Фенотипические и функциональные свойства мезенхимальных стромальных клеток человека в норме и при иммунопатологических заболеваниях

Мезенхимальные стромальные клетки (МСК) относятся к классу соматических стволовых клеток, которые характеризуются способностью к самоподдержанию и дифференцировке в клетки тканей мезодермального происхождения [44]. Будучи широко представленными во всех тканях, содержащих строму с фибробластоподобными клетками [62], эти клетки активно участвуют в поддержании и обновлении элементов соединительной ткани [192]. Особое значение придается роли МСК в формировании гемопоэтических ниш, обеспечивающих функционирование стволовых гемопоэтических клеток в костном мозге, а также в создании микроокружения, необходимого для самоподдержания, пролиферации и дифференцировки тканеспецифических стволовых и прогениторных клеток, в том числе Т-клеточных предшественников в тимусе.

В последующих работах было показано, что в определенных условиях in vitro МСК могут дифференцироваться также в клетки тканей эктои эндодермального происхождения [44, 170], и именно с этим свойством МСК первоначально связывали терапевтический потенциал этих клеток. Действительно, позитивный эффект трансплантации МСК в моделях травмы головного и спинного мозга в совокупности с данными о способности МСК дифференцироваться в нейрональные клетки свидетельствовал о значимости процессов дифференцировки в терапевтическом потенциале МСК. Использование МСК человека также приводило к значительному регрессу симптомов заболевания в моделях множественного склероза и бокового амиотрофического склероза, воспалительных заболеваний кишечника, инфаркта, инсульта, диабета и РТПХ [40, 222, 192, 213].

Однако быстрое развитие эффекта и выявление сравнительно небольшого количества дифференцировавшихся in vivo МСК заставило усомниться в том, что клинический эффект обусловлен в первую очередь трансдифференцировкой /клеточным замещением.

Наряду с выраженным дифференцировочным потенциалом, важным свойством МСК является паракринная функция, которая заключается в способности этих клеток влиять на функционирование целого ряда клеточных элементов. Паракринная функция может реализовываться через продукцию широкого спектра различных факторов МСК, контактные взаимодействия МСК с другими клетками, а также через привлечение (с помощью молекул адгезии и хемокинов) тканеспецифических предшественников и клеток иммунной системы.

Действительно, по данным литературы, спектр продуцируемых МСК факторов включает различные гемопоэтические и негемопоэтические ростовые факторы (в-СЗР, ОМ-С8Р, УЕОБ, ЮР-1, РвР-Ь), интерлейкины (ПТЧ-у, 1Ь-2,1Ь-6,1Ь-1р, ЮТ-а) и хемокины (1Ь-8, МСР-1, М1Р-1Ь). Наряду с этим, МСК являются достаточно активными продуцентами ТЫ/провоспалительных и ТЪ2/противовоспалительных цитокинов, что подразумевает возможность как негативного, так и позитивного влияния на клетки иммунной системы.

Важно отметить, что, несмотря на преимущественное проявление супрессорной активности, в определенных условиях МСК могут обладать иммуностимулирующим потенциалом. В пользу этого утверждения свидетельствует экспрессия на поверхности МСК антигенов МНС I класса, наличие внутриклеточного пула молекул МНС II класса, экспрессия различных молекул адгезии и ТТЛв, а также способность МСК фагоцитировать апоптотические клетки [218]. Поскольку МСК в ответ на эндотоксин усиливают свою секреторную активность, очевидно, что функциональный потенциал МСК может играть значительную роль в регуляции репаративных процессов не только в физиологических условиях, но и при различных повреждающих воздействиях в ответ на различные эндо-и экзогенные ТЪЛ-лиганды. Однако физиологическое значение и функциональные последствия фагоцитарной активности МСК остаются в настоящее время неизученными.

Паракринные эффекты лежат в основе способности МСК оказывать иммуносупрессивный/противовоспалительный эффектвыполнять трофическую функциюподдерживать, а при необходимости рекрутировать и активировать тканеспецифические предшественники и активировать ангиогенез. Важная роль супрессорной активности МСК продемонстрирована в моделях аутоиммунных заболеваний, трофический эффект показан в моделях нейропротекции или посттравматической репарации, проангиогенная активность — в моделях инфаркта миокарда, церебрального инсульта и ишемии нижних конечностей. Дополнительными аргументами, делающими МСК привлекательными для клинического использования, является низкая иммуногенность этих клеток, способность к миграции в очаг повреждения/воспаления и антиапоптотические свойства, что в совокупности с иммуносупрессорной и гемопоэзстимулирующей активностью позволяет рассматривать МСК как потенциально активные индукторы/регуляторы репаративных процессов [8, 97, 116, 187, 211].

