Механизмы гибели клеток при действии новых производных нафтоиндолдионов

Актуальность проблемы.

Антрациклины и близкие по структуре соединения — ведущий класс современных противоопухолевых препаратов. Антрацпклиновые антибиотики даунорубицин и доксорубицин широко применяются в современной химиотерапии опухолевых заболеваний человека. Однако антрациклины имеют ряд недостатков, основным из которых является кардиотоксичность. Кроме того, антрациклиновые антибиотики обладают высокой кумулятивной токсичностью, мутагенностью, канцерогенностью, миелои иммунодепрессивным действием [71, 89]. Так, оригинальный антибиотик антрациклиновой группы — карминомицин, структурно схожий с доксорубицином, открыт в НИИ по изысканию новых антибиотиков АМН СССР и внедрен в практику отечественного здравоохранения. Карминомицин проявил высокую эффективность как препарат для лечения сарком мягких тканей и лейкозов. Его отличает от других производных антрациклинов меньшая кардиотоксичность, способность тормозить рост опухолей, устойчивых к доксорубицину и возможность перорального применения благодаря всасыванию в желудочно-кишечном тракте. Указанный пример подтверждает, что химическая модификация антрациклиновых антибиотиков, направленная на поиск препаратов с улучшенными химиотерапевтическими свойствами, главным образом, активных для опухолевых клеток с множественной лекарственной устойчивостью, является актуальной задачей онкологии [34, 89, 99].

Антрациклиновые препараты обладают множественным действием. Антрахиноны и их синтетические аналоги (аминоэтиламинантрахиноны) обладают способностью интеркалировать с ДНК, таким образом вмешиваясь в репликацию и транскрипцию. [9496]. Антрациклины также способны ингибировать топоизомеразу II. Присутствие индольного компонента в молекуле может снизить образование семихинонов и свободных радикалов, определяющих кумулятивную кардиотоксичность антрациклинов.

Антрациклиновые антибиотики, особенно доксорубицин, широко используются в клинике, однако их использование ограничено кардиотоксичностью и образованием множественной лекарственной устойчивости опухолей. С целью преодоление МЛУ были синтезированы антрациклиновые препараты нового поколения — производные нафто-[2,3-У]индол-5,10-диона, обладающие повышенной активностью против клеток с МЛУ. Они не являются субстратом для Pgp-опосредованного транспорта и, в то же время, способны запускать р53-независимые механизмы клеточной гибели и взаимодействовать с ДНК-зависимыми ферментами, топоизомеразами и теломеразой[95, 96].

Целью разработки синтетических аналогов антрациклинов является получение препаратов со сниженной органной токсичностью и сохранением цитотоксичности, сравнимой с цитотоксичностью митоксантрона и аминантрона — представителей много обещающего класса противоопухолевых препаратов, производных антрацен-5,10-дионов. Аминантрон не является источником свободных радикалов и даже обладает некторой антиоксидантной активностью. Отдельные гетероциклические аналоги аминоалкиламиноантрахинонов, такие как аналог аминантрона пиксантрон, пиразолантроны и пиразолакрадины, показывают высокую противоопухолевую активность при практически нулевой кардиотоксичности [94].

МЛУ часто является причиной неудач в терапии антрациклинами, но это явление прямо связано с химической структурой антрациклинов [34, 96, 99]. Во-первых, эти соединения могут выводиться из клетки молекулярными транспортерами (например, Pgp). Во-вторых, антрациклиновые кольца интеркалируют с ДНК, запуская клеточный ответ на повреждение ДНК, в котором р53 является основным регулятором. Гиперэкспрессия Pgp и утрата белком р53 проапоптотических функций — основные причины устойчивости опухолевых клеток к антрациклинам. Таким образом, оптимизация химической структуры препаратов предполагает, что синтетические аналоги антрациклинов нового поколения должны быть о неподходящим субстратом для выведения при помощи Pgp, и в то же время должны запускать р53-независимые пути апоптоза. Последнее можно воплотить за счет способности антрациклинов взаимодействовать с ДНК-зависимыми ферментами, такими, как топоизомеразы и теломераза [95, 96].

