Биохимические и физико-химические свойства ключевой тополитической эндоглюканазы целлюлазного коплекса Chaetomium cellulolyticum

История исследования целлюлаз насчитывает уже более 50 лет. В течение этого периода важнейшим свойством, характеризующим целлюлазный комплекс, считалась его способность к глубоким осахариванию и деструкции целлюлозосодержащих субстратов (так называемая «сахаролитическая» активность). Поэтому исследования, в основном, были направлены на поиск ферментных препаратов и их продуцентов, эффективно осуществляющих гидролиз целлюлозы до глюкозы. Целлюлазы, выделенные из этих препаратов, как правило, проявляли максимальную активность в кислой среде (рН 4−5) [1], но различались по субстратной специфичности, адсорбционной способности и термостабильности [2−4].

В последнее время усилия исследователей направлены на поиск целлюлолитических ферментов, способных катализировать реакцию на поверхности целлюлозного субстрата, не приводящей к глубокой деструкции целлюлозной матрицы (для обозначения этой способности целлюлаз мы предлагаем использовать термин «тополитическая» активность) [5, 6]. Обнаружение ферментов с тополитической активностью открыло новые возможности их применения: например, для депигментации текстильных (джинсовых) изделий с целью придания им более привлекательных потребительских свойств (альтернатива традиционным химическим способам «варки», а также обработке пемзой) — для биополировки текстильных изделий с целью удаления микродефектов и ворсакак компонента моющих средств и т. д. [7, 8, 9, 10]. Важно отметить, что замена известных химических способов обработки целлюлозных материалов на ферментативные приводит к проведению процесса в более мягких условиях и уменьшает ущерб, наносимый окружающей среде.

Следует подчеркнуть, что для упомянутых выше целей предпочтительны ферменты, сохраняющие высокую активность и стабильность в условиях проведения 6 процесса — как правило, это нейтральные или щелочные значения рН и достаточно высокая температура [9, 11]. В связи с этим наиболее перспективными для использования в качестве тополитических ферментов являются так называемые «нейтральные» целлюлазы, показывающие высокую активность и стабильность при нейтральных рН (рН 6−8) и температурах 50 °C и выше. Поэтому актуальными направлениями исследований в этой области становятся поиск новых штаммов-продуцентов «нейтральных» целлюлаз, получение мутантных штаммов при помощи методов классической генетики или генной инженерии, а также выделение и исследование свойств гомогенных ключевых тополитических ферментов, входящих в состав ферментных комплексов, продуцируемых перспективными штаммами-продуцентами.

В последнее десятилетие появилось еще одно прогрессивное направление развития энзимологии целлюлаз, основанное на создании монокомпонентных тополитических ферментных препаратов для обработки ткани, использования в составе моющих средств и других целей. Такие препараты получают клонированием генов специально подобранных индивидуальных тополитических ферментов в штаммы-суперпродуценты (Aspergillus, Trichoderma, Bacillus и др.), и они, в отличие от полных целлюлазных комплексов, дают возможность максимально эффективно обрабатывать текстильные изделия на основе природных волокон, не приводя к потери их прочности.

Ранее [12] нами совместно с ИБФМ РАН был осуществлен скрининг продуцентов «тополитических» целлюлаз, высокоактивных и стабильных при нейтральных и щелочных рН, в результате чего был найден обладающий такой способностью мицелиальный гриб Chaetomium cellulolyticum, целлюлазный комплекс которого ранее не исследовался Цель настоящей работы заключалась в выделении основных компонентов целлюлазного комплекса С. cellulolyticum, выборе ключевого фермента, обладающего наиболее высокой топологической активностью и стабильностью при нейтральных и щелочных рН и создании на его основе монокомпонентного ферментного препарата.

Для достижения поставленных целей необходимо было решить следующие задачи:

• Разработать схему выделения и очистки «мажорных» компонентов целлюлазного комплекса С. сеИиЫуйсит, обладающих тополитической активностью.

• Исследовать биохимические и каталитические свойства выделенных компонентов.

• Изучить влияние рН на активность и стабильность полученных гомогенных целлюлолитических ферментов С. сеПиШуИсит.

• Исследовать тополитические свойства выделенных компонентов и выбрать из них наилучший (ключевой) с точки зрения высокой тополитической активности и стабильности при нейтральных и щелочных рН.

• Изучить первичную аминокислотную последовательность и структуру гена, кодирующего ключевой фермент. Используя методы генной инженерии, получить на его основе рекомбинантный фермент.

• Исследовать биохимические и физико-химические свойства рекомбинантного фермента и сравнить их со свойствами нативного фермента.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ ГЛАВА 1. ЦЕЛЛЮЛАЗЫ В БИОТЕХНОЛОГИИ.

Биоконверсия возобновляемого растительного сырья в топливо, кормовые и пищевые продукты, полупродукты для химической и микробиологической отраслей промышленности является традиционной областью применения целлюлолитических ферментов. Важнейшим условием биоконверсии является глубокая деструкция (осахаривание) обрабатываемого субстрата под действием ферментов [13−15]. В последнее время при исследовании свойств целлюлаз обнаружились новые перспективные возможности применения этих ферментов, связанные с их способностью воздействовать на поверхность нерастворимых субстратов без глубокой деструкции их основной (трехмерной) матрицы. К этим областям относятся: 1) биополировка поверхности текстильных изделий [16−21]- 2) ферментативная депигментация окрашенных хлопчатобумажных и льняных материалов [8, 9, 22]- 3) карбонизация натуральных волокон белковой природы, например, удаление растительных примесей из шерсти [23]- 4) биоотбеливание целлюлозной массы в процессе ее первичного производства [24−26]- 5) отбеливание целлюлозной массы в ходе ее вторичной переработки (удаление следов тонеров, чернил и других загрязнений с поверхности макулатуры) [27−36]- 6) направленное изменение реологических и дренажных свойств целлюлозы [37−39]- 7) использование целлюлаз в составе моющих средств [40].

Целлюлазы, используемые по этим направлениям, должны обладать тополитическими свойствами, т. е. способностью к «мягкому» гидролизу субстрата, когда происходит лишь модификация его поверхности без глубокой деструкции целлюлозной матрицы [41].

Предполагают, что тополитическое ферментативное воздействие связано с особой специфичностью Р-гликаназ, так называемой топоферментной (тополитической) активностью [42], и осуществляется, по-видимому, посредством некоторых ферментов эндодеполимеразного типа [41−43]. Под топоферментной активностью подразумевается способность фермента к воздействию на определенный структурный участок субстрата. Например, в случае биополировки ткани, а также при биодепигментации окрашенной целлюлозной матрицы [41, 45−50] топоферментная активность проявляется в гидролизе поверхностных волокон нерастворимого субстрата [27−36,42], что приводит к удалению ворса (биополировка) или индиго (депигментация).

