Аллельный полиморфизм и альтернативный сплайсинг в формировании полиморфности цитокиновой сети

Актуальность исследования.

Для современной иммунологии система цитокиновой регуляции является одним из активно исследуемых направлений, которое, несмотря на значительные успехи, до сих пор не раскрыто полностью. Повышенный интерес к цитокиновой сети определяется ее значимостью в обеспечении межклеточной передачи сигналов не только в пределах иммунной системы, но и в отношении самых разных клеток и систем организма. Причина неполной изученности определяется сложностью организации цитокиновой регуляторной сети и значительной плейотропностью эффектов, оказываемых цитокинами на разные типы клеток — мишеней [22]. И универсальность, и сложность организации системы цитокиновой регуляции являются следствием многообразия регуляторных белков и их эффектов. Полиморфность цитокиновой сети формируется различными путями и определяется на генетическом уровне и на уровне транскриптов. Одним из механизмов является генетический (аллельный) полиморфизм генов цитокинов и их рецепторов.

Обычно аллельные варианты генов цитокинов являются результатом мутаций в некодирующих областях генов и встречаются достаточно часто, при этом они могут иметь влияние на продукцию и функциональную активность белков цитокиновой сети. Это влияние может быть опосредовано через изменение функциональных сайтов, контролирующих транскрипцию, созревание и транспортировку соответствующих мРНК [63, 139]. Например, полиморфизм внутри 5' и 3' фланкирующих регуляторных районов или внутри интронов может влиять на уровни транскрипции и трансляции, стабильность РНК и механизмы сплайсинга пре-мРНК [144]. Многие из известных аллельных вариантов различаются по уровню экспрессии соответствующего гена, определяя тем самым уровень продукции цитокина и соответственно уровень его эффектов [63, 139]. В последнее время накапливается все больше данных, свидетельствующих о том, что аллельный полиморфизм генов цитокинов, вносит существенный вклад в экспрессию конечных продуктов самих белков, влияя тем самым и на процессы, которые регулируют эти медиаторы. Таким образом, формируется механизм, связывающий генетические варианты цитокинов с физиологическими и патологическими особенностями их продукции в норме и при различных заболеваниях и обосновывающий практическое использование цитокинов. С одной стороны это практическое использование выражается в разработке цитокиновых и антицитокиновых методов терапии иммунозависимых заболеваний, а с другой, в попытках использования генетического полиморфизма цитокинов «в качестве биомаркеров, ассоциированных с предрасположенностью или особенностями течения этих заболеваний. Следует сказать, что скорость «трансляции» молекулярно-биологических знаний в практическую медицину увеличивается с каждым годом, отражая явную тенденцию развития биомедицинских исследований и подходов к терапии с перспективой их слияния в единое направление, которое в настоящее время обозначается как «персонифицированная медицина». Следовательно, изучение влияния аллельного полиморфизма генов цитокинов на уровень продукции самих медиаторов и исследование эффективности антицитокиновой терапии в зависимости от аллельного полиморфизма генов цитокинов и их рецепторов представляются актуальными научными и практическими задачами, которые раскрывают механизмы одного из основных путей формирования полиморфности системы цитокинов. На роль второго основного пути формирования полиморфности системы цитокинов, как уже отмечалось, может в полной мере претендовать альтернативный сплайсинг транскриптов (премРНК). 8

Общее количество генов, обнаруженное в геноме человека, в процессе выполнения полногеномного секвенирования по разным подсчётам не превышает 30−40 тысяч, в то же время база экспрессирующихся последовательностей человека на порядок больше.

Причины этого многообразия кроются в посттранскрипционных событиях, наиболее значимое из которых — сплайсинг пре-мРНК.

Альтернативный сплайсинг пре-мРНК, благодаря комбинированию порядка и количества экзонов, наряду с альтернативной инициацией транскрипции и альтернативным полиаденилированием позволяет продуцировать различные зрелые транскрипты от одного единственного гена без изменения его геномной организации. Белки, образующиеся вследствие трансляции альтернативно сплайсированных мРНК, могут выполнять как сходные, так и различные функции. Сплайсинг транскриптов некоторых генов может происходить по-разному в зависимости от типа ткани, стадии развития организма, пола [23].