Некоторые производные нафто[2,3-/]индол-5,10-дионов показали заметную цитотоксичность в отношении культур клеток рака человека и большую, чем у доксорубицина и митоксантрона, способность убивать опухолевые клетки с МЛУ. Вероятно, дополнительный гетероциклический компонент может существенно увеличить связывание аналогов аминантрона с их внутриклеточными мишенями, а кольцо, А доксорубицина важно для формирования третичной структиры, включающей препарат, дуплекс ДНК и топоизомеразу И.

Множественная лекарственная устойчивость злокачественных новообразований — сохранение клетками жизнеспособности в ответ на воздействие различных лекарственных веществ [34, 89, 94]. Одной из важнейших причин МЛУ является пониженное накопление токсинов в клетке, обусловленное их активным выведением в межклеточную среду. Такой транспорт осуществляется интегральным белком плазматической мембраны^ Р-гликопротеином (Pgp, масса 140−170 кДа) за счет энергии гидролиза АТФ. У человека Pgp кодируется геном MDRX (multidrug resistance 1), локализованным в хромосоме 7. Pgpтрансмембранный белок с молекулярной массой -170 кДа, состоящий из двух одинаковых частей, каждая из которых включает шесть гидрофобных трансмембранных участков. Молекула Pgp имеет два сайта связывания с АТР, что свидетельствует об энергозависимости функционирования белка. Р-гликопротеин — это очень консервативный белок. Он имеет гомологию с многочисленными бактериальными и эукариотическими транспортными белками. Показано, что семейство генов pgp принадлежит к суперсемейству генов, которые кодируют АТФ-связывающие мембранные транспортные системы в филогенетически далеких видах.

Трансмембранный Р-гликопротенд (кодируется геном АВСВХ), транспортирующий лекарственные препараты из клетки, обеспечивает активное выведение цнтостатиков, в частности антрациклинов, что способствует при его экспрессии возникновению полирезистентности к противоопухолевым средствам. Р-гликопротеин — белок-переносчик с широкой специфичностью. Исследования in vitro показали, что спектр субстратов Pgp включает не только противоопухолевые препараты, но и препараты, используемые для реверсии МЛУ, флуоресцентные красители, стероидные гормоны. Увеличение количества иРНК MDRX и Pgp служит фактором устойчивости многих типов опухолей к лечению и, следовательно, связано с клинической агрессивностью заболевания. Причина клинической МЛУ — гиперэкспрессия MDRX и Pgp при неизменной копийности гена, что обусловлено возможностью индукции гена MDRX внеклеточными стимулами — эпигенетической активацией гена. Ген MDR1 может транскрибироваться с двух промоторов — дистального и проксимального. Функциональная роль дистального промотора невелика, подавляющее количество иРНК MDRX транскрибируется с проксимального промотора. В промоторе гена MDRX имеются несколько сайтов, опосредующих срочную активацию транскрипции в ответ на экзогенные стимулы. Следствием такой «вырожденности» является множественность участвующих в этом феномене транскрипционных факторов. Регуляция гена MDR осуществляется на многих уровняхвозможны «обходы» сигналов, если тот или иной механизм не функционирует. Такая взаимозаменяемость механизмов надежно обеспечивает развитие резистентности при действии лекарств.

Антрациклиновые антибиотики (адриамицин, даунорубицин), винкаалкалоиды (винкристин, винбластин), таксаны (таксол, таксотер), митоксантрон, ингибиторы топоизомераз (этопозид) — вот неполный перечень групп противоопухолевых препаратов, устойчивость к которым обусловлена Pgp-опосредованным транспортом [34, 89,94, 95].