Надо отметить, что для депигментации хлопковой джинсовой ткани целлюлазы используются уже более 10 лет [51−52]- обработка других хлопчатобумажных изделий с помощью целлюлаз, так называемая «биоотделка», известна с конца восьмидесятых годов [17−21]. С помощью последней в текстильной промышленности добиваются высококачественной и оригинальной отделки изделий на основе льна, хлопка и вискозного волокна.

При обработке различных текстильных материалов важно подобрать фермент, применение которого позволит избежать потери прочности изделий, вызванной «аморфизацией» волокон [53]. Выбор фермента во многом определяется процентным содержанием аморфной и кристаллической целлюлозы в волокне [54−55]. Так, например, для изделий из льна или вискозы, волокна которых характеризуются более низким содержанием кристаллических участков по сравнению с хлопком, рекомендуется использовать обогащенные эндоглюканазами ферментные препараты и более мягкие условия обработки. Обнаружено, что ферментные препараты, обогащенные целлобиогидролазами, являются более «агрессивными» по отношению к текстильным волокнам на целлюлозной основе [17]. Известны монокомпонентные целлюлазные препараты, высокоэффективные при депигментации хлопковой ткани, окрашенной индиго [56]. В их состав входят эндоглюканазы 12 семейства (эндоглюканаза Ш из Т. reesei [57]) и 45 семейства (эндоглюканаза V из Humicola insolens [49]).

Сохранение прочности волокон важно и при создании детергентных композиций. Установлено, что лучше всего для этой цели подходят эндоглюканазы семейств 7, 12 и 45 из микроорганизмов Fusarium, Myceliophthora, Humicola и Trichoderma, обладающие низкой гидролитической активностью (удаляют только микрофибриллы из волокон) с сохранением прочностных характеристик волокна [56].

Для эффективной депигментации ткани, помимо правильно подобранного компонентного состава используемых ферментных препаратов, необходимо, как уже указывалось выше, чтобы фермент сохранял тополитическую активность в условиях проведения процесса (как правило, это нейтральные значения pH и достаточно высокая температура). Поэтому так называемые «нейтральные» целлюлазы, высокоактивные и стабильные при нейтральных pH (pH 6−8) и температурах 50 °C и выше, являются наиболее перспективными для использования в текстильной промышленности, а скрининг продуцентов «нейтральных» целлюлаз становится актуальным направлением исследований в этой области.

ГЛАВА 2. ГРИБНЫЕ И БАКТЕРИАЛЬНЫЕ ЦЕЛЛЮЛАЗНЫЕ СИСТЕМЫ. ПРОДУЦЕНТЫ «НЕЙТРАЛЬНЫХ» ЦЕЛЛЮЛАЗ.

В природе процесс деградации целлюлозы осуществляется, в основном, грибами и бактериями. Среди наиболее хорошо охарактеризованных целлюлазных систем можно выделить гриб белой гнили Phanerochaete chrysosporium (Sporotrichum pulverulentum) [58−59] и грибы мягкой гнили Fusarium solani [60], Penicillium funiculosum [61−62], Talaromyces emersonii [63−65], Trichoderma koningii [66−69] и T. reesei [70]. Среди анаэробных грибов можно выделить гриб Neocallimastix frontalis, обнаруженный в желудке быка, который продуцирует внеклеточную целлюлазную систему, эффективно катализирующую гидролиз кристаллической целлюлозы [71−72]. Среди аэробных целлюлолитических бактерий наиболее хорошо изучены Cellulomonas sp. [73], Cellvibrio sp. [74], Microbispora bispora [75] и Thermomonospora sp. [76−77]. Примерами анаэробных целлюлолитических бактерий являются Acetivibrio cellulolyticus [78−79], Bacteroides cellulosolvens [80], Bacter. succinogenes [81], Clostridium thermocellum [82−83], Ruminococcus albus [84−85] и Bacillus sp. [86−87].

Надо отметить, что бактерии, по сравнению с грибами, продуцируют гораздо меньшие количества целлюлолитических ферментов, и их целлюлазные системы отличаются друг от друга. Так, грибы секретируют три типа целлюлаз: эндоглюканазы, целлобиогидролазы и (З-глюкозидазы (целлобиазы), действующие в синергизме, но не ассоциированные друг с другом. Целлюлолитические бактерии секретируют, в основном, эндоглюканазы, большинство из которых проявляет низкую активность по отношению к кристаллической целлюлозе [88−96]. «Грибоподобные» прокариоты, такие как актиномицеты и относящиеся к ним коринобактерии (Cellulomonas), гидролизуют целлюлозу по механизму, схожему с грибным, когда их целлюлолитические ферменты не ассоциированы в культуральной жидкости [97]. Наоборот, для многих анаэробных бактерий было обнаружено, что их целлюлазные компоненты ассоциированы в мультимолекулярные комплексы (целлюлосомы), причем их четвертичная структура, по-видимому, является ключевым фактором, определяющим степень эффективности гидролиза кристаллической целлюлозы [98].

Конечным продуктом гидролиза целлюлозы является глюкоза, которая широко используется в различных отраслях промышленности (топливная, пищевая, химическая и т. д.). В связи с этим на протяжении нескольких десятилетий усилия исследователей были направлены на поиск ферментных препаратов и их продуцентов, эффективно осуществляющих гидролиз целлюлозы до глюкозы или, другими словами, обладающих высокой «осахаривающей» способностью. Целлюлазы, отвечающие этим требованиям, имели, как правило, кислый рН-оптимум (рН 4−5) и высокую адсорбционную способность на кристаллической целлюлозе [1−4]. Наиболее эффективными продуцентами таких ферментов являлись грибы родов Trichoderma, Penicillium, Aspergillus и Humicola [99−105].

В последние годы в связи с использованием целлюлазных препаратов для отбеливания бумаги, обработки текстильных изделий, производства моющих средств с биодобавками все более актуальной задачей становится получение целлюлаз с новыми технологическими свойствами, активных и стабильных при нейтральных и щелочных значениях рН среды.

