Методика и применение автоматизированной микроскопии лейкоцитов с количественной оценкой цитохимических реакций

Актуальность проблемы г Цитометрин, то есть техника ПОДСЧЙТа" измерения и Сортировки клеточных Частиц, «ншмост одно г» важнейших МОСТ В ЯрССНаЛР Современных медицины и биологии, Н ТОМ ЧИСЛе гематологии Методы цитометрин ролюляюг описывать клеточную популяцию с помощью объективно измеряемых количественных показате-лсЛ, чей выгодно отличаются от трвлииионно*! визуальной микроскопии, результат которой сильно зависит от квалификации цитолога н его субъективных предпочтений [18].

Наиболее широкое распространение пилу чили нродошм цнтомстрни (Яо^ су1сигиг1гу) благодаря, я честности, высота степени дзтомвтиэ"-щгн. зшчлпнвй скорости работы я шшпрноЯ беэопясяоетя для нер-«мои». Между тем, эта методикл имеет ряд существенных аершпшй, п частности, фкнскровиниыП набор измеряемых признаков, отсутствие возможности яшуялыюго контрили, высокую стоимость оборудования м расходных ЫВТСрМЫКП |9|.

Таким образом, рвавитие технологии автоматического лиализв крови ¦ювыснло точность и иоснроизвадимость ОПрСДелШм основных гематологических НОтитедвЯ, Ко не отменило исследо1ншиЛ клеток кроши методом свстоиоЛ микроскопии, Микроскопические исследования выполняются и лабораториях, обслуживающих гематологические стационары, а большом объёме и сопровождаются значительным напряжением органов зрения и опорно-двигательного аппарата сотрудников Утомление, развивающееся и результата диптльноИ монотонной работы является потенциальным источником ошибок.

Поэтому метод видсоцнтомсгрин (ипа^е суЧовпеСгу), то есть цитомст-рнн по микроскопическому изображению, всегда иаходнл свою область применения Так, разработаны аппаратно-программные комплексы, позволяющие автоматически производить поиск па мазке. нлмереиие н классификацию нормальных клеток крови при окраске по Рошшовекому-Гимзе, например, комплекс МБК0С-Ц2 |17| Вндеоштигетрия также используется как средства объективной количественной оценки в гнето-лопш и щттологни нрн различных методах окршпнвання |65, 1|.

Тем M менее, для щгтохнмнческнх методов, имеющих большое значение при диагностике острых лайкион, методика количественной онелкн OTcyTCTOjvr Между тем, сотрудники лабораторий, работающих в клиниках анкокмитологнчккогй профиля, испытывают дополнительное пп еаьэ M стЦМОН Full J к" напряжение" гвяминое г особо!) ответственностью ирачоилвборамти, уешнмлшикщаго дошл гтжачсстмаидаго мболе-вниин. поскольку его лечение само по с*бс может вышвюь летальные осложнении Успех терапии острого лейкоза и имчитсльной мерс определяется irpimiMbicofl диагностикой формы и iwpnsirra заболевании, в оеншк которой лежит морфологии и шггтаимии [2A]. Выраженная ыиинко’цитологическая гетгрогеинос-п, острою лейкоза, пеггольтооа-шк при клагоифицирошшни конк1*?тных случаев преимущественно нес||еш|фич"*нх Ц) гг0л01″ и’и"ких л (игл1лкои, значение которых оцениваемся лини в НОКТОНСТб всего спектра цитологических характеристик бллстных клеток ¦ делают диагностику острого лейкоза наиболее сложным разделом современноЛ лабораторной гтматологин, Поэтому задача ютометмэ&иии и обккдоимцм оценки цитологических параметров лей ."одических клеток представляется актуальной и сажмоП.

Ишкдюши! эстерат при острой лейко" трлдицинлк пмАзутя для подтверждения моносцггароол flpijw бластноП популяции н диа-гооепоск М-1 ¦ МБ варианте* острого мнежтдиогв лейком (ОМЛ). Диагностическое использование п-нл|тиацет*г"стер"ам (иеспецифнческой эстервэы, НЭ) базируется на чувствительности этого фермента к иягнби-роаанию NaF в клетках моноцвтарноП линии |ТА| Обьектнянтацня результатов этой реакции особенно актуальна, поскольку наличие инги Бнрования часто весьма трудно определить на глаз. Хотя количествен-пая видеощтшстрическая оценка ряда других цитохимических реакций предпринималась |25], дли реакции на НЭ объективная методика предложена не была.

Одной ИЗ ПЖНсЛаии величин. шмсрнсмых при колшкетвенной оценке цитохимических реакций, являетгя оптическая плотность (ОП) Дли того чтобы правильно выбрать спектральный интервал для её нзмере-IIкн. необходимо знать спектры ноглоп (енни используемых красителей Дли цитохимических методой окрашивания ira работа не была выпалиена рапсе, поэтому, хотя в рамки даюй работы ми ограничиваемся и основном рл-цлботкоП методики количественной «ишки МГППНОСТИ НЭ 11 ее ингибированля фторидом натрия, нами выполнены исследования спектров погашения и при ряде других внршиттив окрашивания, что является необходимым предварительным шагом для разработки соответствующих техник.

