Фитохимическое изучение и биологическая активность брусники, клюквы и черники

Актуальность темы

Брусника обыкновенная (Vaccinium vitis-idaea L.), клюква болотная (Oxycoccus palustris Pers.) и черника обыкновенная (Vaccinium myrtillus L.) относятся к широко и традиционно используемым растениям, являющимся объектами многочисленных исследований. Вместе с тем недостаточно данных как об элементном составе этих растений, произрастающих в различных регионах России, так и о влиянии антропологических и экологических факторов на содержание различных природных соединений. Кроме того, важным аспектом является углубленное исследование этих растений для расширения возможностей их применения в медицине .

Цель и задачи исследования

Целью данной работы являлось сравнительное фармакохимическое исследование сырья брусники, клюквы и черники из разных мест произрастания и разработка на его основе новых лекарственных средств.

Для реализации поставленной цели следовало решить следующие задачи:

— обобщить данные литературы по современному состоянию химических, фармакологических и технологических исследований листьев и плодов брусники, клюквы и черники;

— провести сравнительный качественный анализ элементного состава, фенольных соединений и иридоидов, а так же количественное определение макрои микроэлементов, арбутина, флавоноидов, гидроксикоричных кислот, антоцианов и полифенольных окисляемых веществ в листьях (побегах) и плодах исследуемых растений из разных мест произрастания, провести их экологическую оценку;

— предпринять фармако-биохимическое изучение густых экстрактов плодов брусники, клюквы и черники на токсичность, наличие адаптогенных свойств, седативную, противоболевую и противовоспалительную активность. Выявить влияние препаратов на содержание в органах и тканях животных катехоламинов, 11-оксикортикостероидов, биогенных аминов и нейромедиа-торных аминокислотпровести фармакологическое исследование смеси экстрактов валерианы и черники, определить ее влияние на биохимические показатели животных (для разработки экспериментального препарата).

Научная новизна. Впервые предпринято целенаправленное фармако-химическое исследование брусники, клюквы и черники, произрастающих преимущественно в центральных и северных регионах европейской части Российской Федерации. При помощи рентгенофлуоресцентного анализа определено содержание 5 макро- (К, Са, 8, Р, С1) и 25 микроэлементов (Ва, Вг, V, Бе, I, Сё, Со, Ьа, Мл, Си, Мо, Ав, N1), N (1, №, вп, Шэ, РЬ, Бе, Бг, 8Ь, Т1, Сг, Zn, Ъг) в 71 образце растительного сырья и почв с мест произрастания. Проанализирован состав фенологликозидов, флавоноидов, антоцианов, гидро-ксикоричных кислот и иридоидов. Спектрофотометрические методики количественного определения арбутина, флавоноидов и гидроксикоричных кислот адаптированы к объектам исследований. Проведено количественное определение арбутина, флавоноидов, антоцианов, гидроксикоричных кислот и полифенольных окисляемых веществ, при этом отмечен ряд закономерностей.

Впервые предпринято сравнительное фармакологическое и биохимическое исследование густых экстрактов плодов брусники, клюквы, черники, среди которых наиболее выраженную и сбалансированную активность проявил экстракт черники, и смеси экстрактов черники и валерианы. Смесь экстрактов валерианы и черники проявляла седативную и анксиолитическую активность (без угнетающего действия на двигательные функции), нормализовала гормонально-медиаторный баланс при стрессе и обладала умеренной адаптогенной активностью.

По результатам работы оформлена заявка на патент РФ на изобретение.

Практическая значимость. Впервые для практической медицины предложена комбинация экстрактов валерианы и черники в качестве седативного, анксиолитического и актопротекторного препарата. Проведена экологическая оценка состояния фитосырья из различных регионов РФ, а так же сравнительных анализ содержания отдельных групп фенольных соединений в изучаемых растениях.

На основании проведенных исследований апробированы и внедрены:

— методики количественного определения арбутина, гидроксикорич-ных кислот, флавоноидов в лекарственном растительном сырье (Акты апробации от 01.10.04 г. ГУЗ «Вологодский областной центр контроля качества и сертификации лекарственных средств», акт внедрения в учебный процесс кафедры фармакогнозии Ярославской государственной медицинской академии);

— проект изменения № 1 к ГФ XI, вып. 2, ст. 27 «Листья брусники» ;

— инструкция по заготовке плодов черники обыкновенной;

— проекты фармакопейных статей предприятия (ГП ВО «Вологодская фармацевтическая фабрика») черники плоды, черники листья, экстракт плодов черники жидкий, «Валеромил настойка»;

— опытно-промышленный регламент на производство препарата «Валеромил настойка» ПР-22 782 900−8-2004.