Альтернативный сплайсинг активно участвует в формировании полиморфизма системы цитокиновой регуляции, а изоформы белков цитокинов значительно расширяют регуляторные функции различных цитокинов, поскольку обладают свойствами отличными (или противоположными) от полноразмерных белков [273, 46, 295]. Этот факт может серьезно дополнить современное представление о цитокиновой регуляции гемо — и иммунопоэза, а также может дать в руки клинических иммунологов специфические биологические препараты с новыми свойствами [46]. Не смотря на достаточно активное исследование сплайс-вариантов цитокинов у человека, ряд вопросов остается не выясненным. В частности, на сегодня систематизированных данных по тканеспецифичности образования сплайс-форм транскриптов оказывается недостаточно, хотя они являются фактически единственным путём выяснить физиологическую роль изоформ этих медиаторов. А изучение тканеспецифического распределения различных изоформ 9 мРНК цитокинов в онтогенезе может во многом поменять наши взгляды на регуляцию иммунных и дифференцировочных процессов. Таким образом, изучение альтернативного сплайсинга и генетического полиморфизма цитокинов является актуальным фундаментальным и перспективным практическим направлением исследований.

Цель и задачи исследования

Цель работы: Охарактеризовать вклад аллельного полиморфизма и альтернативного сплайсинга в формирование структурного и функционального многообразия в системе цитокинов.

Задачи исследования

1. Изучить связь генетического полиморфизма с продукцией IL-1(3, IL-2, и TNF-a в норме.

2. Провести сравнительное исследование частот встречаемости аллелей и генотипов IL18, IL1B, IL2 в норме и при раке молочной железы у женщин.

3. Провести сравнительное исследование частот аллельных вариантов генов TNF и IL1 В в норме и при ревматоидном артрите и их ассоциации с эффективностью анти-TNF терапии инфликсимабом у больных ревматоидным артритом.

4. Изучить спектр изоформ мРНК гена IL4 и выполнить количественный анализ их уровня в фетальных тканях человека. Охарактеризовать эффекты внешних цитокиновых стимулов на формирование сплайс-форм мРНК IL-4 в мононуклеарных клетках периферической крови человека in vitro.

5. Изучить тканеспецифичность образования сплайс-вариантов мРНК гена IL6 в фетальных тканях человека и их спектр в мононуклеарных клетках человека in vitro.

6. Изучить сплайс-варианты мРНК генов LIF и SCF в фетальных тканях и в мононуклеарных клетках человека на разных стадиях онтогенеза.

Научная новизна работы

Впервые получены данные о взаимосвязи аллельных вариантов гена TNF в позициях -238G>A и -8570Т с уровнем его спонтанной и стимулированной Кон, А продукции МНК ПК условно здоровых доноров.

Впервые выявлено сочетание генотипов -238GG/-308GG/-857CC/-1031NC, носители которого, среди условно здоровых доноров, характеризуются наименьшей продукцией TNF-a как интактными, так и митоген-стимулированными мононуклеарными клетками в культуре при сравнении с группой носителей остальных генотипов.

Впервые получены данные по ассоциации аллельных вариантов генов TNF в позиции -8570Т и IL1B в позиции -31 Т>С с эффективностью антицитокиновой терапии инфликсимабом у больных ревматоидным артритом. Показано, что генотип СС и аллель С полиморфизма промотора гена TNF в позиции -8570Т чаще представлены у больных с неэффективной терапией. Установлено, что генотип -31 TT гена IL1B чаще встречается у больных с эффективной терапией.

В результате исследования генетического полиморфизма цитокинов IL-l? (+39 540Т) и IL-18 (-137G>C и -6070А) впервые установлена их ассоциация с предрасположенностью к развитию рака молочной железы в исследованной популяции жительниц Юго-Западной Сибири.

Впервые продемонстрирована экспрессия мРНК IL-4alt3 и мРНК IL-68 254 в мононуклерных клетках человека. Экспрессия изоформ мРНК IL-4 и IL-6 в фетальных тканях человека имеет тканеспецифический характер.

Впервые исследована экспрессия сплайс-вариантов мРНК генов SCF и LIF в фетальных тканях человека и выявлена ее тканеспецифичность. Кроме того показано, что спектр и частота выявления сплайс-вариантов мРНК генов SCF и LIF в мононуклеарных клетках максимальны в период внутриутробного развития и в период новорожденности осуществляя вклад в реализацию системных эффектов этих ростовых факторов на разных стадиях онтогенеза.