Еще одним примером паракринной функции может быть гемопоэзподдерживающая активность МСК, которая заключается в способности этих клеток создавать микроокружение и стимулировать пролиферацию и дифференцировку ГСК. Гемопоэзстимулирующая активность in vivo была продемонстрирована в моделях приживления гемопоэтических стволовых клеток при трансплантации костного мозга после высокодозной химиотерапии [128, 20]. Действительно, в отдельных клинических испытаниях показана эффективность МСК при солидных опухолях [118]. В настоящее время обсуждается целесообразность использования МСК с целью ускорения восстановления кроветворения при трансплантации стволовых кроветворных клеток пациентам гемобластозами после высоко дозной химиотерапии [128, 20].

Наличие одновременно с этим супрессорной активности МСК обусловило интерес к этим клеткам не только в плане повышения эффективности восстановления гемопоэза и иммунной реконституции после трансплантации ГСК, но и в плане профилактики РТПХ. С другой стороны, супрессорные свойства МСК могут неблагоприятным образом сказываться на иммунной реконституции, развитии инфекционных осложнений и выживаемости пациентов.

Несмотря на немногочисленность МСК в костном мозге (не более 0,01 — 0,001%), данная популяция клеток достаточно легко генерируется в культуре in vitro. Более того, впоследствии было показано, что источником МСК может быть не только костный мозг, но и жировая ткань, плацента, пуповинная кровь, эндометрий, пульпа молочных зубов и другие ткани [241, 92, 181, 11, 73, 32, 65, 184, 83]. Генерированные из разных тканей, МСК в целом отвечают Минимальным критериям, разработанным для стандартизации этих клеток. Тем не менее, имеются отдельные данные о фенотипических и функциональных особенностях МСК различного тканевого происхождения. Подобные наблюдения поднимают вопрос о необходимости сравнительной характеристики свойств МСК из различных тканей с целью обоснованного выбора оптимального источника МСК, что является непременным условием для успешного развития клеточных технологий.

В клинической практике, в соответствии с требования GCP, наиболее безопасным считается использование аутологичного клеточного материала, что позволяет избежать проблем гистосовместимости, этических и юридических вопросов. Однако использование аутологичных МСК пациентов при проведении клеточной терапии ставит вопрос о функциональной полноценности этих клеток при патологии. Исследования, посвященные возможностям генерации и анализу функциональной активности МСК при патологии, в частности, инфекционно-воспалительных и онкологических заболеваниях, немногочисленны и противоречивы. Мнения различных исследователей варьируют от постулирования функциональной полноценности стромальных клеток [35, 124] или выявления нарушений отдельных их характеристик при сохранности других [212, 228, 133], до признания полной дефектности МСК [114, 166, 227]. Существуют также данные о нарушениях функционирования стромы лишь у небольшой части больных при отсутствии таковых у остальных [78, 103]. В целом анализ данные литературы не позволяет сделать однозначного заключения об особенностях функционирования МСК при той или иной патологии. Кроме того, отсутствие информации об особенностях/нарушениях функциональных свойств МСК при патологии тормозит разработку подходов направленной коррекции активности этих клеток, что приобретает особую значимость при использовании аутологичных МСК у пациентов с различными заболеваниями.

Вышесказанное определило цель настоящей работы: исследовать биологические и иммунорегуляторные свойства МСК различного тканевого происхождения, а также костномозговых МСК в норме и при иммунопатологических заболеваниях и изучить влияние МСК на эффективность восстановления гемоиммунопоэза при трансплантации гемопоэтических стволовых клеток у больных гемобластозами.

Для достижения поставленной цели были сформулированы следующие задачи:

1. Изучить количественное содержание, фенотип и дифференцировочный потенциал МСК различного тканевого происхождения (костный мозг, жировая ткань, плацента).

2. Изучить регуляторную (иммуносупрессорную, гемопоэз-стимулирующую, цитокин-секреторную) активность МСК, выделенных из костного мозга, жировой и плацентарной ткани.

3. Охарактеризовать количественное содержание, фенотип и дифференцировочный потенциал костномозговых МСК у больных гемобластозами, аутоиммунными заболеваниями и циррозом печени.

4. Изучить иммуносупрессорную, гемопоэзстимулирующую и цитокин-секреторную костномозговых МСК у больных гемобластозами, аутоиммунными заболеваниями и циррозом печени.

