Фармакотоксикология леномака

1.1.

Актуальность темы

В комплексе мероприятий по борьбе с желудочно-кишечными болезнями у молодняка сельскохозяйственных животных бактериальной этиологии широкое применение нашли антибиотики, сульфаниламиды, нитрофураны и др. (В.А.Макаровский с соавт., 1982; А. С. Егоров, 1986). Однако длительное и бессистемное применение их в животноводстве привело к появлению резистентных штаммов микроорганизмов к ним. Такое положение с фармакологическими препаратами обуславливает разработку новых комбинированных препаратов, способствующих повышению эффективности лечения животных.

Известно, что широкий спектр антимикробной активности препаратов, как правило, достигается путем комбинирования нескольких лекарственных препаратов на базе данной группы химических веществ. Сочетание различных химических структур в композиции позволяет достичь си-нергический эффект или получить препараты с новыми полезными свойствами (А.Н.Кудрин, 1975; К. М. Лакин, 1986; В. Ф. Ковалев с соавт., 1988; В. Д. Соколов, 1990,1997; В. Г. Кузин с соавт., 1991; Т. Н. Соколова с соавт., 1993; М. Д. Машковский, 1993; Р. Уеш^ еХ а1&bdquo- 1983; М. АсМу, а а1., 1985, 1988 и др.)

В этом плане большой научный и практический интерес представляет ле-номак, являющийся комбинацией нитазола (2-ацетиламино-5-нитротиазола) с антибиотиками (эритромицином и левомицетином). При этом антимикробная активность нитазола при сочетании с антибиотиками значительно усиливается (К.М.Лакин, 1981,1986; А. Я. Цыганенко с соавт., 1990; Т. Н. Соколова с соавт., 1993 и др.). Нитазол, являясь производным 5-нитро-2-ацетил-аминотиазола, широко применяется в медицине для лечения протозойных инфекций. Радиосенсибилизирующее действие в отношении гипоксических клеток обуславливает его применение при радиотерапии раковых новообразований. Этот препарат находит применение при лечении инфекций, вызванных анаэробными и аэробными микроорганизмами, вирусами. Хороший эффект нитазол дает при лечении пародонтоза, язвенной болезни желудка, розовых угрей и некоторых других заболеваний (А.А.Заволокин, 1988; Т. В. Ушакова, 1992; и др.). Однако, в ветеринарной практике препараты на основе нитазола недостаточно изучены. Нет сведений о фармакологических и токсикологических свойствах этих препаратов и целесообразности их применения в ветеринарии.

3.9. Выводы

1. Леномак — комплексный инъекционный препарат, состоящий из левомицетина, нитазола и эритромицина в соотношении 3,5:2,2:4,3, растворенных в полиэтиленоксиде 400, является вязкой жидкостью с удельным весом 1,14 г/см3 от темно-желтого до красновато-желтого цвета без запаха, горького вкуса.

2. Минимальная бактериостатическая концентрация леномака в отношении эшерихий составляет 62,5 мкг/мл, сальмонелл — 125,0 мкг/мл, стафилококков — 31,25 мкг/мл, пастерелл — 62,5 мкг/мл, синегнойных палочек — 125,0 мкг/мл. Бактерицидная активность леномака в 2−3 раза превышает бактериостатическую. ФИК-индекс препарата составляет 0,124−0,234.

3. Леномак является малотоксичным препаратом. ЛД50 леномака для мышей составила 5748,0 мг/кг, а для белых крыс — 6728, мг/кг.

4. Леномак обладает слабовыраженными кумулятивными свойствами. Коэффициент кумуляции леномака составляет 5,09.

5. Леномак не обладает эмбриотоксическим и тератогенным действием, а также аллергенными свойствами.

6. Многократное применение леномака в течение 15 суток клинически здоровым поросятам не оказывает отрицательного влияния на морфологические и иммунобиохимические показатели крови, улучшает эритропоэз, незначительно усиливает лейкоцитоз, повышает уровень общего белка и, особенно, гамма-глобулинов. Препарат не оказывает отрицательного влияния на качество мяса и мясопродуктов кроликов.