Теоретическая и практическая значимость работы.

Получены данные о влиянии аллельного полиморфизма промотора гена TNF в позициях -238 и -857 на уровень продукции конечного белка мононуклеарными клетками, что является одной из причин индивидуальных различий в выраженности иммунных реакций, регулируемых данным медиатором, у носителей этих генотипов в норме и может являться одним из молекулярных механизмов их участия в патологических процессах. Выявлено изменение частоты встречаемости этих аллельных вариантов гена TNF у больных РА, по сравнению с группой популяционного контроля, что может являться маркером предрасположенности к указанному заболеванию. Установлено, что эффективность терапии инфликсимабом зависит от аллельного полиморфизма генов TNF и 1Ь1 В, локализованнных соответственно в позициях -857 и -31, что определяет перспективность их исследования в качестве биологических маркеров при разработке комплексных критериев прогноза эффективности терапии инфликсимабом у конкретного пациента. Получено положительное решение по заявке на изобретение № 2 011 128 114 «Способ прогнозирования эффективности лечения ревматоидного артрита моноклональными антителами к ФНО-а на основе аллельного полиморфизма промотора гена ФНО».

Результаты сравнительного исследования полиморфизма генов цитокинов в норме и при раке молочной железы обосновывают использование полиморфизмов генов 1ЫВ и 1Ы8 в качестве биологических маркеров при разработке комплексных критериев прогноза риска развития рака молочной железы, а также особенностей его течения у жительниц Западносибирского региона.

Исследование сплайс-вариантов мРНК показало, что экспрессия генов 1Ь-4, 1Ь-6, БСБ и ЬШ в клетках человека происходит с участием альтернативного сплайсинга и может изменяться под действием внешних сигналов, в том числе цитокиновых. Для всех исследованных цитокинов наблюдается тканеспецифическая экспрессия изоформ, которая имеет качественные и количественные различия. В частности в период фетального развития человека, установлено, что экспрессия изоформ мРНК БСР и ЬШ может быть доминантной и имеет значение для тканеспецифической регуляции и для онтогенеза тканей. Факт экспрессии генов цитокинов в виде нескольких форм существенно дополняет и органично вписывается в понимание функционирования иммунной системы. Полученные данные свидетельствуют о возможности непосредственного участия изоформ цитокинов в иммунном ответе. Выяснение спектра экспрессирующихся изоформ цитокинов в различных тканях может быть полезным для определения их роли в норме и патологии.

Результаты исследования раскрывают значимость генетического полиморфизма и альтернативного сплайсинга транскриптов в формировании общей полиморфности цитокиновой регуляторной сети.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Аллельные варианты генов цитокинов, ассоциированные с изменением уровня продукции конечного белка, могут являться патогенетическим фактором ревматоидного артрита и рака молочной железы.

2. Эффективность терапии ревматоидного артрита моноклональными антителами против TNF-a связана с аллельным полиморфизмом в позиции -857 промотора гена TNF.

3. Спектр, баланс и уровень сплайс-вариантов мРНК цитокинов в фетальных тканях человека и в мононуклеарных клетках периферической крови характеризуется тканеспецифичностью и может изменяться под действием внешних сигналов, например при стимуляции клеток митогенами или другими цитокинами.

4. Аллельный полиморфизм и альтернативный сплайсинг являются молекулярными механизмами обеспечивающими формирование количественного уровня и качественного состава белков цитокиновой сети.

Апробация материалов диссертации (устные доклады).

Материалы диссертации доложены и обсуждены на: 1) Международной научно-практической школе-конференции «Цитокины. Воспаление. Иммунитет», (Новосибирск, 2002 г.,) 2) 6-й отчетной конференции ГУ НИИКИ СО РАМН (Новосибирск, 2003 г.), 3) 7-ом Всероссийском научном форуме с международным участием имени академика В. И. Иоффе «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге» (Санкт-Петербург, 2003 г.), 4) 8-ом всероссийского научном форуме с международным участием имени В. И. Иоффе «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге» (Санкт-Петербург, 2004 г.), 5) 12-ом всероссийском научном форуме с международным участием имени В. И. Иоффе «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге» (Санкт-Петербург, 2008 г.), 6) Всероссийской научной конференции «Молекулярно-генетичекие основы функционирования цитокиновой сети в норме и при патологии» (Новосибирск, 2010 г.), 7) международном конгрессе ЕиЪАЯ 2010 (Италия, Рим, 2010), 8)8-й отчетной научной конференции НИИКИ СО РАМН (2011г.), 9) международном конгрессе ЕЦЪАК 2012 (Германия, Берлин, 2012). 10) Расширенном семинаре ФГБУ «НИИКИ» СО РАМН (Заседании проблемной комиссия № 55.07 «Иммунология») 20 сентября 2012 г.