Дисфункция р53, приводящая к инактивации или ограничению р53-зависимого апоптоза, может обусловить недостаточную выраженность цитотоксического сигналинга, запускаемого противоопухолевым препаратом, позволяя клетке пережить воздействие [70, 95, 127]. Требуется идентификация внутриклеточной мишени новых соединений и выяснение механизмов гибели — регулируемых р53 и независимых от этого фактора — в ответ на действие новых производных нафтоиндолдионов. Такими механизмами могут быть митохондриальный путь апоптоза: активация генов PUMA, Noxa, инактивация анти-апоптотических генов семейства Вс1−2. Эти механизмы могут быть сбалансированы активацией продуктов анти-апоптотических генов. Так, вероятно участие ядерного фактора каппа В (NFkB) — регулятора выживания клеток, активирующего, в частности, гены семейства IAP (inhibitor of apoptosis) в ответ на действие ряда противоопухолевых препаратов.

Таким образом, актуальность проблемы обусловлена необходимостью углубления знаний о молекулярных механизмах цитотоксичности химических соединений для создания новых противоопухолевых препаратов, преодоления резистентности опухолевых клеток и повышения эффективности противоопухолевой терапии.

Научная новизна.

• впервые исследованы новые оригинальные производные нафтоиндолдионов, вызывающие гибель опухолевых клеток, в том числе клеток с молекулярными детерминантами лекарственной устойчивости — Р-гликопротеином и нефункционирующим р53;

• впервые идентифицирована внутриклеточная мишень наиболее активного нового соединения — 3-аминометил-производного 4,11 -дигидроксинафто[2,3-/]шгдол-5,10-диона, отобранного по данным скрининга химической мини-библиотеки;

• впервые установлены отдельные механизмы передачи внутриклеточных сигналов, регулирующих выживание и гибель клеток при действии 3-аминометил-производного 4,11 — диг и д роксинафто [2.3:/] индол-5,10-диона;

• исследована роль р53 и отдельных механизмов митохондриального пути гибели в цитотоксичности избранного соединения.

Научно-практическая значимость исследования.

Изучение механизмов цитотоксического действия новых производных нафтоиндолдионов с оптимизированными свойствами позволит обосновать использование этого класса противоопухолевых препаратов для лечения онкологических заболеваний.

Цель исследования — установить механизмы гибели опухолевых клеток человека при действии новых производных нафтоиндолдионов.

Задачи:

1) из химической библиотеки новых производных нафтоиндолдионов отобрать соединения, токсичные для клеток с экспрессией Р-гликопротеина и нефункционирующим р53, и определить диапазон концентраций, в которых деления р53 приводит к выживанию клеток;

2) исследовать взаимодействие наиболее активного соединения с возможной внутриклеточной мишенью — ДНК: тип связывания, константа равновесия комплексообразованиия;

3) изучить основные механизмы гибели клеток при действии отобранного нового производного нафтоиндолдионов.

Глава 5. ВЫВОДЫ.

1. Среди производных нафтоиндолдионов выявлены соединения, вызывающие гибель культивируемых опухолевых клеток человека, в том числе клеток с молекулярными детерминантами лекарственной устойчивости — экспрессией Р-гликопротеина и нефункционирующим р53.

2. Одной из внутриклеточных мишеней, важных для цитотоксичности 3-аминометил-производного 4,11-дигидроксинафто[2,3-/)индол-5,10-диона, является двухцепочечная ДНК, с которой соединение образует высокоаффинные интеркаляционные комплексы. Константа равновесия комплексообразования и количество мест связывания определяются соотношением концентраций соединения и ДНК.

3. З-Аминометил-производное 4,11 -дигидроксинафто[2,3-/]индол-5,10-диона в микромолярных концентрациях вызывает апоптоз клеток с диким типом р53. Делеция р53 обусловливает долговременное выживание клеток после воздействия субтоксических концентраций соединенияпри более высоких концентрациях гибель клеток осуществляется независимо от статуса р53.

4. Молекулярный механизм ограничения апоптоза в клетках с делецией р53 связан с увеличением экспрессии гена SLUG.