7. Многократное внутримышечное применение леномака поросятам в дозах, равной терапевтической, 3-х и 5-ти кратно превышающей терапевтическую дозу, не оказывает негативного влияния на клиническое состояние, поведение и аппетит животных, не снижает скорости роста поросят.

8. Применение леномака в дозе 0,2 мл/кг массы тела внутримышечно один раз в сутки в течение 2−3 дней больным колибактериозом поросятам способствовует их выздоровлению. Терапевтическая эффективность леномака при колибактериозе составила 96,0%.

9. Леномак в дозе 0,2 мл/кг массы тела внутримышечно один раз в сутки в течение трех дней способствовует выздоровлению больных сальмонеллезом поросят. Терапевтическая эффективность препарата при сальмонеллезе составила 96, 4%.

ЗЛО. Практические предложения

1. Леномак для терапии колибактериоза и сальмонеллеза поросят следует применять внутримышечно в дозе 0,2 мл/кг массы тела один раз в сутки в течение 2−3 дней.

2. Данные по леномаку вошли в Наставление по применению леномака № 13−5-2/1209 от 09.04.98 г. и в «Методические указания по использованию нитазол содержащих препаратов в ветеринарии», утвержденные Департаментом ветеринарии 23.06.97 г.

2.7.Заключение

Анализ доступной литературы по фармакотоксикологии нитазола, его комбинаций с антибиотиками и сульфаниламидами показывает, что в перспективе в борьбе с микроорганизмами будущее принадлежит комбинированным препаратам, обладающим при взаимодействии их составных частей аддитивным и синергидным эффектами. Одним из таких комбинированных препаратов является комбинация нитазола с такими антибиотиками, как эритромицин и левомицетин. Однако эта комбинация нитазола с антибиотиками изучена крайне недостаточно, не дана соответствующая фармакотоксикологическая оценка леномаку.

В первую очередь, из данных обзора литературы видно, что сравнительно недавно ученые обратили внимание на производные 2-амино-5-нитротиазола, ацилированные по аминогруппе карбоновыми кислотами, а также на 5-нитро-2-ацетиламинотиазол (нитазол), который обладая приличной бактериостатической и бактерицидной активностью широко применяется в медицине.

В настоящее время можно отметить, что неплохо изучены и разработаны физико-химические методы анализа нитазола. При этом дана общая характеристика препарата, разработана идентификация, а также количественное определение нитазола титрометрическими, фотометрическими, полярографическими и хроматографическими методами. Проведенные в последние годы фармакологические исследования выявили ряд новых лечебных эффектов, значительно расширивших применение нитазола в медицинской практике. Препарат, помимо протозооцидного, проявляет антабу-соподобное и радиосенсибилизирующее действие, находит применение при лечении инфекций, вызванных анаэробными и аэробными микроорганизмами, вирусами, дает хороший терапевтический эффект при лечении язвенной болезни желудка и двенадцатиперстной кишки, розовых угрей и некоторых других заболеваний.

Наряду с положительными эффектами описано и побочное действие этих препаратов, такое как токсичекое поражение ЦНС (R.K.Kusumi, 1980; I.G.Bartlett, 1981), угнетение кроветворной функции костного мозга (I.G.Bartlett, 1981), буллезная токсикодермия (К.А.Шмелев, 1971) и другие, часто не менее серьезные нарушения нормального физиологического состояния человека. Описан случай со смертельным исходом (C.M.White et al., 1980), вызванный приемом терапевтических доз метронидазола. Все это в конечном итоге связано с иррациональным применением изучаемых препаратов. В источниках литературы имеются противоречивые данные, касающиеся отдельных констант препаратов.

Широкое применение и относительная токсичность нитазола и метронидазола, по мнению А. А. Заволокина (1988), требует создания методик, пригодных для контроля концентраций препаратов в биологических жидкостях, особенно это актуально в отношении нитазола. Более высокая активность нитазола вне организма по сравнению с метронидазолом и, наоборот, низкая в организме, на наш взгляд, связана с недостаточной биологической доступностью препарата, в частности, с плохой растворимостью в воде. Вопросы повышения биодоступности этого лекарственного средства также заслуживают внимания.