Известно, что у анаэробных и аэробных бактерий максимальная активность целлюлаз наблюдается в диапазоне рН 5,5−7,5, оптимум действия целлюлаз базидиомицетов — при рН 3,9−5,5, микромицеты наиболее активно проводят разрушение целюлозы при рН среды от 4,3 до 8 [106]. Среди микромицетов целлюлазы с оптимумом рН в нейтральной и щелочной областях обнаружены у представителей родов Humicola [107−108], Acremonium [109], Trichoderma [110], Aspergillus, Bipolaris, Neosartorya [108], Chaetomium [111]. Так, например, H. insolens продуцирует пять эндоглюканаз, показывающих оптимумы активности в диапазоне рН 7−8,5, и две целлобиогидролазы, имеющие рН-оптимумы 5,5 и 9,0 [107]- одна из эндоглюканаз Т. reesei с молекулярной массой 25 кДа (EG Ш) имеет рН-оптимум 5,8 [110]- Ch. thermophile var. coprophile продуцирует две целлобиогидролазы, проявляющих максимальную активность при рН 5,8 и 6,4 [111].

У бактерий целлюлазы с нейтральным и щелочным рН-оптимумом найдены у представителей родов Bacillus [86−87], Thermotoga [112], Fibrobacter [94, 113−114], Ruminococcus [115], Clostridium [116, 117−122], Pseudomonas [123] и некоторых других [124]: например, В. subtilis продуцирует нейтральную эндоглюканазу с оптимумом активности при рН 6 [87]- Bacillus sp. N-4 продуцирует щелочную эндоглюканазу с широким оптимумом активности в диапазоне рН от 6 до 10,5 [87]- R. albus продуцирует целлобиогидролазу с рН-оптимумом, равным 6,8 [115]- Т. maritima секретирует целлобиогидролазу с оптимумом активности в диапазоне рН 6,0−7,5 [125].

ГЛАВА 3. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ЦЕЛЛЮЛОЛИТИЧЕСКИХ ФЕРМЕНТОВ.

3.1. Компонентный состав целлюлазных комплексов.

Грибы и бактерии секретируют во внеклеточную среду комплекс целлюлолитических ферментов, осуществляющих превращение целлюлозы до растворимых продуктов. В состав целлюлазного комплекса входят ферменты, различающиеся по специфичности: эндо-1,4-(3-глюканазы (КФ 3.2.1.4), экзо-целлобиогидролазы (КФ 3.2.1.91), экзо-1,4-{5-глюкозидазы (КФ 3.2.1.74), целлобиазы (р-глюкозидазы) (КФ 3.2.1.21) [126−127].

Эндоглюканазы — ферменты, гидролизующие внутренние связи, удаленные от концов полимерной цепи целлюлозы с образованием целлоолигосахаридов, что сопровождается существенным уменьшением степени полимеризации (СП) целлюлозы. В большинстве случаев гидролиз протекает с сохранением конфигурации расщепляемой связи и может сопровождаться трансгликозилированием. Эндоглюканазы, как правило, гидролизуют аморфные участки целлюлозы, но известны примеры эндоглюканаз, гидролизующих кристаллическую целлюлозу, как например, эндоглюканазы из грибов Т. гееьв! [128] и Т. котщи [129]. Существуют эндоглюканазы различной степени упорядоченности действия. Эндоглюканазы «менее упорядоченного» типа действия вызывают более резкое уменьшение СП субстрата, что приводит, в частности, к быстрому уменьшению вязкости растворов водорастворимых производных целлюлозы (например, Ыа-соли карбоксиметилцеллюлозы). В этом случае, образование крупных олигосахаридов не сопровождается образованием моно-или дисахаридов. Эндоглюканазы «более упорядоченного» действия одновременно с деполимеризацией отщепляют моно-, дии трисахариды и не столь существенно уменьшают СП [69].

Как правило, эндоглюканазы не способны гидролизовать целлоолигосахариды со СП меньше 4 [127]. Кинетика действия эндодеполимераз изучалась, в основном, при использовании в качестве субстратов целлоолигосахаридов с СП от 2 до 7. Активность эндоглюканаз возрастает с увеличением длины олигосахарида. Например, скорость расщепления целлопентаозы под действием эндоглюканаз из Т. iride и Р. по1а (ипг превышала скорость гидролиза целлотриозы соответственно в 40 и 1230 раз [145].

Молекулярная масса грибных эндоглюканаз находится в диапазоне 11−100 кДа, наиболее распространены эндоглюканазы с молекулярными массами от 30 до 55 кДа. Бактериальные эндоглюканазы, как правило, несколько больше грибных, их молекулярные массы выше 65 кДа [127].

Большинство известных эндоглюканаз гликозилированы, что обеспечивает защиту фермента от протеолитических ферментов [134], увеличивает его термостабильность [135−136] и, в некоторых случаях, играет важную роль в процессе адсорбции целлюлаз на нерастворимых субстратах [137]. Гликозилирование, как правило, проходит по аспарагиновым, треониновым и сериновым аминокислотным остаткам [133, 138−139].

Большая часть описанных грибных эндоглюканаз — кислые белки (pi 2,7−5,0), содержащие большое количество дикарбоновых и окси-аминокислот. Известны некоторые грибные эндоглюканазы с нейтральным pi, например, из Т. viride QM9414 (EG IV) [140], Т. reesei [99−101], Sporocytophaga myxococcoides [141] и A. fumigatus [142], имеющие pi 7,7- 7,5- 7,5 и 7,1 соответственно. Бактериальные эндоглюканазы, как правило, тоже являются кислыми ферментами с pi между 3,1 и 6,1. Известны и щелочные эндоглюканазы бактериального происхождения, например, две целлюлазы из Fibrobacter succinogenes с pi 9,2 и 9,4 [113]. pH-оптимум большинства эндоглюканаз лежит в интервале от 2,5 до 7,0, но имеются исключения, например целлюлазы из Bacillus sp. имеют рН-оптимумы 10,9 [143−144].

Температурные оптимумы эндоглюканаз колеблются от 30 до 75 °C, чаще всего, оптимум близок к 50 °C [127].

Согласно современным представлениям о специфичности действия целлюлаз эндоглюканазам (эндодеполимеразам) присущи высокие активности по отношению к КМЦ (прежде всего — высокая вискозиметрическая активность) и к ß—глюкану ячменя (а также по отношению к лихенину). Активность эндоглюканазы по отношению к кристаллической целлюлозе (например, к обезвощенному хлопку или фильтровальной бумаге «Whatman No 1») относительно низка. Кроме того, как правило, эндоглюканазы обладают более низкой по сравнению с целлобиогидролазами активностью по отношению к микрокристаллической целлюлозе (МКЦ) [145]. Встречаются эндоглюканазы, способные гидролизовать ксилан, так называемые «ксиланазыцеллюлазы». В качестве примера таких ферментов можно привести эндоглюканазы из Schizophyllum commune, Irpex lacteus [131], Cl. ihermocellum (целлюлаза E) [132] и Т. reesei (эндоглюканаза I) [133].

