shimadzu. Ошибка в экспериментах была равна ± 10%. Для комплексов Dpl2/PHK (96, 668 нт) эти величины были одинаковыми в пределах экспериментальной.

— 3 3 -1 ошибки в присутствии и, 96- и 668-мерных РНК: v = 0.32×10 м кг .

Значения гидродинамического радиуса Rh обоих комплексов при различных концентрациях были измерены в буфере Tris-HCl при рН 7.0 с помощью метода динамического светового рассеяния [185, 186]. Временная корреляционная функция интенсивности рассеяния была измерена при угле 90° на дине волны вертикально поляризованного света 633 пш с использованием прибора VA Instruments LS-01. Значения гидродинамического радиуса Rh полученных в данной работе являются средними из 10 повторов для каждого эксперимента. Ошибка в определении Rh была ± 10%. Для определения гидродинамического радиуса из временной корреляционной функции, была использована программа DYNALS Release 1.5, (VA Instruments).

Температура во всех экспериментах была равна 37 °C. 2.2.3. Получение РНК с помощью реакции транскрипции in vitro.

Синтез РНК in vitro с использованием ДНК-зависимой РНК-полимеразы фага Т7 проводили, как описано в работе [187]. В качестве ДНК-матриц использовали линеаризованные плазмиды pBluescriptMDR670, pHIV2 и dYF90.

2.2.3.1. Получение линейной формы плазмиды.

Для получения матрицы для транскрипции in vitro плазмиду линеаризовали эндонуклеазой рестрикции согласно протоколу, предлагаемому фирмой-изготовителем. Стандартную реакционную смесь объемом 400 мкл, содержащую 100 мкг ДНК, буфер В, 100 ед. акт. соответствующей эндонуклеазы рестрикции инкубировали при 37 °C в течение 2 — 4 ч до полного расщепления ДНК. Реакционную смесь последовательно экстрагировали два раза смесью фенол: хлороформ =1:1, затем хлороформом. ДНК осаждали этанолом в присутствии 0.3 М Na-ацетата, рН 5.2 при -20°С в течение 1 ч, отделяли центрифугированием (12 000 об/мин, 10 мин), осадок промывали 80%-ным этанолом, высушивали и растворяли в буфере ТЕ в концентрации 1 мкг/мкл.

Показать весь текст

Список литературы

Artificial Nucleases Ed. M. Zenkova in Nucleic Acids and Molecular Biology, 13, Springer-Verlag, 2004, pp. 292.
Oivanen M., Kuusela S., Lonnberg H. Kinetics and Mechanisms for the Cleavage and Isomerization of the Phosphodiester Bonds of RNA by Bronsted Acids and Bases // Chem. Rev. 1999 V. 98. P. 961−990.
Sakamoto S., Tamura Т., Furukawa Т., Komatsu Y., Ohtsuka E., Kitamura M., Inoue H. RNA cleavage efficiency and catalytic turnover of an oligonucleotide-two copper complexes conjugate //Nucleic Acids Res. Suppl. 2002. V. 2. P. 157−158.
Humphreys K. J., Karlin K. D., Rokita S. E., Targeted strand scission of DNA substrates by a tricopper (II) coordination complex //J. Am. Chem. Soc. 2002. V. 124. P. 6009−6019.
Yashiro M., Kawahara R. Molecular design of an acid-base cooperative catalyst for RNA cleavage based on a dizinc complex // J. Biol. Inorg. Chem. 2004. V. 9. P. 914−921.
Hertweck M., Mueller M. W. Mapping divalent metal ion binding sites in a group II intron by Mn (2+) — and Zn (2+)-induced site-specific RNA cleavage // Eur. J. Biochem. 2001. V. 268. P. 4610−4620.
Kazakov S., Altman S. Site-specific cleavage by metal ion cofactors and inhibitors of Ml RNA, the catalytic subunit of RNase P from Escherichia coli // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1991. V. 88. P. 9193−9197.
R Haefner, J. Hall, G. Rihs, Helv. Chem. Acta 1997, 80,487−494.
Komiyama M., Sumaoka J. Progress towards synthetic enzymes for phosphoester hydrolysis // Curr. Opin. Chem. Biol. 1998. V. 2. P. 751−757.
Ciesiolka J. in RNA biochemistry and biotechnology, (Eds.: J. Barciszewski, B.F.C. Clark), Kluwer, Dordrecht, 1999,111−121.
Brannvall M., MikkelsenN. E., Kirsebom L. A. Monitoring the structure of Escherichia coli RNase P RNA in the presence of various divalent metal ions // Nucleic Acids Res. 2001. V. 29. P. 1426−1432.
Bibillo A., Figlerowicz M., Kierzek R., The non-enzymatic hydrolysis of oligoribonucleotides VI. The role of biogenic polyamines // Nucleic Acids Res. 1999. V. 27. P. 3931−3937.
R. Kierzek Nonenzymatic cleavage of oligoribonucleotides I I Methods Enzymol. 2001. V. 341. P.657−675.
Brack A., Barbier В., Chemical activity of simple basic peptides // Orig. Life Evol. Biosph. 1990. V. 20. P. 139−144.
Barbier В., Brack A., Search for catalytic properties of simple polypeptides // J. Am. Chem. Soc. 1992. V. 114. P. 3511−3515.
Lima W. F., Crooke S. T. Highly efficient endonucleolytic cleavage of RNA by a Cys (2)His (2) zinc-finger peptide // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1999. V. 96. P. 10 010−10 015.