На основе разработанных нами опытно-промышленных регламентов на производство «Валеромила» ГП ВО «Вологодская фармацевтическая фабрика» произвела 6 экспериментальных серий «Валеромила» (по 2 серии настойки, экстракта жидкого и сиропа). Предварительная апробация сиропа «Валеромил» на кафедре терапии ЯГМА под руководством профессора A.A. Зотова дала положительные результаты. Между ЯГМА и ГП ВО «Вологодская фармацевтическая фабрика» составлен договор о выпуске «Валеромила» в форме настойки и сиропа в объеме 60 000 упаковок в год в течение 3-х лет после государственной регистрации.

На защиту выносятся:

1. Данные сравнительного фармакохимического исследования брусники, клюквы и черники, произрастающих в центральных и северных регионах европейской части страны.

2. Особенности влияния антропогенных и природных факторов на накопление элементов.

3. Результаты определения элементного состава и фенольных соединений исследуемых образцов фитосырья.

4. Итоги разработки нового комбинированного препарата.

Апробация работы. Основные положения диссертационной работы докладывались на: IV Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 1997), межвузовской научно-практической конференции профессорско-преподавательского состава, посвященной 40-му выпуску провизоров заочного отделения Пермской государственной фармацевтической академии (Пермь, 2000), межвузовской научно-практической конференции, посвященной 85-летию высшего образования на Урале (Пермь, 2001), 67-й межвузовской научной конференции студентов и молодых ученых (Курск, 2002), третьем конгрессе молодых ученых и студентов: «Науки о человеке» (Томск, 2002), научно-практической конференции «Фитотерапия сердечнососудистых заболеваний» (Москва, 2002), X Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 2003), научной конференции, посвященной 50-летию Алтайского государственного медицинского университета (Барнаул, 2004), научных конференциях студентов и молодых ученых Ярославской государственной медицинской академии (Ярославль, 1993;2005 г.).

Связь задач исследования с проблемным планом фармацевтических наук. Диссертационная работа выполнена в соответствии с планом научно-исследовательских работ в Ярославской государственной медицинской академии. Номер государственной регистрации 01.20.12 868. Публикации. По теме диссертации опубликовано 15 работ Объем и структура диссертации. Работа изложена на 175 страницах машинописного текста, содержит 63 таблицы, 27 рисунков. Она состоит из введения, обзора литературы, 4 экспериментальных глав, выводов, списка литературы, включающего 266 наименований, из них 39 на иностранных языках.

выводы.

1. В листьях и плодах брусники, клюквы и черники идентифицированы 5 макро- (К, Са, 8, Р, С1), 25 микроэлементов (Ва, Вг, V, Бе, I, Сс1, Со, Ьа, Мп, Си, Мо, Аб, N (1, №, 8п, ЯЬ, РЬ, 8е, 8 г, 8Ь, Т1, Сг, Се, Ъл, Ъх) и 21 соединение, из которых 11 флавонолов (лютеолин, цинарозид, кемпферол, астрагалин, кверцетин, изокверцитрин, гиперозид, кверцитрин, рутин, мирицетин, окси-коцин), 5 гидроксикоричных кислот (п-кумаровая, кофейная, феруловая, хло-рогеновая и неохлорогеновая), 3 антоциана (дельфинидин, цианидин, маль-видин), 1 фенологликозид (арбутин) и 1 иридоид (асперулозид). Отмечены близость химического состава и специфические особенности объектов исследования, обусловленные видовой и морфологической принадлежностью образцов.

2. В результате изучения 71 образца фитосырья и почв, собранных в 10 областях (Архангельской, Брянской, Владимирской, Вологодской, Ивановской, Кировской, Костромской, Московской, Тверской и Ярославской) и 3 республиках РФ (Карелия, Коми, Саха) установлено, что накопление 5 групп природных соединений и большинства элементов в большей мере определялось видовыми особенностями растений и в меньшей степени зависело от места произрастания.

3. Разработаны методики спектрофотометрического количественного определения флавоноидов, гидроксикоричных кислот и арбутина в объектах исследования, отличающиеся экспрессностью, низкой трудозатратностью, достоверной воспроизводимостью и низкой относительной погрешностью.