Эндоглюканазы могут ингибироваться как глюкозой, так и целлобиозой. В работе [146] показано, что две эндоглюканазы, полученные из Pea Epicolyls, ингибируются целлобиозой по конкурентному типу с константами ингибирования (K?) 1,74 и 0,74 мМ. Эндоглюканазы могут также ингибироваться целлобиозой по бесконкурентному и неконкурентному типам с K? в диапазоне 0,07−0,35 мМ [147].

Целлобиогидролазы отщепляют целлобиозу от восстанавливающего или невосстанавливающего концов нативной или частично гидролизованной целлюлозы, при этом уменьшение СП целлюлозы происходит существенно менее интенсивно, чем увеличение концентрации восстанавливающих Сахаров (ВС) [60, 148−149]. В отличие от эндоглюканаз, целлобиогидролазы могут гидролизовать как аморфную, так и кристаллическую целлюлозу, причем предпочтительно гидролизуют кристаллическую (хлопок, фильтровальная бумага) [127, 145]. Гидролиз целлюлозы может протекать как с обращением, так и с сохранением аномерной конфигурации расщепляемой связи. Это высокоспецифичные ферменты, гидролизующие только Р-1,4-связи.

Целлобиогидролазы выделены в гомогенном состоянии из различных источников, и их свойства изучены достаточно хорошо. Молекулярная масса большинства целлобиогидролаз лежит в пределах 30−85 кДа. Изоэлектрические точки грибных целлобиогидролаз изменяются в диапазоне 3,0−6,4. Многие целлобиогидролазы содержат в своем составе углеводы [127, 145].

Целлобиогидролазы (экзодеполимеразы) обладают низкой активностью (особенно вискозиметрической) по отношению к КМЦ, а также по отношению к ß—глюкану, поскольку карбоксильные заместители (КМЦ) или ß—1,3-связи (ß—глюкан). препятствуют атаке этих полимерных субстратов по «концевому» механизму. Активность целлобиогидролаз по отношению к МКЦ выше, чем у эндоглюканаз, поскольку эта разновидность целлюлозы обладает повышенным содержанием концевых групп, т. е. является отличным субстратом для ферментов концевого типа действия [127, 145]. Также целлобиогидролазы проявляют существенную активность по отношению к метилумбеллиферильным или и-нитрофенильным производным целлобиозы и лактозы [127, 145].

При исследовании кинетики действия целлобиогидролаз на целлоолигосахариды установлено, что продуктом реакции является, в основном, целлобиоза, причем, как и в случае эндоглюканазы, скорость реакции возрастает с увеличением СП субстрата. Целлобиогидролазы из различных источников ингибируются целлобиозой по конкурентному типу. По данным работы [150], Км для различных целлобиогидролаз варьируют в диапазоне 0,02−1,1 мМ. Отмечено [151], что целлобиогидролаза из Botryodiplodia thombromae активируется при небольших концентрациях глюкозы, однако большие концентрации глюкозы, напротив, оказывают ингибирующее действие на фермент.

Экзоглюкозидазы — ферменты, отщепляющие остатки глюкозы от концов молекулы нативной или частично гидролизованной целлюлозы с обращением аномерной конфигурации расщепляемой связи. Экзоглюкозидазы остаются в настоящее время наименее изученными из целлюлолитических ферментов. Ранее считалось, что в целлюлазных комплексах основную роль в образовании глюкозы играют целлобиаза и экзоглюкозидаза. Однако, в последнее время, после выделения и изучения свойств гомогенных эндоглюканаз, было показано, что они тоже вносят значительный вклад в образование глюкозы, что осложняет определение истинной экзоглюкозидазной активности в присутствии эндоглюканаз. Выделить гомогенную экзоглюкозидазу до сих пор удавалось лишь в редких случаях. Так, из Р. funiculosum и Sclerotium rolfsii были выделены гомогенные ферменты, охарактеризованные авторами как экзоглюкозидазы. Ферменты обладали широкой специфичностью и гидролизовали с образованием глюкозы аморфную целлюлозу, целлоолигосахариды, целлобиозу и о-нитрофенил-р-О-глюкопиранозид [145].

Целлобиазы — это разновидность ß—глюкозидаз, обладающих узкой специфичностью и гидролизующих только целлобиозу. Целлобиазы гидролизуют целлобиозу с сохранением аномерной конфигурации агликона, причем гидролиз, как правило, сопровождается трансгликозилированием [127, 145]. Молекулярная масса целлобиаз варьирует в широких пределах, например, в гомогенном состоянии получены целлобиазы с молекулярной массой около 50 кДа и молекулярной массой 100−300 кДа. Большинство целлобиаз из микроорганизмов представляют собой кислые белки с pl 3,1−5,9, однако целлобиазы mMoniliasp., Т. viride и Т. reesei имеют значение р! до 8,3. Большинство целлобиаз гликозилировано, содержание углеводов варьирует от 10 до 65% [127, 145].

Многие ß—глюкозидазы способны гидролизовать наряду с целлобиозой также и олигосахариды с более высокой СП, причем обычно их каталитическая активность уменьшается с увеличением длины олигосахарида. Некоторые ß—глюкозидазы могут катализировать расщепление как ?-1,4, так и других типов гликозидных связей. Так, целлобиаза из А. phoenicis способна гидролизовать, помимо целлобиозы, также и ß-,ß—трегалозу (ß—1,1-связь), гентиобиозу (?-1,6), ламинарибиозу (?-1,3), софорозу (?-1,2). Продукт реакции (глюкоза) ингибирует целлобиазу (Kf=0,5−16,4 мМ). Отмечается также ингибирование субстратом — целлобиозой (К-=27−41 мМ) [127, 145]. Тип ингибирования различается для целлобиаз из различных источников.

В реакциях трансгликозилирования целлобиазы ((3-глюкозидазы) осуществляют перенос глюкозного остатка на молекулу акцептора. Акцепторами могут быть как сахара, так и другие соединения (спирты, фенолы). Следует отметить, что трансгликозилирование обычно проявляется в заметной степени при достаточно высоких концентрациях акцептора [127, 145].

3. 2. Механизм действия целлюлаз.

Классическая общая схема ферментативного гидролиза целлюлозы выглядит следующим образом [126]: экзоглюкозидаза я/шт эндоглюканаза адсорбция эндоглюканаза.

-±G целлюлаз и цетло биагидр о лаза целлобиаза * G эндоглюканаза и/или целлобиогидролаза где Оп — исходная целлюлоза, вп/х — нерастворимые продукты неупорядоченного гидролиза целлюлозы со значением СП меньшим, чем у исходной целлюлозы, Ог — целлобиоза, О — глюкоза.