Lima W. F., Crooke S. T. Preparation and use of ZFY-6 zinc finger ribonuclease // Methods Enzymol. 2001. V. 341. P. 490−500.
Van Tol H., Gross H. J. Non-enzymatic excision of pre-tRNA introns? // EMBO J. 1989. V. 8. P. 293−300.
Riepe A., Beier H., Gross H. J. Enhancement of RNA self-cleavage by micellar catalysis // FEBS Lett. 1999. V. 457 P. 193−199.
Зенкова M. А., Чумакова H. JL, Власов А. В., Веньяминова А. Г., Комарова H. И., Власов В. В., Сильников В. Н. Синтетические конструкции функционально имитирующие рибонуклеазу А. // Молекуляр. Биология. 2000. Т. 34. С. 456−460.
Сильников В. Н., Власов В. В. Конструирование реагентов для направленного расщепления рибонуклеиновых кислот. Успехи химии. 2001. Т. 70. С. 562−580.
I.L. Kuznetsova, V.N. Sil’nikov in Artificial Nucleases (Ed.: M. Zenkova), Nucleic Acids and Molecular Biology, 13, Springer-Verlag, 2004,111−128.
Podyminogin M. A., Vlassov V. V., Giege R. Synthetic RNA-cleaving molecules mimicking ribonuclease A active center. Design and cleavage of tRNA transcripts // Nucleic Acids Res. 1993. V. 21. P. 5950−5956.
Silnikov V.N., Lukyanchuk N.P., Shishkin G.V., Giege R., Vlassov V.V. Imidazole compounds simulated active center of ribonuclease A. Synthesis and RNA cleaving activity // Dokl. Acad. Nauk. 1998. V. 360. P. 554−558.
Giege R., Felden В., Zenkova M. A., Sil’nikov V. N., Vlassov V. V. Cleavage of RNA with synthetic ribonuclease mimics // Methods Enzymol. 2000. V. 318. P. 147−165.
Zenkova M., Beloglazova N., Sil’nikov V., Vlassov V., Giege R. RNA cleavage by 1,4-diazabicyclo2.2.2.octane-imidazole conjugates // Methods Enzymol. 2001. V. 341. P. 468−490.
Beloglazova N. G., Silnikov V. N., Zenkova M. A., Vlassov V. V. Cleavage of yeast tRNAPhe with complementary oligonucleotide conjugated to a small ribonuclease mimic // FEBS Lett. 2000. V. 481. P. 277−280.
Zenkova M. A., Beloglazova N. G. Site-specific artificial ribonucleases: conjugates of oligonucleotides with catalytic groups in Artificial Nucleases (Ed.: M. Zenkova) Nucleic Acids and Molecular Biology, 13, Springer-Verlag, 2004,189−221.
Hosaka H., Sakabe I., Sakamoto K., Yokoyama S., Takaku H. Sequence-specific cleavage of oligoribonucleotide capable of forming a stem and loop structure // J. Biol. Chem. 1994. V. 269. P. 20 090−20 094.
Кантор Ч., ШиммельП. Биофизическая химия, М: Мир, 1982.
Rashid R., Aittaleb М., Chen Q., Spiegel К., Demeler В., Li H. Functional requirement for symmetric assembly of archaeal box C/D small ribonucleoprotein particles // J. Mol. Biol. 2003. V. 333. P. 295−306.
Recht M. I., Williamson J. R. Central domain assembly: thermodynamics and kinetics of S6 and SI 8 binding to an S15-RNA complex//J. Mol. Biol. 2001. V. 313. P. 35−48.
Wild K., Weichenrieder O., Strub K., Sinning I., Cusack S. Towards the structure of the mammalian signal recognition particle // Curr. Opin. Struct. Biol. 2002. V. 12. P. 72−81.
Audic Y., Hartley R. S. Post-transcriptional regulation in cancer // Biol. Cell. 2004. V. 96. P. 479−498.
Grundy F. J., Henkin, Т. M. Regulation of gene expression by effectors that bind to RNA // Curr. Opin. Microbiol. 2004. V. 7. P. 126−131.
Abelson J., Trotta C. R., Li H. tRNA splicing // J. Biol. Chem. 1998. V. 273. P. 1 268 512 688.
Ferre-D'Amare A. R. RNA-modifying enzymes // Curr. Opin. Struct. Biol. 2003. V. 13. P. 49−55.
Ibba M., Soil D. Quality control mechanisms during translation // Science. 1999. V. 286. P. 1893−1897.
Kuersten S., Goodwin E. B. The power of the 3' UTR: translational control and development // Nat. Rev. Genet. 2003. V. 4. P. 626−637.
Lai M. M. RNA-protein interactions in the regulation of coronavirus RNA replication and transcription // Biol. Chem. 1997. V. 378. P. 477−481.
Allers J., Shamoo Y. Structure-based analysis of protein-RNA interactions using the program ENTANGLE // J. Mol. Biol. 2001. V. 311. P. 75−86.
Jones S., Daley D. Т., Luscombe N. M., Berman H. M., Thornton J. M. Protein-RNA interactions: a structural analysis // Nucleic Acids Res. 2001. V. 29. P. 943−954.
Chen Y., Kortemme Т., Robertson Т., Baker D., Varani G. A new hydrogen-bonding potential for the design of protein-RNA interactions predicts specific contacts and discriminates decoys // Nucleic Acids Res. 2004. V. 32. P. 5147−5162.
Fauchere J., Pliska V. Hydrophobic parameters of amino acid side chains from the partitioning of N-acetyl anino acid amines // Eur. J. Med. Chem. 1983. V. 18. P. 369−375.