Публикации.

По теме диссертации опубликовано 24 научных работы, в том числе 10 статей в журналах, рекомендованных ВАК для публикации материалов диссертационных работ. Получено положительное решение о выдаче патента на изобретение «Способ прогнозирования эффективности лечения ревматоидного артрита моноклональными антителами к ФНО-а на основе аллельного полиморфизма промотора гена ФНО» № 2 011 128 114 от 20.01.2013, Бюл. № 2.

Структура и объем диссертации

.

Диссертация изложена на 224 страницах машинописного текста, состоит из обзора литературы, описание материалов и методов исследования, результатов собственных исследований, обсуждения, заключения и выводов. Библиографический указатель включает 300 источников, из них 270 зарубежных. Работа иллюстрирована 13 рисунками и 36 таблицами.

Личный вклад автора в проведение исследования

Результаты, представленные в данной работе, получены лично автором, а также в сотрудничестве с В. А. Садовской, О. П. Яценко, Е. П. Горевой, Н. С. Шкаруба. Исследование выполнено на базе лаборатории молекулярной иммунологии ФГБУ «НИИКИ» СО РАМН.

Секвенирование неизвестных последовательностей полученных фрагментов ДНК было осуществлено сотрудниками ИХБФМ СО РАН.

Автор выражает благодарность сотрудникам лаборатории клеточных биотехнологий ФГБУ «НИИКИ» СО РАМН за любезно предоставленные для исследований образцы фетальных тканей человека (руководитель лаборатории д.м.н. Селедцова Г. В.).

Большую признательность автор выражает научному консультанту работы профессору, д.м.н. C.B. Сенникову за конструктивные предложения по содержанию работы и подробное обсуждение полученных результатов, а также всем сотрудникам лаборатории молекулярной иммунологии ФГБУ «НИИКИ» СО РАМН за благожелательное отношение в ходе выполнения работы.

выводы

1. Формирование полиморфности цитокиновой сети происходит с участием аллельных вариантов генов цитокинов, о чем свидетельствуют результаты исследования их ассоциации с уровнем продукции конечных белков и развитием заболеваний, а также с участием альтенативного сплайсинга, что подтверждается тканеспецифичностью экспрессии сплайс-форм мРНК ряда цитокинов и изменением их спектра в онтогенезе и под действием внешних факторов.

2. Аллельный полиморфизм промотора гена TNF в позициях -238 и -857 является функционально значимым. У условно здоровых доноров носителей генотипа -857СС снижена КонА-стимулированная продукция TNF-a в культурах МНК ПК, а у носителей генотипа -238GG снижена спонтанная продукция и повышен индекс стимуляции, по сравнению с носителями альтернативных аллельных вариантов.

3. Показано, что среди условно здоровых доноров носители сочетания генотипов гена TNF -238GG/-308GG/-857CC/-103 INC, характеризуются статистически значимо наименьшей спонтанной и митоген-стимулированной продукцией TNF-a, а носители сочетания -31ТТ/+3954СТ гена IL1B демонстрировали сниженную стимуляцию митогеном КонА продукции IL-l? в сравнении с носителями сочетания -31ТС/+3954СТ. Это указывает на участие аллельного полиморфизма генов в формировании индивидуальных особенностей уровня продукции цитокинов.

4. Аллельные варианты цитокинов IL-l? и IL-18 имеют значимую ассоциацию с предрасположенностью к развитию рака молочной железы и особенности распределения частот генотипов в группах больных, различающихся по типу выявленного рака и характеру роста опухоли, что свидетельствует о прогностической значимости аллельных вариантов IL1B +3954, IL18 -137 и IL18 -607 при раке молочной железы в исследованной популяции жительниц Юго-Западной Сибири.