5. Антиоксидант N-ацетилцистеин потенцирует гибель клеток при действии 3-аминометил-производного 4,11-дигидроксинафто[2,3-/]индол-5,10-диона независимо от статуса р53.

Автор выражает благодарность доктору химических наук А. Е. Щекотихину и профессору М. Н. Преображенской за предоставление новых производных нафтоиндолдионов.

Глава 4.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

.

Антибиотики антрациклинового ряда, в частности, доксорубицин и сходные по структуре карминомицин, рубомицин, идарубицин и др., широко используются в онкологической клинике как эффективные препараты при лечении солидных и мезенхимальных опухолей. Вместе с тем, их клиническое применение ограничено органной токсичностью и развитием лекарственной устойчивости опухолевых клеток. Второе обстоятельство еще более важно, чем общерезорбтивная токсичность: существующие меры борьбы с органной токсичностью так или иначе позволяют уменьшить это неблагоприятное, однако, вероятно, неизбежное побочное действие противоопухолевых препаратов. Лекарственная же устойчивость нередко становится множественной, т. е. клетки опухоли выживают при действии нескольких лекарств. Среди фенотипов множественной лекарственной устойчивости экспрессия трансмембранного АТФ-зависимого транспортера Р-гликопротеина и родственных белков признана одним из ведущих. Действительно, указанные белки, выводя из клетки молекулы многих ксенобиотиков, уменьшают их внутриклеточную концентрацию, снижая возможность индукции клеточной гибели. Однако активация трансмембранного транспорта — не единственная возможность опухолевой клетки избежать гибели. Внутриклеточные механизмы ограничения гибели являются «следующим барьером». Среди таких механизмов — белок р53, участие которого в анти-апоптотическом сигналинге многообразно. Таким образом, создание и исследование механизмов действия новых лекарств, способных преодолевать указанный барьер, т. е. вызывать гибель опухолевых клеток, устойчивых к другим препаратам (и, шире, другим противоопухолевым воздействиям) является актуальной задачей на стыке медицинской химии природных соединений, клеточной и молекулярной онкологии.

Химические модификации антрациклиновых антибиотиков включают, в частности, изменения гетероциклических колец фармакофора и боковых цепей. В НИИ по изысканию новых антибиотиков им. Г. Ф. Гаузе РАМН проводится многолетняя работа по химической трансформации природных и полусинтетических производных доксорубицина, митоксантрона и других соединений. В настоящей работе нам была предоставлена серия новых уникальных производных нафто-[2,3-/]индол-5,10-диона, синтезированных А. Е. Щекотихиным в указанном институте под руководством М. Н. Преображенской. Эти соединения являются прототипами противоопухолевых препаратов нового поколения — более активных для клеток с механизмами лекарственной устойчивости.

На первом этапе исследования мы провели скрининг серий новых производных нафто-[2,3-/]индол-5,10-диона на способность вызывать гибель культивируемых опухолевых клеток человека. Для решения вопроса о способности новых соединений преодолевать Р-гликопротеин-зависимый активный транспорт, сравнивали цитотоксичность соединений для клеток линии лейкоза К562 (дикий тип) и изогенной сублинии K562i/S9 с экспрессией Р-гликопротеина, достигаемой после введения в клетки дикого типа ретровирусной конструкции, несущей полноразмерный ген этого белка. Такая модель позволяет вычленить роль одного механизма — Р-гликопротеина — в выживаемости клеток, что важно, поскольку ступенчатый отбор устойчивых к лекарствам потомков может сохранить и другие факторы выживания. Нам удалось выявить соединения, вызывающие гибель клеток дикого типа и инфектантов в субмикромолярных концентрациях.

После этого возникла необходимость идентификации внутриклеточной мишени новых соединений и выяснения механизмов гибели, регулируемых р53 и независимых от этого фактора, в ответ на действие новых производных нафтоиндолдионов для структурной оптимизации препаратов и отбора из модификационных рядов веществ, перспективных для клинического применения.