Ding J., Hayashi M. K., Zhang Y., Manche L., Krainer A. R., Xu R.-M. Crystal structure of the two-RRM domain of hnRNP A1 (UP1) complexed with single-stranded telomeric DNA // Genes & Dev. 1999. V. 13. P. 1102−1115.
Nagai К., Oubridge С., Ito N., Avis J., Evans P. The RNP domain: a sequence-specificRNA-binding domain involved in processing and transport of RNA // Trends Biochem. Sci. 1995. V.20. P. 235−240.
Varani G., Nagai K. RNA recognition by RNP proteins during RNA processing // Ann. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 1998. V. 27. P. 407−445.
Draper D.E. Themes in RNA-protein recognition // J. Mol. Biol. 1999. V. 293. P. 255−270.
Rubin G. M., et al. Comparative genomics of eukaryotes // Science. 2000. V. 287. P. 22 042 215.
Lewis H. A., Chen H., Edo C., Buckanovich R. J., Yang Y. Y., Musunuru K., Zhong R., Darnell R. В., Burley S. K. Crystal structures of nova-1 and nova-2 k-homology RNA-binding domains // Structure Fold Des. 1999. V. 7. P. 191−203.
Lewis H. A., Musunuru K., Jensen К. В., Edo C., Chen H., Darnell R. В., Burley S. K. Sequence-specific RNA binding by a Nova KH domain: implications for paraneoplastic disease and the fragile X syndrome // Cell. 2000. V. 100. P. 323−332.
St. Johnston D., Brown N. H., Gall J. G. Jantsch M. A conserved double-stranded RNA-binding domain // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1992.1. V. 89. P. 10 979−10 983.
Doyle M., Jantsch M. F. New and old roles of the double-stranded RNA-binding domain // J. Struct. Biol. 2002. V. 140. P. 147−153.
Birney E., Kumar S., Krainer A. R. Analysis of the RNA-recognition motif and RS and RGG domains: conservation in metazoan pre-mRNA splicing factors // Nucleic Acids Res. 1993. V.21. P.5803−5816.
Nagai K., Oubridge C., Jessen Т. H., Li J. and Evans P. R. Crystal structure of the RNA-binding domain of the U1 small nuclear ribonucleoprotein A // Nature. 1990. V. 348. P. 515−520.
Pinol-Roma S., Swanson M. S., Gall J. G., Dreyfuss G. A novel heterogeneous nuclear RNP protein with a unique distribution on nascent transcripts // J. Cell Biol. 1989. V. 109. P. 25 752 587.
Jessen Т. H., Oubridge С., Тео С. Н., Pritchard С., Nagai К. Identification of molecular contacts between the U1 A small nuclear ribonucleoprotein and U1 RNA // EMBO J. 1991. V. 10. P. 3447−3456.
Scherly D., Boelens W., Dathan N. A., van Venrooij W. J., Mattaj I. W. Major determinants of the specificity of interaction between small nuclear ribonucleoproteins U1A and U2B" and their cognate RNAs // Nature. 1990. V. 345. P. 502−506.
Harper D. S., Fresco L. D., Keene J. D. RNA binding specificity of a Drosophila snRNP protein that shares sequence homology with mammalian Ul-A and U2-B" proteins // Nucleic Acids Res. 1992. V. 20. P. 3645−3650.
Oubridge C., Ito N., Evans P. R., Тео С. H., Nagai K. Crystal structure at 1.92 A resolution of the RNA-binding domain of the U1A spliceosomal protein complexed with an RNA hairpin // Nature. 1994. V. 372. P. 432³⁸.
Guallar V., Kenneth W. Borrelli A binding mechanism in protein-nucleotide interactions: Implication for U1A RNA binding // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2005. V. 102. P. 3954−3959.
Katsamba P. S., Bayramyan M., Haworth I. S., Myszka D. G., Laird-Offringa I. A. Complex role of the Ь2-Ь3 loop in the interaction of U1A with U1 hairpin II RNA // J. Biol. Chem. 2002. V.277. P. 33 267−33 274.
Shiels J. C., Tuite J. В., Nolan S. J., Barenger A. M. Investigation of a conserved stacking interaction in target site recognition by U1A protein // Nucleic Acids Res. 2002. V. 30. P. 550 558.
LaBranche H., Dupuis S., Ben-David Y., Bani M.-R., Wellinger R. J., Chabot B. Telomere elongation by hnRNP A1 and a derivative that interacts with telomeric repeats and telomerase // Nat. Genet. 1998. V. 19. P. 199−202.
Tian В., Bevilacqua P. C., Diegelman-Parente A., Mathews M. B. The double-stranded RNA-binding motif: interference and much more // Mol. Cell. Biol. 2004. V. 5. P. 1013−1023.
Wu H., Henras A., Chanfreau G., Feigon J. Structural basis for recognition of the AGNN tetraloop RNA fold by the double-stranded RNA-binding domain of Rntlp RNase III // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2004. V. 101. P. 8307−8312.
Chanfreau G. Conservation of RNase III processing pathways and specificity in hemiascomycetes // Eukaryot. Cell. 2003. V. 2. P. 901−909.
Chanfreau C., Buckle M., Jacquier A. Recognition of a conserved class of RNA tetraloops by Saccharomyces cerevisiae RNase III // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2000. V. 97. P. 3142−3147.
Fierro-Monti I., Mathews M. B. Proteins binding to duplexed RNA: one motif, multiple functions // Trends Biochem. Sci. 2000. V. 25. P. 241−246.