Рис. 1. Схема ферментативного гидролиза целлюлозы.

Собственно гидролитической стадии предшествует стадия адсорбции ферментов на поверхности нерастворимого субстрата [150]. Скорость адсорбции ферментов достаточно велика по сравнению со скоростью гидролиза, и перенос ферментов к поверхности субстрата не является лимитирующей стадией процесса расщепления целлюлозы [152−153].

Эффективность гидролиза целлюлозы зависит от сбалансированности состава целлюлазного комплекса и уровня активности компонентов, то есть от качественного и количественного состава комплекса. Основные требования к составу целлюлазного комплекса заключаются в том, чтобы он имел высокие эндоглюканазную и целлобиогидролазную активности, без которых невозможен глубокий гидролиз целлюлозы и, кроме того, необходима достаточно высокая целлобиазная активность для конверсии промежуточного растворимого продукта — целлобиозы в глюкозу [126].

Характерной особенностью компонентов целлюлазного комплекса является наличие синергизма в их действии. Синергизмом называют увеличение эффективности действия двух или несколько компонентов системы при их совместном присутствии по сравнению с суммарным (аддитивным) проявлением действия этих компонентов по отдельности [126]. Природа синергизма имеет кинетический характер и обусловлена реализацией кинетических закономерностей последовательно (или последовательно-параллельно) действующей полиферментной целлюлазной системы, когда продукт действия одного из ферментов является субстратом для другого, без каких-либо дополнительных взаимодействий между ферментами. В случае эндоглюканазы и целлобиогидролазы первый из ферментов осуществляет деполимеризацию целлюлозы и таким образом увеличивает концентрацию невосстанавливающих концов целлюлозных цепей, являющихся субстратом для второго фермента (рис. 1) [126].

Рис. 1 дает хорошее представление о схеме действия целлюлазного комплекса, но не дает никакой информации относительно молекулярного механизма функционирования отдельных ферментов. Данные по структуре ферментов, накопленные за последние годы, позволили в определенной степени объяснить «тонкий» молекулярный механизм действия этих ферментов.

Существуют два основных механизма, посредством которых гликозидазы расщепляют гликозидную связь. Эти механизмы дискриминируются стереохимическими характеристиками продуктов реакции. Ферменты, обращающие конфигурацию аномерного центра, дают продукты, отличающиеся стереохимией от исходного субстрата (например, выделение а-глюкозы из целлюлозы). Ферменты, сохраняющие конфигурацию аномерного углерода, гидролизуют, к примеру, целлюлозу с образованием {3-глюкозы в качестве продукта.

Основные принципы действия «обращающих» и «сохраняющих» ферментов хорошо известны. «Обращающие» ферменты действуют по механизму одностадийного замещения (рис. 2), при котором молекула воды атакует непосредственно аномерный центр, замещая таким образом уходящую группу. Такой механизм протекает посредством общего кислотно-основного катализа в активном центре фермента через оксикарбокатионное переходное состояние. «Сохраняющие» ферменты действуют по механизму двухстадийного замещения (рис. 3) через образование ковалентного интермедиата гликозил-фермента [154−156]. Первая стадия включает атаку аномерного центра нуклеофильной группой фермента (глутаминовый или аспарагиновый аминокислотный остаток) [157−164]. Замещение уходящей группы катализируется по общему кислотному механизму протонированным аминокислотным остатком, находящимся на противоположной стороне активного центра. Эта стадия сопровождается образованием промежуточного ковалентного ацильного интермедиата гликозил-фермента. Наличие хорошей уходящей группы указывает на то, что образование интермедиата протекает относительно быстро, поэтому гликозил-фермент накапливается. На второй стадии вода атакует аномерный центр гликозил-фермента.

Атака воды катализируется депротонированным аминокислотным остатком по общему основному механизму. В результате образуется продукт, и фермент возвращается в исходное состояние (рис. 3). Обе стадии протекают через промежуточные состояния оксикарбокатионного характера [154−156].

Таким образом, для установления механизма действия отдельной целлюлазы необходимо, с одной стороны, определение стереохимии продуктов реакции (аили ß—аномеры), а с другой стороны, выяснение ключевых аминокислотных остатков.

Для определения стереохимии продуктов гидролиза разработаны многие методы на основе оптического вращения, ГЖХ, ПМР и ВЭЖХ. [165]. Для определения «ключевых» аминокислотных остатков самыми распространенными методами являются сайт-направленный мутагенез и химическая модификация. Методом направленного мутагенеза было, например, установлено, что аспарагиновые остатки D-175 и D-221 активного центра СВНII из целлюлазного комплекса Т. reesei играют ключевую роль в катализе [154]- химической модификацией реактивом Вудворда было показано значение участия карбоксильного остатка в катализе ß—D-глюкозидазы из целлюлазного комплекса, секретируемого продуцентом Manihot escalenta Crantz [164]. Естественно, что более однозначными являются генетические методы, но не надо забывать важность и химических методов, которые по простоте и быстроте исполнения превосходят генетические методы. В конечном итоге эти методы могут очень хорошо дополнять друг друга.

Наличие «двухстадийного» механизма было доказано для экзоглюканаз (Сех) из Cel. fimi (из семейства F) и для целлюлаз из С/, thermocellum [154]. V.

Рис. 2. Схема действия целлюлаз по механизму одностадийного замещения [127,.

154−156]. А.

Чз-н он <�о-с.

Us -'О-Н.

ОС' о-с.

Рис. 3. Схема действия целлюлаз по механизму двухстадийного замещения [127,.

154−156]. 24.

3. 3. Доменная структура целлюлаз.

Результаты опытов по протеолизу целлюлаз (в частности, папаином), рентгеноструктурные и генетические исследования основных компонентов различных целлюлазных комплексов — прежде всего, целлобиогидролаз и эндоглюканаз из T. reesei [166, 169−177, 180], а также других целлюлаз из T. harzianum [178], Cl. thermocellum [161], H. insolens [179], Cel. fimi [169, 174], Cel. flavigena, Ps. fluorescens [169], и т. д., доказали наличие y целлюлолитических ферментов не только функциональных доменов, но и реальных структурных доменов (рис. 2) [170].

С точки зрения структуры и каталитических свойств его компонентов, наиболее хорошо изучен целлюлазный комплекс, секретируемый грибом T. reesei. Частичный протеолиз папаином основных компонентов T. reesei — эндоглюканаз I и II (EGI, EGII) и целлобиогидролаз I и П (СВН I, СВН II) — приводит к разделению двух функциональных доменов этих ферментов: каталитического и адсорбционного. СВН I и EG П T. reesei имеют общую структуру: небольшой целлюлозосвязывающий домен (ЦСД) соединен гликозилированным участком фермента, так называемым «линкером», с каталитическим доменом (КД) [170−172].