На модели клеток рака толстой кишки (линия НСТ116 с диким типом р53) и сублинии НСТ116р53КО с генетической инактивацией этого белка нами установлено, что р53-негативные клетки получают преимущество в выживании при инкубации с каждым соединением из анализируемого модификационного ряда. Возник закономерный вопрос, действительно ли отсутствие в клетках р53 позволяет им пережить воздействие препарата или просто обеспечивает отсроченную гибель обработанных клеток? В следующем эксперименте мы установили, что отсутствие р53 действительно дает клеткам возможность пережить однократное воздействие препарата и восстановить логарифмический рост культуры. Был сделан вывод, что р53 принадлежит существенная роль в регуляции баланса «выживание-гибель» при действии ЛХТА-1116 (аминометил-производного 4,11-дигидроксинафто[2,3-/]индол-5,10-диона). Это соединение было выбрано для изучения из-за достаточно высокой цитотоксичности и явно выраженного окна эффекта р-53, что было важно для изучения механизмов влияния р53 на гибель клеток от препаратов данного модификационного ряда.

Чтобы убедиться, что различия в выживаемости клеток не связаны с разницей во внутриклеточном накоплении препарата, мы изучили накопление препарата в клетках НСТ116 и НСТ116р53КО при помощи проточной цитофлутриметрии. Как и ожидалось, различий в накоплении препарата клетками с разным статусом р53 не установлено.

Следующим этапом исследования стало выявление внутриклеточной мишени аминометил-производного 4,11-дигидроксинафто[2,3-/|индол-5,10-диона. По аналогии с антрациклинами, чей механизм действия уже изучен, мы предположили, что это соединение может взаимодействовать с ДНК.

Методом проточной цитофлуориметрии исследована деградация ДНК под воздействием аминометил-производного 4,11-дигидроксинафто[2,3−1]индол-5,10-диона. Оказалось, что в клетках НСТ-116 дикого типа аминометил-производное 4,11-дигидроксинафто[2,3-/]индол-5,10-диона вызывает деградацию ДНК, тогда как в сублинии НСТ116р53КО этот важный механизм клеточной гибели отсутствует. Таким образом, наличие р53 в клетке предотвращает деградацию ДНК при воздействии J1XTA-1116.

С помощью измерения флуоресценции и поглощения свечения соединения в комплексе с двухцепочечной ДНК установлено, что JIXTA-l 16 является интеркалятором, причем константа диссоциации и плотность посадки молекул этого препарата на двухцепочечную ДНК зависят от его концентрации.

Рассчитанные константы равновесия комплексообразования в микромолярном диапазоне указывают на то, что аминометил-производное 4,11-дигидроксинафто[2,3-/]индол-5,10-диона образует «сильные» (высокоаффинные) комплексы с двухцепочечной ДНК в условиях, близких к физиологическим. Одно интеркаляционное событие приходится на один завиток спирали макромолекулы. Эти расчеты важны для утверждения о том, что ДНК является мишенью (возможно, не единственной), с которой аминометил-производное 4,1 Ьдигидроксинафто^З-^индол-ЗЛО-диона может взаимодействовать внутри клетки. В дальнейшем изучении механизмов гибели клеток при действии аминометил-производное 4,11-дигидроксинафто[2,3-/]индол-5,10-диона мы исходили из повреждения структуры ДНК этим соединением как пускового события в индукции гибели клеток.

Важнейший элемент ответа клетки на повреждение ДНК — нарушение конформации дуплекса и/или самой структуры макромолекулы (изменения нуклеотидной последовательности) — активация р53-зависимых процессов. Для того чтобы выяснить, вызывает ли аминометил-производное 4,11-дигидроксинафто[2,3-/]индол-5,10-диона транскрипционную активацию р53, мы использовали модель трансактивации р53-зависимого промотора в клетках, обработанных исследуемым соединением. Было установлено, что воздействие аминометил-производного 4,11-дигидроксинафто[2,3-/]индол-5,10-диона вызывает транскрипционную активацию р53, что подтвердило гипотезу об участии р53 в гибели или выживании клеток при обработке их аминометил-производным 4,11-дигидроксинафто[2,3-/|индол-5,10-диона.