Saunders L. R., Barber G. N. The dsRNA binding protein family: critical roles, diverse cellular functions // FASEB J. 2003. V. 17. P. 961−983.
Henras A. K., Sam M., Hiley S. L., Wu H., Hughes T. R., Feigon J., Chanfreau G. F. Biochemical and genomic analysis of substrate recognition by the double-stranded RNA binding domain of yeast RNase III // RNA. 2005. V. 11. P.1225−1237.
Bycroft M., Grunert S., Murzin A. G., Proctor M. St Johnston D. NMR solution structure of a dsRNA binding domain from Drosophila staufen protein reveals homology to the N-terminal domain of ribosomal protein S5 // EMBO J. 1995. V.14. P. 3563−3571.
Kim J. L., Burley S. K. 1.9 A resolution structure of TBP recognizing the minor groove of TATAAAAG //Nature Struct. Biol. 1994. V. 1. P. 638−653.
Burd C. G., Dreyfuss G. Conserved structures and diversity of functions of RNA-binding proteins // Science. 1994. V. 265. P. 615−621.
Siom H., Matunis M. J., Michael W. M., Dreyfuss G. The pre-mRNA binding К protein contains a novel evolutionarily conserved motif // Nucleic Acids Res. 1993. V. 21. P. 11 931 198.
Vernet C., Artzt K. STAR, a gene family involved in signal transduction and activation of RNA // Trends Genet. 1997. V. 13. P. 479−484.
Berglund J. A., Chua K., Abovich N., Reed R., Rosbash M. The splicing factor BBP interacts specifically with the pre-mRNA branchpoint sequence UACUAAC // Cell. 1997. V. 89. P. 781−787.
Buckanovich R. J., Darnell R. B. The neuronal RNA binding protein Nova-1 recognizes specific RNA targets in vitro and in vivo // Mol. Cell. Biol. 1997. V. 17. P. 3194−3201.
Jan E., Motzny С. К., Graves L. E., Goodwin E. B. The STAR protein, GLD-1, is a translational regulator of sexual identity in Caenorhabditis elegans II EMBO J. 1999. V. 18. P. 258−269.
Kanamori H., Dodson R. E., Shapiro D. J. In vitro genetic analysis of the RNA binding site of vigilin, a multi-KH-domain protein // Mol. Cell. Biol. 1998. V. 18. P. 3991−4003.
Berglund J. A., Chua K., Abovich N., Reed R., Rosbash M. The splicing factor BBP interacts specifically with the pre-mRNA branchpoint sequence UACUAAC // Cell. 1997. V. 89. P. 781 787.
Lewis H. A., Musunuru K., Jensen К. В., Edo C., Chen H., Darnell R. В., Burley S. K. Sequence-specific RNA binding by a Nova KH domain: implications for paraneoplastic disease and the fragile X syndrome // Cell. 2000. V. 100. P. 323−332.
Liu Z., Luyten I., Bottomley M. J., Messias A. C., Houngninou-Molango S., Sprangers R., Zanier K., Kramer A., Sattler M. Structural Basis for Recognition of the Intron Branch Site RNA by Splicing Factor 1 // Science. 2001. V. 294. P. 1098−1102.
Rain J. C., Rafi Z., Rhani Z., Legrain P., Kramer A. Conservation of functional domains involved in RNA binding and protein-protein interactions in human and Saccharomyces cerevisiae pre-mRNA splicing factor SF1 // RNA. 1998. V. 4. P. 551−565.
Ramakrishnan V., White S. W. The structure of ribosomal protein S5 reveals sites of interaction with 16S rRNA//Nature. 1992. V. 358. P. 768−771.
Gibson T. J., Thompson J. D., Heringa J. The KH domain occurs in a diverse set of RNA-binding proteins that include the antiterminator NusA and is probably involved in binding to nucleic acid // FEBS Lett. 1993. V. 324. P. 361−366.
Nakashima Т., Yao M., Kawamura S., Iwasaki K., Kimura M., Tanaka I. Ribosomal protein L5 has a highly twisted concave surface and flexible arms responsible for rRNA binding // RNA. 2001. V. 7. P. 692−701.
Iwasaki K., Kikukawa S., Kawamura S., Kouzuma Y., Tanaka I., Kimura M. On the interaction of ribosomal protein L5 with 5S rRNA // Biosci. Biotechnol. Biochem. 2002. V. 66. P. 103−109.
Stoldt M., Wohnert J., Ohlenschlager 0., Gorlach M., Brown L. R. The NMR structure of the 5 S rRNA E-domain-protein L25 complex shows preformed and induced recognition // EMBO J. 1999. V. 18. P. 6508−6521.
Woestenenk E. A., Gongadze G. M., Shcherbakov D. V., Rak A. V., Garber M. В., Hard Т., Berglund H. The solution structure of ribosomal protein LI 8 from Thermus thermophilus reveals a conserved RNA-binding fold // Biochem. J. 2002. V. 363. P. 553−561.
Scripture J. В., Huber P. W. Analysis of the binding of Xenopus ribosomal protein L5 to oocyte 5 S rRNA. The major determinants of recognition are located in helix Ill-loop С // J. Biol. Chem. 1995. V. 270. P. 27 358−27 365.
DiNitto J. P., Huber P. W. A role of aromatic amino acids in the binding of Xenopus ribosomal protein L5 to 5 S rRNA // Biochemistry. 2001. V. 40. P. 12 645−12 653.