Относительно сочетанного применения нитазола следует отметить, что за последние 5−6 лет в медицине появились серии работ, свидетельствующие об усилении антибактериальной активности нитазола при его комбинированном применении с антибиотиками, гормонами, химическими препаратами и даже с физиотерапией. Однако отсутствуют сведения в медицинской практике о препаратах, содержащих нитазол. В ветеринарной практике такие сведения есть. К ним относятся препараты нитофур (Н.А.Коблова с соавт., 1990), биофузол (В.А.Ибрагимов с соавт., 1991) и нифулин (Г.П.Задорожная, 1984; В. Ф. Ковалев с соавт., 1988), которые содержат нитазол и успешно применяются против гистомоноза индеек, желудочно-кишечных болезней свиней и птиц.

Понятно, что указанный арсенал антимикробных средств с использованием нитазола никак не может удовлетворить потребность ветеринарной службы. Поэтому вполне оправданы изыскания комбинированных сочетаний нитазола с наиболее эффективными антибиотиками, повышающих эффективность лечения животных и уменьшающих расход антимикробных средств.

Как показывают многолетние наблюдения (В.Ф.Ковалев с соавт., 1988; В. Д. Соколов, 1990), принцип подбора сочетанных средств состоит в использовании разнопланового действия на микроорганизмы двух или трех компонентов лекарственной смеси. Наиболее приемлемым методом, повышающим эффективность химиотерапии бактериальных инфекций и замедляющим развитие резистентности у микроорганизмов, является применение рационально подобранных сочетаний двух или нескольких антибактериальных препаратов. Использование комбинированных препаратов, обладающих по сравнению с монопрепаратами, как правило, широким спектром антимикробного действия, целесообразно при желудочно-кишечных заболеваниях бактериальной этиологии. Это обусловлено синергидным или аддитивным действием направленно подобранных компонентов в отношении грамположительных и грамотрицательных энтеробактерий, включая сальмонеллы и эшерихии.

Следует иметь в виду (В.Ф.Ковалев с соавт., 1998), что произвольная комбинация антибактериальных соединений без учета фармакологической или фармацевтической совместимости может быть не только бесполезной, но и в ряде случаев приводить к усилению токсичности лекарств, увеличению риска их побочного действия. Поэтому, для успешного лечения животных можно использовать готовые, специально изученные и прошедшие апробацию сочетания химиопрепаратов в виде удобных в применении лекарственных форм промышленного изготовления. Однако в ветеринарии отсутствует системный подход к изучению фармакотоксикологии нитазолсодержащих препаратов, в том числе комбинаций нитазола с антибиотиками.

Следовательно, необходимо проведение всесторонних экспериментальных исследований по изучению специфической активности, острой, подострой и хронической токсичности, фармакокинетики, аллергенных свойств, кожно-резорбтивного действия, эмбриотоксического и тератогенного действия, иммунореактивности и других свойств леномака для терапии массовых желудочно-кишечных болезней бактериальной этиологии у поросят.

Исходя из вышеизложенного, задачами настоящей работы являются:

Изучение оптимальных соотношений в леномаке нитазола, эритромицина и левомицетина;

Экспериментальное изучение фармакотоксикологии леномака (определение его антимикробной активности, токсичности, иммуноген-ности, аллергенности, фармакокинетики, тератогенности, кожно-резорбтивного действия с учетом качества продуктов убоя);

Определение терапевтической эффективности леномака при массовых желудочно-кишечных болезнях бактериальной этиологии у поросят.

3. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

3.1. Материалы и методы исследований

Работа выполнена в 199J-199J3 годах в ВГНКИ ветпрепаратов, научно-производственном предприятии «Агрофарм», Всероссийском НИВИ патологии, фармакологии и терапии, Воронежской областной ветеринарной лаборатории, свиноводческих хозяйствах Воронежской и Харьковской областей.