5. Повышение частоты генотипа GG и аллеля G в позиции -238 и снижение частоты аллеля С в позиции -857 промотора гена TNF у больных ревматоидным артритом, по сравнению с группой популяционного контроля, указывает на ассоциированность этих аллельных вариантов промотора гена TNF с заболеванием.

6. Генотип СС и аллель С в позиции -857 промотора гена TNF чаще представлены у больных с неэффективной терапией инфликсимабом, а генотип -31 TT гена IL1B чаще встречается у больных с эффективной терапией инфликсимабом, что свидетельствует о влиянии генетического фактора на эффективность данного метода терапии.

7. В фетальных тканях человека альтернативный сплайсинг мРНК генов IL4 и IL6 такнеспецифичен. Экспрессия сплайс-вариантов мРНК: IL-4 и IL-452- IL-6, IL-652 и-IL-68 254 имеет качественные и количественные отличия в разных типах тканей.

8. В мононуклеарных клетках, культивированных в присутствии rhIL-18 была обнаружена не описанная ранее у человека

179 изоформа мРНК интерлейкина-4 со сплайсированным третьим экзоном — 1Ь-4аН-3, что свидетельствует об изменении сплайсинга транскриптов гена 1Ь4 под действием внешних сигналов.

В интактных мононуклеарных клетках человека обнаружены сплайс-варианты мРНК: 1Ь-6, 1Ь-652 и 1Ь-68 284. В процессе культивирования клеток происходит изменение спектра сплайс-вариантов мРНК, изоформа 1Ь-68 284 исчезает, указывая на зависимость сплайсинга от микроокружения клеток.

Неоднородность экспрессии сплайс-форм как в пределах одной ткани разных индивидов, так и в разных тканях одного организма отражает тканеспецифический характер регуляции альтернативного сплайсинга транскриптов ЬШ и ЭСБ в фетальных тканях человека. В мононуклеарных клетках крови человека разнообразие сплайс-форм мРНК и уровень экспрессии генов ЬШ и БСР снижается при переходе от пренатального в постнатальный период развития, что отражает снижение системных эффектов этих цитокинов во взрослом организме.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В результате проведения исследований продемонстрирована связь уровня продукции ТЫБ-а МНК ПК с генотипами промотора гена ГМ Так носители генотипа -23 800 характеризовались относительно низкой спонтанной продукцией ТЫБ-а в культурах МНК ПК в сравнении с гетерозиготами -238СА, в тоже время стимуляция клеток митогеном КонА вызывала у носителей генотипа -23 800 более выраженное усиление продукции этого цитокина. Носители генотипа -857СС характеризовались более низкой продукцией ТЫБ-а в культурах МНК при обработке клеток КонА в сравнении с носителями альтернативного аллеля. Кроме того, было выявлено, что носители сочетания генотипов -23 800/-30 800/-857СС/-103ШС, характеризуются наименьшей продукцией ТЫТ-а как интактными, так и стимулированными КонА и ЛПС мононуклеарными клетками в культуре при сравнении с носителями остальных генотипов. Также комбинация генотипов гена 1Ь1 В -31ТТ/+3954СТ характеризуется сниженной КонАстимулированной продукцией 1Ь-1(3 в сравнении с сочетанием -31ТС/+3954СТ. Полученные результаты свидетельствуют о наличии связи полиморфизма генов цитокинов с уровнем" продукции конечного белка.

Учитывая полученные данные, о различии уровня продукции цитокинов у носителей разных аллельных вариантов их генов, можно предположить, что генетический полиморфизм является одним из факторов предрасположенности к развитию заболеваний. Мы провели проверку этого предположения для таких патологий как рак молочной железы и ревматоидный артрит.

Исследование частот аллелей и генотипов 1Ь1 В при РМЖ, показало статистически значимое увеличение гомозигот +3954ТТ в 2,5

171 раза в подгруппе больных РМЖ с дольковой формой рака по сравнению с контрольной группой и в 3 раза по сравнению с подгруппой больных РМЖ с протоковой формой рака. Для гена IL2 выявлно наличие минорной ассоциации полиморфизма +114G>T, в группе РМЖ наблюдался повышенный уровень гетерозиготного носительства в сравнении с популяционным контролем. Исследование полиморфизма промотора гена IL 18 выявило ассоциацию гомозигот GG и СС в позиции -137 с предрасположенностью к раку молочной железы. По однонуклеотидному полиморфизму -607С>А выявлено достоверное увеличение гомозигот СС, снижение гомозигот АА и частоты минорного аллеля, А у больных РМЖ по сравнению с контролем. А также у больных РМЖ с дольковой формой рака показано статистически достоверное увеличение частоты гетерозигот -607СА в 1,5 раза по сравнению с подгруппой больных РМЖ с протоковой формой рака. Тем самым было показано наличие ассоциации генетического полиморфизма исследованных цитокинов с предрасположенностью к развитию РМЖ и формой выявляемого рака.