Giege R., Sissler M., Florentz C. Universal rules and idiosyncratic features in tRNA identity //Nucleic Acids Res. 1998. V. 26. P. 5017−5035.
Huang L., Pookanjanatavip M., Gu X., Santi D. V. A conserved aspartate of tRNA pseudouridine synthase is essential for activity and a probable nucleophilic catalyst // Biochemistry. 1998. V. 37. P. 344−351.
Gu X., Yu M., Ivanetich К. M., Santi D. V. Molecular recognition of tRNA by tRNA pseudouridine 55 synthase//Biochemistry. 1998. V. 37. P. 339−343.
McClain W. H., Foss K. Nucleotides that contribute to the identity of Escherichia coli tRNAPhe //J. Mol. Biol. 1998. V. 202. P. 697−709.
Tinkle-Peterson E., Uhlenbeck О. C. Determination of recognition nucleotides for Escherichia coli phenylalanyl-tRNA synthetase // Biochemistry. 1992. V. 31. P. 10 380−10 389.
Sampson J. R., DiRenzo А. В., Behlen L. S., Uhlenbeck О. C. Role of tertiary nucleotides in the interaction of yeast phenylalanine tRNA with its cognate synthetase // Biochemistry. 1990. V. P. 2523−2532.
Sampson J. R., Behlen L. S., DiRenzo А. В., Uhlenbeck О. C. Recognition of yeast tRNAphe by its cognate yeast phenylalanyl-tRNA synthetase: an analysis of specificity // Biochemistry. 1992. V. 31. P. 4161−4167.
Moor N., Nazarenko I., Ankilova V., Khodyreva S., Lavrik 0. Determination of tRNAphe recognition nucleotides for phenylalanyl-tRNA synthetase from Thermus thermophilus II Biochimie. 1992. V. 74. P. 353−356.
Moor N., Ankilova V., Lavrik 0. Recognition of tRNAPhe by phenylalanyl-tRNA synthetase from Thermus thermophilus II Eur. J. Biochem. 1995. V. 234. P. 897−902.
Nazarenko I. A., Tinkle-Peterson E., Zakharova 0. D., Lavrik О. I., Uhlenbeck О. C. Recognition nucleotides for human phenylalanyl-tRNA synthetase // Nucleic Acids Res. 1992. V. 20. P. 475−478.
Lechler A., Kreutzer R. Domains of phenylalanyl-tRNA synthetase from Thermus thermophilus required for aminoacylation // FEBS Lett. 1997. V. 420. P. 139−142.
Goldgur Y., Mosyak L., Reshetnikova L., Ankilova V., Khodyreva S., Lavrik 0., Safro M. The crystal structure of phenylalanyl-tRNA synthetase from Thermus thermophilus complexed with cognate tRNAPhe // Structure. 1997. V. 5. P. 59−68.
Fishman R., Ankilova V., Moor N., Safro M. Crystal structure at 2.6 A resolution of phenylalanyl-tRNA synthetase complexed with phenylalanyl-adenylate in the presence of manganese // Acta Crystallogr. D. 2001. V. 57. 1534−1544.
Delagoutte В., Moras D., Cavarelli J. tRNA aminoacylation by arginyl-tRNA synthetase: induced conformations during substrates binding // EMBO J. 2000. V. 19. P. 5599−5610.
Logan D.T., Mazauric M.-H., Kern D., Moras D. Crystal structure of glycyl-tRNA synthetase from Thermus thermophilus II EMBO J. 1995. V. 14 P. 4156−4167.
Arnez J. G., Harris D. C., Mitschler A., Rees В., Francklynl C. S., Moras D. Crystal structure of histidyl-tRNA synthetase from Escherichia coli complexed with histidyl-adenylate // EMBO J. 1995. V. 14. P. 4143−4155.
Tharun S., He W., Mayers A. E., Lennertz P., Beggs J. D., Parker R. Yeast Sm-like proteins function in mRNA decapping and decay // Nature. 2000. V. 404. P. 515−518.
Seraphin B. Sm and Sm-like proteins belong to a large family: identification of proteins of the U6 as well as Ul, U2, U4 and U5 snRNPs // EMBO J. 1995. V. 14. P. 2089−2098.
Того I., Thore S., Mayer C., Basquin J., Seraphin В., Suck D. RNA binding in an Sm core domain: X-ray structure and functional analysis of an archaeal Sm protein complex // EMBO J. 2001. V. 20. P. 2293−2303.
Witherell G. W., Gott J. M., Uhlenbeck О. C. Specific interaction between RNA phage coat proteins and RNA // Progr. Nucl. Acids Res. Mol. Biol. 1991. V. 46. P. 185−220.
Valegard K., Murray J. В., Stockley P. G., Stonehouse N. J., Liljas L. Crystal structure of an RNA bacteriophage coat protein-operator complex // Nature. 1994. V. 371. P.623−626.
Peabody D. S. The RNA binding site of bacteriophage MS2 coat protein // EMBO J. 1993. V. 12. P. 595−600.
Stockley P. G., Stonehouse N. J., Walton C., Walters D. A., Medina G., Macedo J. M., Hill H. R., Goodman S. Т., Talbot S. J., Tewary H. K., et al. Molecular mechanism of RNA-phage morphogenesis //Biochem. Soc. Trans. 1993. V. 21. P. 627−633.
LeCuyer K. A., Behlen L. S., Uhlenbeck О. C. Mutagenesis of a stacking contact in the MS2 coat protein-RNA complex // EMBO J. 1996. V. 15. P.6847−6853.