Также методом изучения цитотоксичности аминометил-производного 4,11-дигидроксинафто[2,3-/]индол-5,10-диона в комбинации с антиоксидантом показано, что антиоксидант М-ацетил-Ь-цистеин потенцирует гибель клеток. Этот эффект проявляется в клетках независимо от статуса р53. Эксперимент на сублинии НСТ-116ConALacZ подтвердил, что добавление N-ацетил-Ь-цистеина не влияет на транскрипционную активность р53. Было выдвинуто предположение, что смещение редокс-баланса снимает анти-апоптотическую активность NFkB и контролируемых этим фактором генов.

Обработка клеток ингибитором поли (АДФ-рибозо)полимеразы (PARP) ЕВ-47 и пан-каспазным ингибитором z-VAD-FMC не вызвала снижения цитотоксичности аминометил-производного 4,11-дигидроксинафто[2,3-Диндол-5,10-диона и также не влияла на потенцирующее действие 1Ч-ацетил-Ь-цистеина. Это может указывать на то, что цитотоксическое действие JIXTA-116 непосредственно не связано с активацией каспазозависимых каскадов.

Чтобы определить, является ли гибель клеток при действии аминометил-производного 4,11 -дигидроксинафто[2,3-/]индол-5,10-диона действительно апоптотической, были использованы три метода. Анализ межнуклеосомной фрагментации ДНК оказался отрицательным, но при исследовании обработанных препаратом в течение суток клеток с помощью электронной микроскопии для концентрация 1,6 мкМ аминометил-производного 4,11 -дигидроксинафто[2,3−1]индол-5,10-диона обнаружены клетки с фрагментацией ядра, характерной для апоптоза. При воздействии 6,4 мкМ/мл клетки оказывались некротизированными. В обоих случаях на фотографии были видны вакуоли лизосомального типа, предположительно содержащие аминометил-производное 4,11-дигидроксинафто[2,3-/]индол-5,10-диона. Для исследования нарушения фаз клеточного цикла в ответ на действие аминометилпроизводного 4,11-дигидроксинафто[2,3-/]индол-5,10-диона проведен анализ распределения плоидности ДНК методом проточной цитофлуориметрии. Было установлено, что ареста клеточного цикла не происходит, тогда как в раннее время воздействия появляется sub-Gl пик, свидетельствующий о наличии апоптоза.

На основе этих данных был сделан вывод, что при малых концентрациях препарата гибель клеток идет по механизмам апоптоза, а при дальнейшем повышении концентрации препарата переходит в некроз либо завершается по некротическому типу.

Далее требовалось выяснить, на каком уровне происходит регуляция гибели и выживания обработанных препаратом клеток. В качестве основной рабочей гипотезы мы приняли возможность митохондриального пути клеточной гибели.

Наиболее интересными кандидатами на роль механизмов гибели могли быть PUMA и NOXA — гены проапоптотических белков семейства Bcl-2, для которых р53 является важнейшим активатором. Их индукцию в культурах клеток с различным статусом р53 мы проверяли методом ПЦР после обратной транскрипции, анализируя воздействие препарата в концентрации 1,6 мкМ/мл на клетки при разном времени воздействия.

Однако существенных отличий в экспрессионном профиле изогенных культур клеток с р53 дикого типа и нокаутным р53 на предшествующем этапе не было, и следующим объектом исследования стали гены SLUG и SNAIL, играющие важную роль в апоптотическом каскаде, запускаемом повреждением ДНК.