В исследовании у больных РА показано изменение частоты встречаемости генотипов промотора гена TNF, а именно, достоверно чаще встречается генотип -238GG (характеризующийся сниженной спонтанной продукцией TNF-a в культурах МНК ПК в сравнении с гетерозиготами -238GA, но более выраженным усилением продукции этого цитокина в ответ на стимуляцию митогеном КонА) и аллель G в позиции -238G>A промотора гена TNF. Было показано, что аллель С в позиции -857С>Т промотора гена TNF встречается в группе больных РА статистически значимо реже в сравнении с группой популяционного контроля, отметим, что в норме гомозиготные носители этого аллеля (-857СС) характеризовались пониженным уровнем продукции TNF-a в культурах МНК ПК при обработке клеток митогеном КонА в сравнении с носителями альтернативного аллеля. Важно отметить, что распределение частот генотипов полиморфизма -8570Т в группе больных ревматоидным артритом имело отклонение от ожидаемого в соответствии с равновесием Харди-Вайнберга, что свидетельствует о наличии факторов, влияющих на частоту аллелей и генотипов в группе больных. Таким образом, можно заключить, что среди больных РА, достоверно чаще встречаются индивиды, имеющие генетическую предрасположенность к повышенному стимулированному уровню продукции TNF-a, а для индуцибельных цитокинов, к которым относится TNF-a, особое значение имеет именно уровень стимулированной продукции, что согласуется с современными представлениями о патогенезе этого заболевания и о роли TNF-a в его развитии.

В связи с активной разработкой и применением в современной терапии «биологических терапевтических агентов», в том числе рекомбинантных белков и блокирующих моноклональных антител, одной из актуальных научных и практических задач является поиск подходов для индивидуального прогноза эффективности применения цитокиновых и антицитокиновых стратегий терапии. В этой связи вполне логичным кажется исследование и всесторонняя, в том числе генетическая, характеристика мишени антицитокиновой терапии с целью выявления потенциальных маркеров пригодных для подобного прогноза. В проведенном исследовании попытка решения такой задачи предпринята в отношении анти-ФНО терапии ревматоидного артрита, одной из причин неэффективности которой может быть различный уровень TNF-a у больных РА, и как следствие, превалирование в патогенезе этого заболевания другого цитокина. В ходе работы, получены данные, что аллель С и гомозиготый по этому аллелю генотип промотора гена TNF в позиции -8570Т, ассоциированный с пониженным уровнем стимулированной КонА продукции TNF-a, чаще представлен у больных с неэффективной терапией инфликсимабом. Кроме того, установлено, что генотип -31 TT гена IL1B чаще встречается у больных с эффективной терапией, что может косвенно свидетельствовать о роли этого цитокина в развитии заболевания.

Таким образом, аллельный полиморфизм гена TNF в позиции -857 влияет на уровень продукции конечного медиатора мононуклеарными клетками и может являться одним из факторов ассоциированности с РА и с эффективностью применения терапии блокаторами TNF-a (в частности инфликсимаба) у пациентов с этим заболеванием. Следовательно, полиморфизм -857С>Т промотора гена TNF может рассматриваться в качестве потенциального молекулярного маркера неэффективной терапии ревматоидного артрита анти-TNF-a антителами. Также в качестве генетического маркера может служить полиморфизм гена IL1B в позиции -31, так как показана ассоциация генотипа -31 TT с эффективной терапией ингибиторами TNF-a (в частности инфликсимабом).

Блок исследований, связанный с генетическим полимрфизмом, позволил проиллюстрировать его влияние на уровень продукции цитокинов или количественное разнообразие в цитокиновой сети. Качественное разнообразие, формирующее полиморфность на структурном уровне, было исследовано нами во втором блоке, посвященном изучению альтернативно-сплайсированных вариантов мРНК цитокинов.