Dever Т. E. Gene-specific regulation by general translation factors // Cell. 2002. V. 108 P. 545−556.
Shatkin A. J., Darzynkiewicz E., Furuichi Y., Kroath H., Morgan M. A., Tahara S. M., Yamakawa M. 5'-Terminal caps, cap-binding proteins and eukaryotic mRNA function // Biochem. Soc. Symp. 1982. V. 47. P. 129−143.
Raught В., Gingras A. C. eIF4E activity is regulated at multiple levels // Int. J. Biochem. Cell Biol. 1999. V. 31. P. 43−57.
Matsuo H., Li H., McGuire A. M., Fletcher С. M., Gingras A. C., Sonenberg N., Wagner G. Structure of translation factoreIF4E bound to m7GDP and interaction with 4E-binding protein // Nat. Struct. Biol. 1997. V. 4. P. 717−724.
Marcotrigiano J., Gingras A. C., Sonenberg N., Burley S.K. Cap-dependent translation initiation in eukaryotes is regulated by a molecular mimic of eIF4G // Mol. Cell. 1999. V. 3. P. 707−716.
Hodel A. E., Gershon P. D., Quiocho F.A. Structural basis for sequence-nonspecific recognition of 5'-capped mRNA by a cap-modifying enzyme // Mol. Cell. 1998. V. 1. P. 443 447.
Mazza C., Segref A., Mattaj I. W., Cusack S. Large-scale induced fit recognition of an m (7)GpppG cap analogue by the human nuclear cap-binding complex // EMBO J. 2002. V. 21. P. 5548−5557.
Calabro V., Daugherty M. D., Frankel A. D. A single intermolecular contact mediates intramolecular stabilization of both RNA and protein // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2005. V. 102. P.6849−6854.
Smith C. A., Calabro V., Frankel A. D. An RNA-binding chameleon // Mol. Cell. 2000. V. 6. P. 1067−1076.
Chen L., Frankel A. D. A peptide interaction in the major groove of RNA resembles protein interactions in the minor groove of DNA // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1995. V. 92. P. 50 775 081.
Hershey J. W., В., Merrick W. C. The pathway and mechanism of initiation of protein synthesis, in «Translational control of gene expression» (N. Sonenberg, ed.), p. 33. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 2000.
Hellen C. U. Т., Samow P. Internal ribosome entry sites in eukaryotic mRNA molecules. // Genes Dev. 2001. V. 15. P. 1593−1612.
Wilson J. E., Powell M. J., Hoover S. E., Sarnow P. Naturally occurring dicistronic cricket paralysis virus RNA is regulated by two internal ribosome entry sites // Mol. Cell. Biol. 2000. V. 20. P. 4990−4999.
Iizuka N., Chen C., Yang Q., Johannes G., Sarnow P. Capindependent translation and internal initiation of translation in eukaryotic cellular mRNA molecules // Curr. Top. Microbiol. Immunol. 1995. V. 203. P. 155−177.
Jackson R., Kaminski A. Internal initiation of translation in eukaryotes: the picornavirus paradigm and beyond // RNA. 1995. V. 1. P. 985−1000.
Ali N., Siddiqui A. Molecular mechanisms of translation initiation in eukaryotes // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1997. V. 94. P. 2249−2254.
Ali N., Prujin G. J. M., Kenan D. J., Keene J. D., Siddiqui A. Human La antigen is required for the hepatitis С virus internal ribosome entry site-mediated translation // J. Biol. Chem. 2000. V. 275. P. 27 531−27 540.
Uptain S. M., Kane С. M., Chamberlin M. J. Basic mechanisms of transcript elongation and its regulation // Annu. Rev. Biochem. 1997. V. 66. P. 117−172.
Weisberg R. A., Gottesman M. E. Processive antitermination // J. Bacterid. 1999. V. 181. P.359−367.
Jucker F. M., Heus H. A., Yip P. F., Moors E. H., Pardi A. A network of heterogeneous hydrogen bonds in GNRA tetraloops // J. Mol. Biol. 1996. V. 264. P. 968−980.
Xia Т., Wan C., Roberts R. W., Zewail A. H. RNA-protein recognition: Single-residue ultrafast dynamical control of structural specificity and function // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2005. V. 102. P. 13 013−13 018.
Olsnes S., Pihl A. Toxic lectins and related proteins, in «Molecular action of toxins and viruses» (Cohen P., Van Heynigen S., eds), p. 52. Elsevier Biomedical Press, New York, 1982.
Endo Y., Tsurugi K. RNA N-glycosidase activity of ricin A-chain. Mechanism of action of the toxin lectin ricin in eukaryotic ribosomes // J. Biol. Chem. 1987. V. 262, P. 8128−8130.
Schlossman D., Withers D., Welsh P., Alexander A., Robertas J, Frankel A. Role of glutamic acid 177 of the ricin toxin A chain in enzymatic inactivation of ribosomes // Mol. Cell.
Biol. 1989. V. 9. P. 5012−5021.
Frankel A., Welsh P., Richardson J., Robertas J. D. Role of arginine 180 and glutamic acid 177 of ricin toxin A chain in enzymatic inactivation of ribosomes // Mol. Cell. Biol. 1990. V. 10. P. 6257−6263.
Ready M. P., Kim Y., Robertas J. D. Site-directed mutagenesis of ricin A chain and implications for the mechanism of action // Proteins. 1991. V. 10. P. 270−278.
Monzingo A. F., Robertas J. D. X-ray analysis of substrate analogs in the ricin A-chain active site // J. Mol. Biol. 1992. V. 227. P. 1136−1145.