Каталитический домен.

Линкер

Адсорбционный ломен.

Субстрат.

Рис. 4. Модель третичной структуры СВНI из Т. ree. se/ [170].

Целлюлозосвязывающий домен действует в качестве сорбционного центра для целлюлозных субстратов, а каталитический домен содержит активный (гидролитический) центр [170, 172]. Следует отметить, что роль линкеров состоит не только в соединении обоих доменов, но, и, как утверждают авторы [182], линкер играет ключевую роль в «управлении» адсорбционным доменом при адсорбции его на поверхности нерастворимого субстрата.

3. 4. Современные представления о классификации целлюлаз.

С момента открытия первых целлюлолитических ферментов традиционным способом их классификации было группирование по субстратной специфичности на эндоглюканазы, целлобиогидролазы, целлобиазы и экзоглюкозидазы. Этот подход оказывается полезным лишь для практических целей, но для систематизации данных он не очень подходит. Главной причиной, по которой трудно классифицировать таким способом (3-гликаназы, является перекрестная субстратная специфичность. Очень часто бывает, что не удается определить принадлежность одного фермента к той или иной группе из вышеназванных. На помощь пришли генетические и рентгеноструктурные методы исследования, которые позволили найти новые, более однозначные критерии классификации. Согласно современным представлениям целлюлазы можно классифицировать, основываясь на трех критериях: первичная структура фермента, структурные особенности фермента (наличие или отсутствие доменной структуры) и, наконец, механизм реакций, катализируемых ими, т. е. обращение или сохранение конфигурации аномерного углерода в продуктах реакции.

Авторы работы [184] (Хэнриссат Б., Клайссенс М. и др.) классифицировали (3-гликаназы на семейства, основываясь на данных гидрофобного кластерного анализа (ГКА). В настоящий момент таких семейств уже 12 (семейства А-Ь) [127, 184]. Метод ГКА основан на сравнении двумерной топологии и распределения гидрофобных кластеров аминокислот (V, I, Ь, Б, М, У, и в некоторых случаях, А и С) вдоль полипептидной цепи белка. К семействам А, В, Б и Н относятся грибные и бактериальные ферменты. Семейство Е содержит бактериальные и растительные ферменты. Семейство С содержит только грибные ферменты, а семейства Б и Отолько бактериальные. Семейства Н-Ь открыты сравнительно недавно, в эти семейства входят как грибные, так и бактериальные (5-гликаназы. Целлюлазы, входящие в состав одного семейства, различаются по размерам и могут иметь большие структурные отличия. Так, в пределах одного семейства встречаются ферменты, обладающие и не обладающие доменной структурой. Например, в самом большом семействе, А из 26 ферментов только 16 имеют доменную структуру. Размеры каталитических доменов ферментов семейства, А находятся в узком диапазоне: 272−607 аминокислот.

Несколько позже, авторы работ [169, 185] (Клайссенс М., Хэнриссат Б., Гилкес Н. Р. и др.) начали классифицировать целлюлазы по гомологии первичной аминокислотной последовательности и структурным особенностям. На сегодняшний день по таким признакам выявлены 46 семейств (3-гликаназ, в которые входят семейства, открытые на основе ГКА (семейства 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 26, 44, 45 и 46 соответствуют семействам А, В, С, D, Е, F, G, H, I, J, К, L, классифицированным на основе ГКА) [127, 169, 185].

Классификация на основе гомологии аминокислотной последовательности ферментов позволяет в ряде случаев предсказать локализацию ключевых каталитических аминокислотных остатков фермента [127, 169, 185]. Яркий примерферменты семейства 11, у которых всего два консервативных аминокислотных остатка Glu87 и Glul84, играющие ключевую роль в катализе [127, 186−188].

Еще один важный результат, вытекающий из анализа гомологии аминокислотных последовательностей — предсказание стереохимии реакции гидролиза (3-гликаназ. Например, установлено, что ферменты семейств 1, 3, 5, 7, 10−12 и 26 относятся к «сохраняющим» р-гликаназам, а ферменты семейств 6, 9, 45 и 46 к «обращающим» .

Из сравнения аминокислотных последовательностей различных ферментов следует, что ферменты с близкими первичными структурами очень часто обладают совершенно разной субстратной специфичностью. Это может означать, например, что наличие экзоили эндодеполимеразной активности может являться следствием каких-то тонких особенностей трехмерной структуры фермента.

ГЛАВА 4. ПОЛУЧЕНИЕ РЕКОМБИНАНТНЫХ ЦЕЛЛЮЛАЗ И РЕГУЛИРОВАНИЕ ИХ СВОЙСТВ С ПОМОЩЬЮ ГЕННО-ИНЖЕНЕРНЫХ МЕТОДОВ.

Широкое практическое применение целлюлолитических ферментов в определенной степени ограничивается их природой, поскольку целлюлазные препараты, как известно, представляют собой комплекс различных ферментов, имеющих зачастую довольно низкие специфические активности. Кроме того, наличие некоторых ферментов в составе комплекса для какого-либо его конкретного применения является «вредным». Например, для обработки поверхности хлопчатобумажных изделий целлюлазный комплекс должен быть обогащен эндоглюканазами с высокой тополитической активностью, а количество «агрессивных», разрушающих кристаллическую целлюлозу целлобиогидролаз в нем должно быть сведено к минимуму. Напротив, для глубокого осахаривания целлюлозосодержащего сырья необходимы целлюлазные комплексы, обогащенные целлобиогидролазами. В ряде случаев идеальным является применение монокомпонентного целлюлазного препарата.

Однако оптимизировать получение единичного компонента в множественной ферментной системе и наладить таким образом его получение в промышленных масштабах представляет собой трудную задачу. Кроме того, при реальном применении целлюлаз зачастую возникает необходимость использования больших количеств фермента, чтобы достичь желаемого результата. Продуктивность же природных штаммов целлюлолитических грибов и бактерий, во многих случаях, слишком мала для промышленного получения целлюлаз.

Для «улучшения» природных ферментов применяются различные подходы. Одним из традиционных методов для улучшения свойств является сайт-направленный мутагенез, который позволяет, например, увеличить активность фермента, улучшить его некоторые, в частности, технологические, свойства или придать совершенно новые, такие как избирательность по отношению к субстрату, устойчивость к изменениям рН среды и окружающей температуры, стабильность при хранении [189]. Так, например, в случае (5−1,4-эндоглюканазы, продуцируемой грибом Macrophomina phaseolina, применение этого подхода позволило получить модифицированную эндоглюканазу, для которой минимальный размер субстрата составлял шесть глюкозных единиц, а не пять, как в случае нативного фермента, что дает возможность использования этого фермента для гидролиза сложных (комплексных) субстратов, таких как (3-глюкан [190].