Мегодикя видсоцнтомегрпи, пригодная к широкому практическому применению, должна быть хороша воспроизводима и максимально автоматизирования Для обеспечения воспроизводимости необходимо выяснить влияние вариабельности окрашивания и других факторов, от которых зависит измеряемая оптическая Плотность клетки, и частности, длины волны, на которой проводится измерение Автоматизация же методики требует разработки надёжных алгоритмов аитофокуенронки и выбора места на мазке Предлагавшиеся ранее алгоритмы аятофокусн-ровхи, наприиср, [89], непригодны для микроскопии из-за особенностей мехяиики Алгоритм выбора места па мют ле настоящего времени предложен не был.

Таким образом, разработка ипмтюиромита метода обгмжтнв-ной КШШЧОСПСНВОП оценки реакции НЭ имеет важное значение для современной мелиииим В Настоящее время разработка методик аитома-тняроишпй ввдияипгометрми ямяется особенно шуиыюЯ, постольку имеется возможность реализовать их широкое пкдреюк" применени-см со&ремениих компьютерных технологии и доступного качественного оборудомшня.

Целью настоянной работы является разработка методики кодиче пагмиоП оценки активности неепецифической эетераяы и ее нш’ибиро-ваиия фторидом натрия в лейкоцитах средствами автоматизированной видеоиитоыетрии. а также ирокрка прнменимоепг этой методики для исследования клеток костного нот га в норме и при острых лейкозах.

Задачи,.

1 Рдзрйбстть методику колячОСПММОЙ оцонкн активности нвспе-цнфнческоА эсприы и ч4 ингиГщроввннм фторидом натрии в лоЛ-КОЦ1ГТМ 1IH ЫВЗНС КОСТНОГО МСИГв С|КДСТ№Ы|| «ШТОМДЛСЫфО мл i toll Ш1ДСйЦИТОМеТрНИ.

2. C? wiiTW пакет ирнбирп для мн^кклектрофотомстрин, с «и помощью знрегиетрироит. спектры поглощении клеток ir их мнетеit и 11ОД0б|1*ГЬ OimillAJlWIUf» i’l 1еК1ТЛ) ЬИЫ[Ь" ДИиШЭОНЫ дои КОДНЧ"ТвП1-ноЛ оценки активн">етн игспсц|ф|ческо11 «стср"эы< а также для ри.

Ди Других НИТОХНМНЧескиП uKpACOK IIA M1 «C Лч) П i41X i к ri iLFuy, ГЛИКОГгИ.

ШНК-реакцня), ДЛИНАМ (судан черный В), кнглу*1 фосфагачу.

3 ГКуюбрап. набор иртилкии кдегмк, достаточный для оптики реакции и* илдищифи’ксхую «вриу, рлэ работать алгоритмы их mm> МЛТИЧеСВДГО 11ЭЫ"рС11ИЯ. РкфЛ&тГвТ* АЛГОрИТМЫ Выбор» ШЛЯ НП мазке И авгофокуенровки для автоматизации сбор* Выборки клеток.

4. Quotum, практическую значимости раэрарботаиноД методики для исследования костного мозга практически здоровых пациентов и больных острыми лейкозами.

Научная ноннзнд, Проведен анализ еовроыешюго состоянии йидеи-цнтометрнп, что позволило сформулировать и решить ряд задач, существенно важных для создания полноценная автоматизированной системы видеолитсыстрин. в частности дм колнчестпеиноЛ оценки цитохимических реахдиЛ.

Впервые разработана методика количественной оценки активности неспсиифнческой эстеразы и се ннгнбиропания фторидом натрия ниПдс-ны онтиьшльиые условия для намерения оптическаЛ плотности, подобран набор признаков клетгок wip^Ktrptnywutiifl данную реакцию, предложена нормировки, но интсгральиоЛ овггичсекоП ндотносги «ритро^штов, позволяющая учесть вариации окршмивания Впервые разра<�х"тан алгоритм автоматического выдежнин гранул фермчгг* НаЛдены гнектрпльнме диаипзомы для и-шерсния поглощения при ряде других цнтокнмнчеекнх окрасок.

Показам", что применение разрнботаиноЛ методики повышает кифарнаяшюстъ И объективность рсшщш ми исспспифичесхую эстеразу, по> виляет делать заключения и С0ШШТСАЫ1 wx случаях.

Впервые разработан мгорнтн автоматической фокусировки для микроскопии, шяволнющиП получать сфпдюфомшк Изображения клеток с максимальная эффективностью и надежностью более 99%.

Впервые разработан алгоритм автоматического выбора траектории на мазке кроив, позволяющий собирать выборку клеток U оптимальной зоне, в том числе при непраошшноЛ форме m язи". РазрйбоПН оригинал и-нып алгоритм оценки качества места на мотке по ТОЛЩИН" слоя эритроцитов.