Callaghan A. J., Marcaida M. J., Stead J. A., McDowall K. J., Scott W. G., Luisi B. F. Structure of Escherichia coli RNase E catalytic domain and implications for RNA turnover // Nature. 2005. V. 437. P. 1187−1191
Wu H., Lima W. F., Crooke S. T. Investigating the structure of human RNase HI by site-directed mutagenesis // J. Biol. Chem. 2001. V. 276. P. 23 547−23 553.
Cerritelli S. M" Frolova E. G., Feng C., Grinberg A., Love P. E., Crouch R. J. Failure to produce mitochondrial DNA results in embryonic lethality in Rnasehl null mice // Mol. Cell. 2003. V. 11. P. 807−815.
Heinemann U., Saenger W. Specific protein-nucleic acid recognition in ribonuclease Tl-2'-guanylic acid complex: an X-ray study. //Nature. 1982. V. 299. P. 27−31.
Ami R., Heinemann U., Tokuoka R., Saenger W. Three-dimensional structure of the ribonuclease T1 2'-GMP complex at 1.9-A resolution. // J. Biol. Chem. 1988. V. 263. P. 1 535 815 368.
Koepke J., Maslowska M., Heinemann U., Saenger W. Three-dimensional structure of ribonuclease T1 complexed with guanylyl-2', 5'-guanosine at 1.8 A resolution. // J. Mol. Biol. 1989. V. 206. P. 475−488.
Ding J., Koellner G., Grunert H. P., Saenger W. Crystal structure of ribonuclease T1 complexed with adenosine 2-monophosphate at 1.8-A resolution. // J. Biol. Chem. 1991. V. 266. P. 15 128−15 134.
Loverix S., Winqvist A., Stromberg R., Steyaert J. Mechanism of RNase Tl: concerted triester-like phosphoryl transfer via a catalytic three-centered hydrogen bond. // Chem. Biol. 2000. V. 7. P. 651−658.
Zegers I., Loris R., Dehollander G., Fattah Haikal A., Poortmans F., Steyaert J., Wyns L. Hydrolysis of a slow cyclic thiophosphate substrate of RNase Tl- analyzed by time-resolved crystallography. //Nat. Struct. Biol. 1998. V. 5. P. 280−283.
Altman S., Kirsebom L., Talbot S. Recent studies of ribonuclease P // FASEB J. 1993. V. 7. P. 7−14.
Frank D. N., Pace N. R. Parity for mental health and substance abuse care under managed care // Annu. Rev. Biochem. 1998. V. 67. P. 153−180.
Cech T. R. The efficiency and versatility of catalytic RNA: implications for an RNA world //Gene. 1993. V. 135. P. 33−36.
Nitta I., Kamada Y., Noda H., Ueda Т., Watanabe K. Reconstitution of peptide bond formation with Escherichia coli 23 S ribosomal RNA domains // Science 1998. V. 281. P. 666 669.
Guerrier-Takada C., Altman S. Catalytic activity of an RNA molecule prepared by transcription in vitro II Science. 1984. V. 223. P. 285−286.
Kurz J. C., Niranjanakumari S., Fierke C. A. Protein component of Bacillus subtilis RNase P specifically enhances the affinity for precursor-tRNAAsp // Biochemistry. 1998. V. 37. P. 23 932 400.
Tallsjo A., Kirsebom L. A. Product release is a rate-limiting step during cleavage by the catalytic RNA subunit of Escherichia coli RNase P // Nucleic Acids Res. 1993. V. 21. P. 51−57.
Niranjanakumari S., Stams Т., Crary S. M., Christianson D. W., Fierke C. A. Protein component of the ribozyme ribonuclease P alters substrate recognition by directly contacting precursor tRNA // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.1998. V. 95. P. 15 212−15 217.
Jovanovic M., Sanchez R., Altman S., Gopalan V. Elucidation of structure-function relationships in the protein subunit of bacterial RNase P using a genetic complementation approach //Nucleic Acids Res. 2002. V. 30. P. 5065−5073.
Sharkady S. M., Nolan J. M. Bacterial ribonuclease P holoenzyme crosslinking analysis reveals protein interaction sites on the RNA subunit // Nucleic Acids Res. 2001. V. 29. P. 38 483 856.
Evans J. M., In «Light Scattering from Polymer Solutions» (Huglin M.B., ed.), p. 89. Academic Press, London, 1972.
Tanford C. Physical Chemistry of Macromolecules, Wiley, New York, 1961.
Burchard W. In Physical Techniques for the Study of Food Biopolymers, (Ross-Murphy, S. В., ed.), p. 151. Blackie, Glasgow, 1994.
Home, D.S. In New Physico-Chemical Techniques for the Characterization of Complex Food Systems, (Dickinson E., ed.), p. 240. Blackie, Glasgow, 1995.
Maniatis Т., Fritsch E. F., Sambrook J. Molecular cloning. A Laboratory Manual. Gold Spring Harbor Laboratory Press, 1989.
Silberklang M., Prochiantz A., Haenni A. L., Rajbhandary U. L. Studies on the sequence of the 3'-terminal region of turnip-yellow-mosaic-virus RNA // Eur. J. Biochem. 1977. V. 72. P. 465−478.
Koval’ov N., Kuznetsova I., Burakova E., Sil’nikov V., Zenkova M., Vlassov V. Ribonuclease activity of cationic structures conjugated to lipophilic groups // Nucleosides, Nucleotides and Nucleic acids. 2004. V. 32. P. 981−985.