— 1484. Отклонение в содержании отдельных химических элементов в фито-образцах значительно подвержено влиянию локальных антропогенных (промышленность) или естественных (месторождения) факторов и в меньшей степени оно зависело от региона произрастания, для отдельных групп природных соединений характерна обратная закономерность. Так, различие в элементном составе образцов из разных регионов России менее наглядно, чем в образцах из восточных и из юго-западных промышленных районов Вологодской области. Отмечено, что накопление арбутина и полиокисляемых веществ происходило более интенсивно в сырье, собранном в северных регионах, а гидроксикоричных кислот — в южных.

5. При сравнительном анализе обнаружено, что в бруснике и особенно в чернике набор и содержание отдельных групп фенольных соединений богаче, чем в клюкве. Состав флавоноидов, гидроксикоричных кислот и фенолог-ликозидов в плодах и листьях (побегах) идентичен (для отдельного вида), а содержание — более высокое в листьях (побегах).

6. При рентгено флуоресцентном анализе определено, что содержание отдельных токсичных элементов в плодах изучаемых растений близко к предельно допустимым концентрациям, а в побегах, стеблях, листьях и подземных органах несколько выше ПДК, принятых для БАД и пищевых продуктов. Во временном промежутке в пять лет в объектах исследования отмечено повышение содержания токсичных элементов, главным образом кадмия и свинца.

8. На основании проведенного нами фотохимического исследования растений составлены инструкция по сбору плодов черники, проекты фармакопейных статей предприятия на плоды и листья черники, экстракт плодов черники жидкий (полуфабрикат) и экспериментальный препарат «Валеро-мил» в форме настойки, изменение к ГФ XI, вып. 2, ст. 27 «Листья брусники». В проектах статей и изменении к ГФ XI числовые показатели предложено определять с использованием разработанных нами методик.

9. В результате определения параметров токсичности густые экстракты плодов брусники, клюквы и черники по основным показателям ГОСТ 12.1.007−76 отнесены к 4 классу опасности «Вещества малоопасные».

10. При проведении фармако-биохимических исследований выявлена седативная, актопротекторная и противоболевая активность и возможный механизм действия экстрактов изучаемых растений, среди которых наиболее выраженным и гармоничным действием обладал экстракт плодов черники.

11. При сравнительном исследовании фармакологических свойств экстрактов черники, валерианы, их смеси и диазепама установлена эффективность сочетания экстрактов плодов черники густого и экстракта корневищ с корнями валерианы густого черники и валерианы, которая нормализовала гормонально-медиаторный баланс при стрессе, обладала седативной и ан-ксиолитической активностью (без угнетающего действия на двигательные функции), проявляла умеренную, но устойчивую адаптогенную активность.

12. На основе комбинации экстрактов черники и валерианы разработан экспериментальный препарат «Валеромил» в трех лекарственных формах (сироп, настойка, экстракт жидкий). Для их получения в заводских условиях и стандартизации составлены опытно-промышленные регламенты и проекты фармакопейных статей предприятия. Произведено 6 экспериментальных серий препарата на ГП ВО «Вологодская фармацевтическая фабрика». При предварительной апробации «Валеромила» получены положительные результаты.

Заключение

.

В результате проведенных исследований нами установлено, что смесь экстрактов корней с корневищами валерианы и плодов черники, обладает се-дативной и анксиолитической активностью (без угнетающего действия на двигательные функции), нормализует гормонально-медиаторный баланс при стрессе и проявляет умеренную, но устойчивую адаптогенную активность.

Механизм действия комбинации, по-видимому, реализуется за счет повышения порога чувствительности центров головного мозга, детерминирующих стресс-реакцию, и снижения активности гипофизарно-надпочечниковой системы.

Полученные данных об эффективности сочетания экстрактов плодов черники и корней с корневищами валерианы послужили основой для разработки экспериментального препарата, названного нами «Валеромил» в форме сиропа, настойки и экстракта. Изложение материала по его разработке не входило в рамки диссертационной работы, но является ее важным следствием. Поэтому обозначим отдельные моменты.

Нами уменьшена разовая доза густого экстракта черники, введены стабилизаторы для сохранения лабильных природных соединений (лабораторные исследования проводились со свежеприготовленными экстрактами). На рисунке 6.1 представлена аппаратурная схема получения сиропа «Валеромил».

Рис. 5.1. Аппаратурная схема производства сиропа Валеромил.

Нами разработаны опытно-промышленные регламенты, ФСП и выпущены на ГП ВО «Вологодская фармацевтическая фабрика» экспериментальные серии препарата, «Валеромил», в виде сиропа, настойки и экстракта. Их предварительная апробация на кафедре терапии ЯГМА под руководством профессора A.A. Зотова дала положительные результаты (см. приложение).