5. Исследовать возможные молекулярные механизмы, опосредующие иммуносупрессорную активность МСК костного мозга, в норме и у больных гемобластозами, аутоиммунными заболеваниями и циррозом печени.

6. Изучить влияние фактора роста фибробластов (FGF) на диффернцировочный, иммуносупрессорный и цитокин-секреторный потенциал костномозговых МСК доноров в культуре in vitro и оценить возможность использования FGF для стимуляции роста и коррекции функциональной активности МСК при патологии.

7. Изучить влияние МСК на восстановление показателей кроветворения и иммунную реконституцию у больных гемобластозами при проведении аутологичной трансплантации стволовых кроветворных клеток.

8. Оценить особенности клинического течения пострансплантационного периода (частота развития инфекционных осложнений, показатели выживаемости, купирование ПХТ-индуцированной токсичности и т. д.) у больных гемобластозами с аутологичной трансплантацией стволовых кроветворных клеток в комбинации с введением МСК.

Научная новизна.

Морфофункциональные исследования продемонстрировали, что выделенные из костного мозга, жировой и плацентарной ткани МСК соответствуют Минимальным критериям, продуцируют широкий спектр цитокинов с функциональным потенциалом для поддержания кроветворения, иммуномодуляции и стимуляции репаративных процессов, проявляют дозозависимую иммуносупрессорную и гемопоэзстимулирующую активность, однако характеризуются рядом различий. В частности, МСК жировой ткани отличаются максимальным количеством клоногенных предшественников МСК и наиболее высоким базальным уровнем цитокин-секреторной активности, популяция плацентарных МСК — наибольшей пролиферативной активностью и выраженным супрессорным эффектом на пролиферацию Т-клеток в СКЛ, костномозговые МСК — максимально выраженным остеогенным потенциалом и иммуносупрессорной активностью в отношении a-CD3-активированных Т-клеток.

Исследование свойств МСК при патологии (гемобластозы, аутоиммунные заболевания, хронические вирусные гепатиты с исходом в цирроз печени) позволило получить новые данные о сопряженности патологии со снижением в костном мозге количества клоногенных предшественников МСК, наиболее выраженным у больных лимфомами и АИЗ, и значительной вариабельности данного показателя у больных ЦП и АА. При этом установлено, что вне зависимости от количества клоногенных предшественников, культуры МСК больных отличаются сниженной скоростью роста и количеством «дочерних» клеток, генерируемых одной КОЕ-Ф. Впервые продемонстрировано, что развитие иммунопатологических состояний ассоциировано со снижением иммуносупрессорной активности МСК, которая проявляется только при высоких количествах МСК, в то время как низкие дозы МСК не влияют (при ЦП), либо усиливают (у больных АИЗ и гемобластозами) пролиферативную активность Т-клеток. Характерно, что супрессорная активность МСК при большинстве исследуемых патологий не коррелирует с продукцией NO, HLA-G, IL-10, IDO, но в значительной степени опосредуется ПГЕ2, а у больных АА существенно блокируется при нейтрализации IDO.

Впервые установлено, что добавление основного фактора роста фибробластов (FGFb) в культуры МСК больных воспалительными и онкогематологическими заболеваниями приводит к снижению длительности первичного культивирования МСК, увеличению выхода клеток и возрастанию числа клеток в 8Л32М фазе клеточного цикла. При этом возрастание пролиферативной активности МСК в присутствии БОБЬ сопровождается повышением супрессорного потенциала МСК доноров и больных хроническими воспалительными заболеваниями (АИЗ, ЦП), однако не приводит к усилению супрессорной активности МСК больных гемобластозами. Кроме того, использование БОБЬ в процессе культивирования МСК позволяет повысить исходно сниженный остеогенный дифференцировочный потенциал МСК больных ЦП, но не влияет на остеогенную дифференцировку МСК больных гемобластозами.

Впервые продемонстрировано, что использование низких доз МСК при трансплантации аутологичных ГСК у больных злокачественными лимфомами безопасно, сокращает сроки критической нейтрои тромбоцитопении, повышает эффективность раннего восстановления лимфоцитов и реконституции СОА+ лимфоцитов (в том числе за счет наивных СО4+ Т-клеток) при отсутствии стимулирующего влияния на восстановление регуляторных Т-клеток. Трансплантация низких доз МСК ассоциируется с меньшей частотой развития тяжелых форм поражения слизистых и не приводит к увеличению частоты возникновения рецидивов/снижению выживаемости больных.

Теоретическая и практическая значимость.