Большое количество исследований в этой области было проведено для эндоглюканазы V из Н. insolens (45 семья) [9, 49, 191]. Специфические мутации в последовательности ДНК, кодирующей данный фермент, позволили получить набор различных вариантов родительской целлюлазы, проявляющих улучшенные технологические свойства. Для этого проводились следующие операции: 1) замещение одной или нескольких аминокислот в ЦСД, КД или линкере- 2) присоединение одной или нескольких аминокислот к линкеру- 3) присоединение другого ЦСД с противоположной стороны от КД. Проведенные модификации приводили к повышению активности фермента при щелочных значениях рН, увеличению стабильности в присутствии различных эффекторов (катионные ПАВ, окислители и т. д.), улучшению способности к удалению загрязнений и отделке текстильных изделий. Более того, удалением или заменой в линкере аминокислотных остатков, чувствительных к гидролизу протеазами, были получены целлюлазы, устойчивые к протеолизу. Подобной заменой аминокислотных остатков, участвующих в связывании с целлюлозой, или изменением заряда ЦСД посредством введения, удаления или замещения гидрофильных или гидрофобных аминокислот можно модифицировать адсорбционные характеристики целлюлаз, чтобы достичь наиболее эффективного действия фермента на хлопчатобумажную ткань без изменения ее прочностных характеристик.

Упомянутые выше подходы, однако, незначительно влияют на уровень продуктивности микроорганизмов-продуцентов (как правило, уровень продуктивности, по сравнению с родительскими штаммами, увеличивается в 1,5−2 раза) [192].

В последнее десятилетие с развитием молекулярно-генетических технологий и систем по клонированию генов грибов появилось новое направление для улучшения свойств природных штаммов, основанное на применении генно-инженерных методов. На первом этапе этой работы проводят скрининг и выделение штамма, продуцирующего белок с необходимыми свойствами, на втором этапе выделяют ген, кодирующий данный белок, и клонируют его в клетку-хозяина. В качестве последнего используются, например, бактерии Bacillus, грибы Aspergillus [189], Penicillium, Trichoderma [193−195] и некоторые другие, которые отличаются быстрым ростом, высокопродуктивны и нетоксичны. И, наконец, на третьем этапе, получают штамм, несущий множество копий данного гена, проводят анализ количества необходимого белка в трансформантах и, при необходимости, применяют дополнительные методы по улучшению свойств штамма.

Данный подход был успешно применен для модификации целлюлазных комплексов, продуцируемых грибами рода Trichoderma. Например, было изменено соотношение различных типов целлюлаз, секретируемых гиперпродуцентоммутантным штаммом Т. reesei, что дало возможность получить новые штаммы, секретирующие более высокие количества специфической эндоглюканазы I при отсутствии мажорной целлобиогидролазы I, присутствующей в родительском штамме, и наоборот [195].

Воздействие эндоглюканазы Ш из Т. longibrachiatum на хлопчатобумажную ткань при испытаниях в составе моющих средств было более эффективным по сравнению с другими эндоглюканазами из этого же целлюлазного комплекса [196]. Кроме того, этот фермент имел нейтральный рН-оптимум и проявлял относительно высокую активность при щелочных значения рН, что делало его применение в текстильных процессах полезным и выгодным. Таким образом, возникла потребность в применении индивидуально эндоглюканазы Ш и получении, соответственно, штаммов Trichoderma, секретирующих целлюлазный комплекс, существенно обогащенный данным компонентом. Применение методов генной инженерии позволило получить штамм Trichoderma sp., модифицированный таким образом, что все компоненты целлюлазного комплекса, за исключением эндоглюканазы III, отсутствовали [197]. Аналогичным образом, использование генно-инженерных подходов позволило получить штаммы Trichoderma и Saccharomyces, продуцирующие ферментные комплексы, обогащенные эндоглюканазой V из 7! reesei, которая имеет нейтральный рН-оптимум (рН 6,0−6,5), высокостабильна и может быть использована в целлюлозобумажной, текстильной промышленности, а также в качестве кормовых добавок [50].

Другим примером являются дрожжи Saccharomyces cerevisiae [198], которые, кроме нескольких р-1,3-глюканаз, не продуцировали других карбогидраз. В этом случае применение генно-инженерных методов привело к получению трансформантов S. cerevisiae, секретирующих эндо-(3−1,4-глюканазу, целлобиогидролазу, целлодекстриназу и целлобиазу, способных гидролизовать до моносахаридов различные субстраты, такие как КМЦ, ламинарин, р-глюкан, целлобиоза, ксилан и др.

А это, в свою очередь, позволяет использовать данные штаммы для превращения целлюлозы одностадийным процессом в ряд ценных продуктов (углеводы, этанол и т. п.).

Применение методов генной инженерии также дало возможность получать однокомпонентные ферментные системы, обладающие высокой специфической активностью и являющиеся, например, весьма перспективными для отделки текстильных изделий [9, 191, 199]. Так, клонирование гена, кодирующего эндоглюканазу V из Н. insolens, в A. oryzae позволило получить моноферментный препарат эндоглюканазы, который был успешно применен для обработки текстиля, хлопчатобумажной джинсовой ткани и бумажной пульпы [9].

В заключение, следует отметить, что по данным компании Novo Nordisk [189], исследующей и производящей целлюлолитические ферменты, в настоящее время от 40 до 50% (по объему) промышленных целлюлаз получают именно с применением генно-инженерных технологий.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ ГЛАВА 5. ОБЪЕКТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И МЕТОДИКА ЭКСПЕРИМЕНТА.

5.1. Исходные вещества.

5.1.1. Ферментные препараты.

1. ферментный препарат Chaeiomium cellulolyticum F-60−8 (#234.1), представляющий собой ультрафильтрат культуральной жидкости, полученный в ИБФМ РАН (г. Пущино).

2. ферментный препарат Penicillium canescens R201 (#440.1), полученный в ИБФМ РАН (г. Пущино).

3. ферментный препарат Penicillium verruculosum (#3−55.1), полученный в ИБФМ РАН (г. Пущино).

4. ферментный препарат Trichoderma reesei АСЕ (#210.27) производства фирмы «AARL, Inc» (США).