Tabushu I., Imuta J.-I., Seko N., Kobuke Y. Highly Discriminative Binding of Nucleoside Phosphates by a Lipophilic diammonium Salt embedded in Bicyclic Skeleton // J. Am. Chem. Soc. 1978. V. 100.6287−6288
Ehresmann C., Baudin F., Mougel M., Romby P., Ebel J. P., Ehresmann B. Probing the structure of RNAs in solution //Nucleic Acids Res. 1987. V. 15. P. 9109−9128.
Morrow J. R. Hydrolytic cleavage of RNA catalyzed by metal ion complexes // Met. Ions Biol. Syst. 1996. V.33.P. 561−592.
Giege R., Felden В., Zenkova M. A., Sil’nikov V. N., Vlassov V. V. Cleavage of RNA with synthetic ribonuclease mimics // Methods Enzymol. 2000. V. 318. P. 147−165.
Zhong M., Kallenbach N. R. Mapping tRNA and 5S RNA tertiary structures by charge dependent Fe (II)-catalyzed cleavage // J. Biomol. Struct. Dyn. 1994. V. 11. P. 901−911.
Endo M., Hirata K., Inokawa Т., Matsumura K., Komiyama M., Ihara Т., Sueda S., Takagi M. Site-specific hydrolysis of yeast tRNAPhe by anthraquinone-glycine and anthraquinone-iminodiacetate conjugates //Nucleic Acids Symp. Ser. 1995.109−110.
Komiyama M., Inokawa T. Selective hydrolysis of tRNA by ethylenediamine bound to a DNA oligomer// J. Biochem. (Tokyo). 1994. V. 116. P. 719−720.
Komiyama M., Inokawa Т., Shiiba Т., Takeda N., Yoshinari K., Yashiro M. Molecular design of artificial hydrolytic nucleases and ribonucleases // Nucleic Acids Symp. Ser. 1993. N. 29. P. 197−198.
Guan L. L., Totsuka R., Kuwahara J., Otsuka M., Sugiura Y. Cleavage of yeast tRNA (phe) with Ni (III) and Co (III) complexes of bleomycin // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1993. V. 191. P. 1338−1346.
Huttenhofer A., Hudson S., Noller H. F., Mascharak P. K. Cleavage of tRNA by Fe (II)-bleomycin // J. Biol. Chem. 1992. V. 267. P. 24 471−24 475.
Katritzky A.R., Rao M.S.C., Stevens J. Compounds with Potential Second Order NonLinear Optical Activity // J. Heterocyclic Chem. 1991 V.28. P. 1115−1119.
Vlassov V. V., Zuber G., Felden В., Behr J. P., Giege R. Cleavage of tRNA with imidazole and spermine imidazole constructs: a new approach for probing RNA structure // Nucleic Acids Res. 1995. V. 23. P. 3161−3167.
Balasubramanian S., Pal S., Bagchi B. Evidence for bound and free water species in the hydration shell of an aqueous micelle // Cur. Science. 2003. V. 84. P. 428−430.
Rhodes M. M., Reblova K., Sponer J., Walter N. G. Trapped water molecules are essential to structural dynamics and function of a ribozyme // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2006. V. 103. P. 13 380−13 385.
Krasovska M. V., Sefcikova J., Reblova K., Schneider В., Walter N.G., Sponer J. Cations and hydration in catalytic RNA: molecular dynamics of the hepatitis delta virus ribozyme // Biophys. J. 2006. V. 91. P. 626−638.
Saenger W. Structure and dynamics of water surrounding biomolecules // Ann. Rev. Biophys. Biophys. Chem. 1987. V. 16. P. 93−114.
Barciszewski J., Jurczak J., Porowski S., Specht Т., Erdmann V.A. The role of water structure in conformational changes of nucleic acids in ambient and high-pressure conditions // Eur. J. Biochem. 1999. V. 260. P. 293−307.
Kierzek R. Hydrolysis of oligoribonucleotides: influence of sequence and length // Nucleic Acids Res. 1992. V. 20. P. 5073−5077.
Kierzek R. Nonenzymatic hydrolysis of oligoribonucleotides // Nucleic Acids Res. 1992. V. 20. P. 5079−5084.
Bibillo A., Figlerowicz M., Ziomek K., Kierzek R. The nonenzymatic hydrolysis of oligoribonucleotides. VII. Structural elements affecting hydrolysis // Nucleosides, Nucleotides, Nucleic Acids. 2000. V. 19. P. 977−994.
Collins K. D. Sticky ions in biological systems // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1995. V. 92. P. 5553−5557.
Collins K. D. Charge density-dependent strength of hydration and biological structure // Biophys. J. 1997. V. 72. P. 65−76.
Kalyuzhnyi Y. V., Vlachy V., Dill K. A. Hydration of simple ions. Effect of the charge density // Acta Chim. Slov. 2001. V. 48. P. 309−316.
Zhdan N. S., Kuznetsova I. L., Zenkova M. A., Vlassov A. V., Silnikov V. N., Giege R., Vlassov V. V. Synthesis and characterization of artificial ribonucleases // Nucleosides and Nucleotides. 1999. V. 18. P. 1491−1492.
Kaukinen U., Lyytikainen S., Mikkola S., Lonnberg H. The reactivity of phosphodiester bonds within linear single-stranded oligoribonucleotides is strongly dependent on the base sequence // Nucleic Acids Res. 2002. V. 30. P. 468−474.

Заполнить форму текущей работой