Лабораторные опыты проведены на белых мышах с массой тела 18−22 г, белых крысах с массой тела 170−250 г, морских свинках с массой тела 250 300 г и кроликах массой тела 2,5−3,0 кг. Изучение оптимального соотношения компонентов в леномаке в опытах in vivo, общего действия леномака на организм и лечебной эффективности препарата при желудочно-кишечных болезнях поросят проведены в специализированных свиноводческих хозяйствах.

При проведении опытов на лабораторных и сельскохозяйственных животных соблюдали требования к врачебно-биологическому эксперименту (Фролов И.Т., 1965) по постановке контроля, подбору аналогов, одинаковому кормлению и содержанию животных в период исследований.

Объем экспериментальных и научных исследований представлен в таблице 1.

Изучение оптимального соотношения компонентов композиции ни-тазола с эритромицином и левомицетином, определение синергидности комбинаций in vitro проводили определением активности препарата с различным соотношением компонентов при титровании методом серийных разведений, вычислении и сравнении фракциональной ингибирующей концентрации (ФИ К) и суммы ФИ К (ФИК-индекс).

Изучение оптимального соотношения компонентов в леномаке в опытах in vivo проводили при определении эффективности применения препарата с различным соотношением нитазола, эритромицина и левомицетина для лечения колибактериоза у поросят.

Антимикробную активность леномака изучали методом серийных разведений в отношении референтных и полевых штаммов микроорганизмов — основных возбудителей желудочно-кишечных болезней у поросят, ти-пированных по морфологическим, культуральным, биохимическим и серологическим свойствам. Минимальную бактериостатическую концентрацию (МБсК) выявляли в МПБ, минимальную бактерицидную концентрацию (МБцК) путем высева из пробирок с МПБ на плотные питательные среды. Результаты опытов учитывали в течение 7 суток.

Острую токсичность леномака изучали в опытах на белых мышах и белых крысах при подкожном введении препарата. Среднюю дозу эффекта определяли аналитическим способом Спирмена-Кербера (Г.Ф.Лакин, 1990). Величины ЛД16 и ЛД84 находили графически.

Подострую токсичность леномака изучали на белых крысах при длительном подкожном введении препарата в дозах ориентировочно-терапевтической, в 5 и в 10 раз превышающих ориентировочно-терапевтическую. По результатам опыта по изучению подострой токсичности с использованием ЛД50, полученной при определении острой токсичности, вычисляли коэффициент кумуляции (А.А.Ступников, 1975).

Эмбриотоксическое и тератогенное действие леномака изучено по методике Шицковой А. П. (1977).

Раннюю и позднюю резорбцию, общую эмбриональную смертность определяли по формулам, предложенным Малашенко A.M., Егоровым И. К. (1967).

Изучение кожно-резорбтивного действия леномака проводили на белых крысах, морских свинках и кроликах методом накожных аппликаций при однократном и многократном нанесении, втирании и втирании на мазевой основе. Для выявления резорбции препарата с поверхности кожи кроликов и морских свинок использовали метод с трепановым синим, а на крысах — метод погружения хвоста в растворы препарата различной концентрации.

Аллергенность леномака определяли с помощью конъюнктивальной (Г.П.Трубецкая, 1976) и кожнопровокационной пробы (О.Л.Алексеева, Л. А. Дуева, 1978).

Влияние леномака на качество мясопродуктов изучали слепым методом по 9-ти бальной шкале для органолептической оценки качества вареного мяса и бульона, разработанной ВНИИМП (1985).

Общее действие леномака при подкожном введении оценивали по клиническому состоянию, морфологическим, биохимическим и иммунологическим показателям крови.

Кровь для исследований брали у поросят из хвостовых сосудов в утреннее время до кормления.