Полученные данные свидетельствуют о том, что наряду с общностью биологических свойств, МСК различного тканевого происхождения характеризуются рядом тканеспецифических особенностей, в частности, различаются по количеству клоногенных предшественников, пролиферативному и остеогенному потенциалу, а также продукции цитокинов и проявлениям супрессорной активности.

Выявленное снижение количества клоногенных предшественников МСК, их пролиферативной и супрессорной активности, а также остеогеннош потенциала у больных воспалительными и онкогематологическими заболеваниями свидетельствует о сопряженности иммунопатологических процессов с количественными и функциональными изменениями в популяции МСК. При этом ПГЕ2 является универсальным медиатором супрессорной активности высоких доз МСК независимо от патологии. Установленная зависимость между усилением пролиферации МСК (при обработке FGFb) и восстановлением супрессорного потенциала МСК при воспалительных заболеваниях и отсутствие подобной зависимости при гемобластозах свидетельствует о существовании различных типов функциональных нарушений МСК.

Практическая значимость работы заключается в том, что впервые показана возможность коррекции нарушений функциональной активности МСК при иммунопатологических заболеваниях фактором роста фибробластов и различная чувствительность МСК больных воспалительными и онкогематологическими заболеваниями к действию FGFb. Важным прикладным аспектом работы являются данные о безопасности, переносимости и клинической эффективности внутривенного введения относительно невысоких доз аутологичных МСК. Оценка показателей кроветворения и содержания различных субпопуляций Т-лимфоцитов свидетельствует, что трансплантированные МСК in vivo не обладают иммуносупрессорной активностью, повышают эффективность восстановления гемопоэза и иммунной реконститутции и оказывают благоприятный эффект на исходы трансплантации. Результаты исследований использованы для разработки новой медицинской технологии «Использование совместной трансплантации мезенхимальных стволовых стромальных клеток и стволовых кроветворных клеток при гемобластозах и аутоиммунных заболеваниях» (ФС № 2008/014 от 30 января 2008 г). Основные положения, выносимые на защиту:

1. МСК различного тканевого происхождения имеют тканеспецифические различия по количеству клоногенных предшественников, пролиферативному и остеогенному потенциалу, а также продукции цитокинов, участвующих в поддержании кроветворения, иммуномодуляции и стимуляции репаративных процессов.

2. Изменения свойств костномозговых МСК при гемобластозах, аутоиммунных заболеваниях и циррозе печени проявляются снижением количества клоногенных предшественников МСК, их пролиферативной и супрессорной активности, а также остеогенного потенциала в культуре in vitro.

3. Основной фактор роста фибробластов повышает in vitro пролиферативную активность МСК больных с иммунопатологическими заболеваниями и у пациентов с аутоиммунными заболеваниями и циррозом печени корригирует иммуносупрессорную активность и остеогенный потенциал МСК.

4. Использование низких доз МСК (в диапазоне от 0,01 до 1,1×106 клеток/кг) является безопасным и повышает эффективность трансплантации аутологичных ГСК у больных гемобластозами за счет сокращения сроков цитопении, более эффективной реконституции Т-клеток и снижения частоты тяжелых инфекционных осложнений (мукозитов, энтеропатий).

Объем и структура диссертации.

Диссертация написана в традиционном стиле и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, 5 глав собственных исследований, обсуждения полученных результатов и выводов. Материал изложен на 180 страницах машинописного текста, включающего 28 таблиц и 24 рисунка. Прилагаемая библиография содержит ссылки на 242 источника литературы, в том числе 229 иностранных.

ВЫВОДЫ.

1. МСК костного мозга (КМ-МСК), жировой (Ж-МСК) и плацентарной (П-МСК) ткани обладают схожей морфологией, иммунофенотипом и способны к билинейной дифференцировке, однако различаются по количеству клоногенных прекурсорсоров и пролиферативному потенциалу. Так, по сравнению с костным мозгом ядросодержащие клетки жировой ткани содержат большее количество КОЕ-Ф, а популяция П-МСК отличается большим содержанием относительно мелких клеток (<20 мкм), большим выходом клеток из одного клоногенного прекурсора и наименьшим временем удвоения клеточной популяции.

2. МСК различного тканевого происхождения обладают сходной гемопоэзпод держивающей активностью, в равной степени стимулируя образование КОЕ-Э и КОЭ-ГМ в культурах костно-мозговых клеток, но различаются по выраженности супрессорной активности, о чем свидетельствует более высокая ингибирующая активность П-МСК (по сравнению с КМ-МСК и Ж-МСК) в смешанной культуре лимфоцитов.