Изучение мРНК SLUG показало как практически полное ее отсутствие в клетках с р53 дикого типа, так и явную активацию SLUG в культуре с нокаутным р53 в ответ на воздействие аминометил-производного 4,11-дигидроксинафто[2,3-/]индол-5,10-диона в период до 12 часов после внесения препарата, с некоторым падением уровня мРНК через 3 часа воздействия. В необработанной культуре, как и через 24 часа после внесения аминометил-производного 4,11-дигидроксинафто[2,3-/]индол-5,10-диона, экспрессия SLUG оказался слабой. Эти результаты позволили сделать вывод, что отсутствие SLUG является ключевым элементом выживания клеток с инактивацией р53. В дальнейшем планируется более точное количественное сравнение экспрессии SLUG при разном времени воздействия аминометил-производного 4,11 -дигидроксинафто[2,3^индол-5,10-диона.

Таким образом, проанализированы возможные механизмы действия препаратов, преодолевающих трансмембранный барьер, что важно для их дальнейшего практического применения в терапии опухолей. Экспериментально установлена зависимость эффективности действия препаратов от р53-статуса опухолевых клеток, причем предварительно выявлен возможный механизм, обуславливающий р53-зависимую устойчивость опухолевых клеток к химиотерапии. Уточнение и преодоление этого механизма может способствовать появлению и внедрению в практику новых, более эффективных противоопухолевых препаратов.

Индукция апоптоза в опухолевых клетках — одно из перспективных направлений поиска химиотерапевтических препаратов. Однако, р53-независимый апоптоз существенно замедлен по сравнению с р53-зависимой гибелью, а опухоли в делецией р53 встречаются весьма часто. По результатам нашего исследования, наиболее вероятным механизмом защиты клеток с нефункционирующим р53 от индуцируемого противоопухолевыми препаратами апоптоза является антиапоптотический ген SLUG, играющий важную роль как в нормальном онтогенезе, так и в опухолевой трансформации. В клетках с нормальным р53 SLUG, вероятно, экспрессия этого гена репрессирована посредством р53, блокируя действие SLUG на проапоптотические гены {PUMA, ВАХ), и функционирует путь митохондриального апоптоза, индуцированного повреждением ДНК. В клетках же с нефункционирующим р53 в ответ на повреждение ДНК, помимо р53-независимых апоптотических путей, активируется и SLUG, продукт которого способен блокировать митохондриальный апоптоз. Увеличение концентрации препарата в экспериментальных условиях ведет к некротической гибели клетки независимо от р53 статуса, но так как на практике высокие концентрации препаратов использовать нельзя, целесообразно применять апоптогенные концентрации препаратов в комбинации с воздействием на SLUG.

Результаты настоящего исследования открывают дальнейшие направления исследования механизмов гибели опухолевых клеток при действии новых производных нафтоиндолдионов и, шире, ДНК-повреждающих противоопухолевых соединений. Предстоит выявить прямую роль экспрессии SLUG в клетках с разным статусом р53, используя антисмысловые конструкции. Исследование регуляции экспрессии SLUG на транскрипционном и посттранскрипционном уровнях позволит обнаружить низкомолекуляриые соединения, взаимодействующие с промоторными областями и ингибирующие транскрипцию. Регуляция SLUG на уровне белка является новым направлением в молекулярной онкологии. С практических позиций требуется подобрать комбинации современных противоопухолевых лекарств и способы инактивации SLUG с целью повышения эффективности гибели клеток.

Возможно, выявленные механизмы гибели клеток, индуцируемые новыми производными нафтоиндолдионов — не единственные. Требуются дальнейшие усилия по установлению роли других событий, как регулируемых р53, так и независимых от этого механизма. Важен механизм взаимопереключения апоптоза и некроза. Однако наше исследование позволяет утверждать, что данный класс химических соединений перспективен для использования в клинике, молекулярные механизмы гибели опухолевых клеток при действии наиболее активных производных нафтоиндолдионов имеют своеобразие, и их изучение важно как пример практически ориентированного экспериментального исследования в молекулярной и клеточной онкологии.