Результаты исследований сплайс-вариантов мРНК позволяют сказать, что в фетальных тканях человека экспрессия гена IL4 происходит с участием альтернативного сплайсинга и имеет тканеспецифический характер, поскольку в некоторых тканях обнаруживался только полноразмерный вариант (в образцах тканей сердечной мышцы и лёгкого), в других — только альтернативный (IL-482 В образцах тканей ребра и скелетной мышцы), в третьей группе (образцы тканей яичника и мозга) — оба сплайс-варианта. Кроме того, в фетальных тканях, имеющих непосредственное отношение к гемопоэзу и иммунопоэзу показано, что экспрессия полноразмерного варианта в тимусе в среднем на 1−2 порядка выше, чем в печени и селезёнке. Количественный анализ мРНК IL-452 показал, что в печени его в среднем в 2−5 раз больше чем в селезёнке или тимусе. Эти данные позволяют говорить о тканеспецифической регуляции альтернативного сплайсинга гена IL-4 и предполагать о возможном регуляторном влиянии этих изоформ, учитывая тот факт, что их биологические эффекты на функциональную активность клеток могут носить различный характер. Также представляют определенный интерес и обнаруженные факты, что в интактных мононуклеарных клетках и клетках культивированных в присутствии rhIL-18 был обнаружен дополнительный фрагмент кДНК соответствующий не описанной ранее у человека изоформы матричной РНК интерлейкина-4 со сплайсированным третьим экзоном IL-4alt3. Эти данные говорят, что иммунорегуляторные молекулы (в частности IL-18) могут влиять на альтернативный сплайсинг этого гена в клетках.

Для гена IL6 человека также получен ряд интересных данных, говорящих в пользу возможного участия изоформ этого гена в регуляции. В частности показано, что в фетальных тканях человека экспрессия гена интерлейкина-6 происходит с участием альтернативного сплайсинга с образованием сплайс вариантов мРНК уровень экспрессии, которых имеет качественные и количественные отличия. Кроме того, в мононуклеарных клетках человека были обнаружены мРНК IL-6, мРНК IL-682 и мРНК IL-68 284, ранее обнаруживаемая только в клетках ткани легкого и фибробластах. В процессе культивирования МНК ПК человека происходит изменение спектра экспрессируемых сплайс-вариантов мРНК интерлейкина-6: изоформа мРНК 1Ь-68 284 исчезает.

В отношении цитокинов 8СР и ЫР, относящихся к факторам роста, выполняющим важную роль в регуляции эмбриональных стволовых клеток и низкодифференцированных клеток иммунной системы также получены данные демонстрирующие, что сплайсинг их транскриптов на разных этапах онтогенеза носит тканеспецифический характер. Показана избирательная экспрессия сплайс-форм мРНК ЬШ в зависимости от типа фетальных тканей человека, при этом типы преобладающей изоформы в тканях мозга, печени, тимуса и селезенки отличаются, что указывает на различные биологические функции изоформ ЫР. Неоднородность экспрессии сплайс-форм как в пределах одной ткани разных индивидов, так и в разных тканях одного организма отражает тканеспецифический характер регуляции альтернативного сплайсинга транскриптов БСР в фетальных тканях человека. В мононуклеарных клетках крови человека разнообразие сплайс-форм мРНК и уровень экспрессии генов 8СР и ПР снижается при переходе от пренатального в постнатальный период развития, что отражает снижение системных эффектов этих цитокина во взрослом организме.

Исходя из полученных данных, что экспрессия генов ряда цитокинов у человека происходит участием альтернативного сплайсинга, качественно и количественно различается в разных тканях, можно говорить о тканеспецифической регуляции альтернативного сплайсинга транскриптов этих генов и о возможных тканеспецифических эффектах изоформ цитокинов, имеющих важное значение в онтогенетическом становлении иммунной системы и других систем в организме.

Обобщая оба блока исследований можно говорить, что аллельный полиморфизм генов и альтернативный сплайсинг транскриптов цитокинов являются двумя весьма важными факторами, которые формируют сруктурное и функциональное многообразие в системе цитокиновой регуляции. В частности, генетический полиморфизм оказывает преимущественное влияние на количественный (уровень цитокинов), а альтернативный сплайсинг преимущественно на качественный (спектр цитокинов) уровни формирования полиморфности в регуляторной цитокиновой сети.