Теоретическое и приктк-юскос значение 1*и>оты, Проведённые работы являются существенным вкладом и процесс создания системы автоматизированной втдеоцитометрииРлэ работай им It мпчд заметно повышает 1ШфорЫВТИ ИНОСТЬ, объеКТНВНОСТЬ и ТОЧНОСТЬ ООДИКИ дктнино-сти иеспецнфичеехоП эстеразы и ее ннгибнронаиия фтормлом iMitpitH, что имеет существенное значение дли проведения научных и клинико-дрипюстнческих исследования.

Реализация результатов исследования. Внедрение подученных результатов в практику осуществляется следующими путями.

1 Разработанные алгоритмы с 200−1 г. применяются на практик"? в составе аппаратно-программного комплекса МЕКОС-Ц2. ДянныЛ комплекс эксплуатируется в более чем ]00 медицинских и иаучно-нсследовательскнх учреждениях России.

2 Результаты опубликованы в 9 печатных работах, докладывались нв научных н научнопрвктнческ их конференциях.

3 Разработанная методика количественной оценки активности иеспе-щ[фическоЙ эстсразы и № ПНГНбирШЯШИЯ фторидом натрия применяет&tradeв Российской детской КЛИНИЧГСКОЙ бОЛЫНЦО и кячкпг ЭХЫЕСрНМСКТВЛЫЮГО нспзДВ При ДИ"П10СП1КС острых ЛсЛксгюО.

Агфобацни диссертации. Материалы работы докладымлна" im заседании кафедры биофизики РГМУ 23 00.3006.

Публикаций. По материалам/диссертации оиублнковамо 9 печатных работ,.

OSiiCM и структура работы, Диссертация состоит in введения, ¦ пшц выводов и списка литературы Pafitmi иэламоси" на ] (границах, иллюстрирована 27 рисунками и t таблицами Список лип'|>ятури кнлю-4JU.T 97 наименован Hfl, из которих 32 работы представлены па риском ИЗЫКС, я 65 iul йнгливском.

Работа ИЫПОЛНСН* МП юфсдре пЫСШвВ EttlttlBMKR ГОУ ВПО РГМУ Рогадрава (вдедукщмП профессор, доктор фпШЯО-ттеммгическнх наук В Н. Акимов) и в цптолошчсскоП клнннчккоП лаборатории ГУ РДКБ Pociapitim {ли№t" jty ю спин — кандидат медицинских ннук Л В БиЛ-дуи).

Выводы.

J Разработана методика количественной оценки активности леепеци-фнческой TcrejNCiu (НЭ) и ее ингибнроаяния фторидом натрии в лейкощгтвх нп мазке костного MOtjru средствами автомапинрояан-Holt внлеоцитометрии, позволяющая объективно оценивать результаты данной цитохимической реакции Для обеспечения воспроизводимости результатов при количественной оценке активности НЭ в качестве нормировки может быть не пользе вала средняя интегральная оптическая плотность вритроцитое. Оптическую илот-ноегь следует измерять опюсительио плазмы. Средствами микрокраски количественпак оценка может йровшитьен по зелёному каналу иогтной камеры,.

2. Подобран набор параметров клеток, описывающих как иитенсив-кость реакции, твк и ее характер (гранулярность) Получена количественная характеристика, описывающая степень нигибиртвопия НЭ фторидом натрия (показатель нмшбиринш). Опрсделе-иы значения полученных показателей, характерные для нормвль-иого костного мозга, острого лнмфолейкоза, острых промщуюшь тарного и моиобласпюго лейкозо".

3 По 1юлучеиным характеристикам наблюдаются выраженные раз-лнчия между острым промнелоцитвриым и острым Монобластным установлено, что для реакции на НЭ без долейкозами, что доказывает высокую информативность разработанной МеТОДИКК При ДнфферСИШ1ВЛЫ10Й ДНВПЮСТИКе ОСТРЫХ ЛСЙКОэов. Доказано, что в рнде случаев при остром промиелощггврном лсЛкоэе может наблюдаться нпгнбкрошш НЭ фтористом натрия ¦I Получены спектры HiH. iuim'iiHM кдгток при цитохимических окраг-ках на мнслопсроксилаэу, гликоген {ШИК-реакцим}, фосфолшшды {судаи черный В] и кислую фосфатазу с докраской гематоксилином Майе pa Установлено, что дли реакции на гликоген измерений оптической плотности может производиться на длинах воли 560 и 600 им, для остальных реакций — на длинах волн '140 и 6Ш им, 5 Разработаны эффективные алгоритмы. 1геобходнмые для автоматизации сбора выборки лейкоцитов алгоритм автофокусировки, позволяющий автоматически получать «^юкуенроианиос изобра-жс|И№ клетки с надёжность» больше 99% ификтивностью, близкой к максимальной, алгоритм оценки толщины мазка, позволяющий автоматнчйскн оценивать пригодность данного места на мазке для сбора выборки клеток, и алгоригм автоматического перемещения по мачку, позволяющий собирать выборку клеток в оптимальной зоне, в том числе" при неправильной форме мазка.