В крови и сыворотке крови крыс и поросят определяли количество эритроцитов, лейкоцитов, гемоглобина, лейкограмму общепринятыми методами, общий белок — рефректометрически, фракции белка — по Оллу и Маккорду (С.А.Карпюк, 1962) или электрофорезом на пластинках с агароз-ным гелем. В сыворотке крови определяли бактерицидную активность (О.В.Смирнова, Т. А. Кузина, 1966), комплементарную активность (Г.Ф.Вагнер, 1963), содержание лизоцима (О.В.Бухарин с соавт., 1974), циркулирующие иммунные комплексы (Д.В.Белокриницкий, 1987), общие иммуноглобулины набором фирмы «Лахема», концентрацию общих липидов, триглицеридов, мочевины, глюкозы, креатинина, активность аспартати аланинаминотрансферазы (АсАТ и АлАТ), щелочной фосфатазы — наборами фирмы «Лахема», билирубин, креатинин — набором фирмы «Коне» (Финляндия), молочную кислоту (И.С.Балаховский, Ю. В. Ниточин, 1973), пировиноградную кислоту (П.М.Бабаскин, 1976), холестерин (В.В.Меньшиков, 1973).

Определение левомицетина в биологическом материале проводили методом, описанным Д. С. Гров и В. А. Рендалл (1958) с некоторыми модификациями. В частности, для диазотирования использовали 0,5% раствор монокалиевой соли 2-амино-8-нафтол-2, 4-дисульфокислоты. Поглощение окрашенного раствора определяли на спектрофотометре СФ-46 при 520 нм. При использовании указанного реактива минимальная определяемая концентрация левомицетина была менее 1 мкг/мл. Калибровочный график строили по стандартному образцу левомицетина с активностью 985 мкг/мг, полученном в ВГНКИ ветпрепаратов.

Определение остаточных количеств эритромицина проводили микробиологическим методом диффузии в агар. При проведении исследований руководствовались «Методическими указаниями по определению остаточных количеств антибиотиков в продуктах животноводства» № 3049−84 от 29.06.84 г. и другими рекомендациями, содержащимися в литературе (Д.С.Гров, В. А. Рендалл, 1958; В. Ф. Ковалев с соавт., 1988). Тест-культура Вас. cereus var. mycoides HB и стандарт мутности были получены в ГИСК им. Л. А. Тарасевича, а рабочий стандарт эритромицина с активностью 910 мкг/мг (PCO 10.494 185−16−92) — из ВГНКИ ветпрепаратов.

Определение нитазола в биологическом материале проводили с использованием методов тонкослойной хроматографии и УФ-спектроскопии (Н.А.Коблова с соавт., 1990). УФ-спектры снимали на спектрофотометре СФ-46 при длине волны 440 нм. Для тонкослойной хроматографии применяли пластинки «Silufol UV-254» .

Определение стабильности леномака при хранении препарата определяли по следующим показателям: внешний вид, подлинность, массовая доля левомицетина, эритромицина и нитазола, безвредность, пирогенность, стерильность и наличие механических включений через 3, 6, 9, и 12 месяцев после изготовления.

Внешний вид определяли визуально, просмотром препарата в чашке Петри на фоне белой бумаги.

Подлинность леномака исследовали с использованием характерных качественных реакций на компоненты препарата: левомицитин, эритромицин и нитазол.

Массовую долю компонентов определяли колориметрически на фотометре КФК-3: левомицетина — при длине волны 500нм методом, основанным на образовании окрашенного продукта со спиртовым раствором I-нафтолаэритромицина — при длине волны 480нм методом, основанным на образовании окрашенного продукта при кипячении с раствором серной кислотыи нитазол — при длине волны 450нм методом, основанным на образовании окрашенного продукта с раствором гидроокиси натрия.

Безвредность препарата определяли при подкожном введении леномака белым мышам весом 18−20 г в дозе 0,05мл на одно животное.

Стерильность и пирогенность определяли в соответствии с требованиями ГФ XI.

Наличие механических включений изучали в соответствии с Временной инструкцией по контролю инъекционных растворов на механические включения (№ 42−3-85, утвержденной Министерством здравохранения СССР 10.10.85).

Статистическая обработка полученных данных проведена методами вариационной статистики (В.Ф.Урбах, 1975г) с использованием специальных программ на ЭВМ «Электроника МС- 585».