3. МСК различного тканевого происхождения обладают функциональным потенциалом для поддержания кроветворения (через продукцию G-CSF, GM-CSF, ЕРО), иммуномодуляции (через продукцию IFN-y, IL-2, IL-6, IL-lb, TNF-a и хемокинов — IL-8, МСР-1, М1Р-1Ь) и стимуляции репаративных процессов (через продукцию VEGF, FGF-basic, IGF-1, IL-6, ММР-9, TIMP-1). При этом Ж-МСК отличаются наиболее выраженной спонтанной продукцией провоспалительных (IL-lb, TNF-a), иммунорегуляторных (IFN-y, IL-2, IL-4, IL-6, IL-8, MCP-1, MIP-lb) и гемопоэзстимулирующих (G-CSF, GM-CSF) медиаторов, но отличаются более низкой чувствительностью к ЛПС-стимуляции.

4. Костномозговые мононуклеарные клетки при патологии отличаются сниженным содержанием клоногенных прекурсоров МСК, наиболее выраженным у больных лимфомами и АИЗ, и в меньшей степени — у больных ЦП и ММ. При этом выявленная внутригрупповая гетерогенность больных ЦП и АА по количеству КОЕ-Ф является новым признаком патогенетической разнородности данных заболеваний.

5. Увеличение времени генерации КМ-МСК in vitro, независимо от исходного количества клоногенных предшественников, а также снижение количества «дочерних» клеток, генерируемых одной КОЕ-Ф, свидетельствует о нарушении пролиферативного потенциала МСК у больных ЦП, АИЗ и гемобластозами.

6. В отличие от МСК здоровых доноров, МСК при патологии способны ингибировать пролиферативный ответ активированных Т-лимфоцитов только при высоких количествах МСК, тогда как низкие дозы МСК не влияют (при ЦП), либо усиливают (у больных АИЗ и гемобластозами) пролиферативную активность Т-клеток, что свидетельствует о значительном снижении иммуносупрессорных свойств и появлении иммуностимуляторной активности МСК при ряде патологий.

7. Супрессорная активность МСК при большинстве исследуемых патологий не коррелирует с продукцией NO, HLA-G, IL-10 или экспрессией IDO, однако в значительной степени (на 42%) снижается при обработке МСК индометацином, а у больных АА существенно блокируется при нейтрализации активности IDO, что свидетельствует об универсальной и значительной роли ПГЕ2 в реализации супрессорного потенциала МСК при различных патологиях и сохранности IDO-опосредованного механизма супрессорной активности МСК при АА.

8. Добавление основного фактора роста фибробластов (FGFb) на этапе генерации МСК у больных гемобластозами и воспалительными заболеваниями сопровождается сокращением сроков культивирования, увеличением выхода клеток, а также возрастанием числа МСК в S/G2M фазе клеточного цикла, что свидетельствует о способности FGFb корригировать исходно сниженную пролиферативную активность МСК при патологии.

9. Усиление пролиферативной активности МСК в присутствии FGFb сопровождается повышением супрессорного и остеогенного потенциала МСК доноров и больных хроническими воспалительными заболеваниями (АИЗ, ЦП), однако не влияет на супрессорную и дифференцировочную активность МСК больных гемобластозами, что свидетельствует о различной чувствительности МСК к действию FGFb при разных патологиях.

10. Наличие сопряженности между усилением пролиферации МСК (при обработке FGFb) и восстановлением супрессорного и остеогенного потенциала при воспалительных заболеваниях и отсутствие подобной зависимости при гемобластозах свидетельствует о существовании двух типов функциональных нарушений МСК — зависимом и не зависимом от их пролиферативной активности.

11. Использование низких доз МСК (в диапазоне от 0,01 до 1,1×106 клеток/кг) при совместной трансплантации с аутологичными ГСК у больных гемобластозами позволяет сократить сроки критической нейтрои тромбоцитопении, приводит к более эффективному раннему восстановлению лимфоцитов, более активной реконституции CD4+ лимфоцитов за счет наивных CD4+ Т-клеток и не оказывает стимулирующего влияния на генерацию регуляторных Т-клеток.

12. Совместное использование МСК и ГСК является безопасным, поскольку не приводит к увеличению частоты возникновения рецидивов и/или ухудшению показателей выживаемости больных геобластозами, и при этом позволяет повысить клиническую эффективность трансплантации аутологичных ГСК за счет снижения частоты развития тяжелых инфекционных осложнений (мукозитов, энтеропатий) и более эффективного купирования ПХТ-индуцированной токсической нефропатии.