5. ферментные препараты Tolipocladium geodes (#444.1- #444.2), представляющие собой лиофилизованные ультрафильтраты культуральной жидкости, производства фирмы «Cayla» (Франция).

5.1.2. Субстраты и реактивы.

Для определения ферментативных активностей использовали:

1. бумага хроматографическая № 1 (ФБ) производства фирмы «Whatman» (Англия).

2. микрокристаллическая целлюлоза (МКЦ) производства фирмы «Serva» (Германия).

3. растворимый окрашенный субстрат ОЦ-41 (КМЦ, окрашенная красителем Активный оранжевый ЖТ) производства НПО «Фермент» (Литва).

4. растворимый окрашенный субстрат РББ-КМЦ (КМЦ, окрашенная красителем Remazol Brilliant Blue R), ß—глюкан ячменя производства фирмы «Megazyme» (Австралия).

5. натриевая соль карбоксиметилцеллюлозы (КМЦ, средней вязкости), 4-метилумбеллиферил-целлобиозид (МУФ-целлобиозид, МУФ-вг), 4-метилумбеллиферил-лактозид (МУФ-лактозид), глюкуроноксилан из древесины березы, я-нитрофенил-Р-?>-глюкопиранозид (иНФГ), D-глюкоза, D-целлобиоза, 5-глюконолактон, индиго производства фирмы «Sigma» (США).

6. моногидрат лактозы фирмы «Merck» (Германия).

7. декстраны с молекулярной массой от 20 до 250 кДа производства фирмы «Pharmacia» (Швеция).

8. о-дианизидин производства Донецкого завода химических реактивов.

Для определения концентрации глюкозы использовали пероксидазу хрена с удельной активностью 350 ед/мг (Rz=0,6) производства фирмы «Reanal» (Венгрия) и кристаллическую глюкозооксидазу с удельной активностью 380 ООО ед/г, полученную на Вильнюсском заводе ферментных препаратов.

Для приготовления буферных растворов использовали коммерческие препараты солей марок ч.д.а. и ос.ч. «Реахим» (Россия).

5.1.3. Носители, используемые при хроматографическом выделении ферментов.

В качестве носителей для очистки ферментов использовали при ионообменной хроматографии DEAE-Toyopearl 650 М (20−40 мкм, «Toyo Soda», Япония) и Macro Prep Q (190±40 мкм, «Bio-Rad», США), при обессоливании — Акрилекс П-4 («Reanal»), при хроматофокусировании — Mono Р («Pharmacia», Швеция), при гель-фильтрацииSuperose 12 («Pharmacia»).

5.1.4. Реактивы для определения биохимических характеристик ферментов.

При изготовлении ПААГ-пластин (70×80×0,75 мм) для электрофореза с концентрирующим (4%) и разделяющим (12%) гелями, а также при изоэлектрофокусировании с 4%-ным гелем (125×65×0,75 мм) использовали реактивы и наборы фирм «Serva» и «Bio-Rad». Окрашивание белка проводили кумасси бриллиантовым голубым R-250 в смеси 25%-ного изопропанола и 10%-ной уксусной кислоты [216]. Перед электрофорезом исследуемые растворы фермента обрабатывали 1%-ным ДЦС-Na и 5%-ным ß—меркаптоэтанолом при 100 °C в течение 5 мин.

В качестве стандартов при проведении изоэлектрофокусирования использовали смесь белков Protein Test Mix 9 («Serva»), включающую амилоглюкозидазу (pi 3,5), ферритин (pi 4,4), БСА (pi 4,6), ß—лактоглобулин (pi 5,1), кональбумин (pi 5,9). Смесь стандартов для электрофореза («Sigma») включала ß—лактоглобулин (18,4 кДа), карбоангидразу (29 кДа), овальбумин (45 кДа), БСА (66 кДа), фосфорилазу (97,4 кДа), ß—галактозидазу (116 кДа) и миозин (205 кДа).

Для определения процентного содержания углеводов в белках использовали фенол и серную кислоту фирмы «Реахим», D-маннозу фирмы «Sigma» (США) в качестве стандарта.

5.2. Аналитические методы.

Содержание глюкозы определяли с помощью глюкозооксидазно-пероксидазного метода, содержание восстанавливающих Сахаров (ВС) — модифицированным методом.

Шомоди-Нельсона [221]. Содержание белка в целлюлазных препаратах определяли по методу Лоури-Фолина, используя БСА в качестве стандарта, и по поглощению на длине волны 280 нм [215].

5.3. Методы определения активности.

Эндоглюканазную активность определяли с помощью вискозиметрического метода при гидролизе КМЦ [221], активность по фильтровальной бумаге (АФБ) — по методу, описанному Клесовым и др. [212], КМЦазную, авицелазную, ксиланазную и ß—глюканазную активности — по начальной скорости образования ВС при гидролизе КМЦ, МКЦ, ксилана и ß—глюкана соответственно [213].

— Глюкозидазную активность определяли по начальной скорости образования п-нитрофенола при гидролизе яНФГ. Целлобиазную и лактазную активности определяли по начальной скорости накопления глюкозы при гидролизе целлобиозы и лактозы соответственно [214].

Определение активности целлюлаз по отношению к МУФ-целлобиозиду и МУФ-лактозиду (целлобиогидролазная активность) проводили, регистрируя накопление продуктов реакции на спектрофотометре при 350 нм. Концентрация субстрата в реакционной смеси составляла 0,5 мМ. Определение активности проводили в термостатируемой при 40 °C спектрофотометрической кювете при pH 5,0. После добавления в кювету аликвоты фермента регистрировали начальную скорость накопления МУФ в растворе и рассчитывали активность исходя из разностного коэффициента молярного поглощения, равного 1600 М" 1см" 1 [214]. Указанные выше активности выражали в международных единицах (1 ед. соответствовала количеству фермента, которое гидролизует 1 мкмоль гликозидных связей субстрата за 1 мин).

5.4. Определение активности ферментов с помощью окрашенных субстратов.

Активности ферментных препаратов по отношению к окрашенным субстратам изучали следующим образом: аликвоту окрашенного субстрата с концентрацией 10 г/л в 0,1 М Na-ацетатном буфере (pH 5,0) обрабатывали ферментным препаратом при 40 °C в течение 10 мин. После осаждения раствором осадителя и центрифугирования определяли оптическую плотность на длине волны, характеристической для данного субстрата. Активность рассчитывали в условных единицах исходя из молярного коэффициента поглощения [214].

5.5. Определение тополитической активности целлюлаз.

Способность целлюлаз к депигментации джинсовой ткани определяли, применяя разработанный нами ранее микротест [7], следующим образом: образец джинсовой ткани диаметром 30 мм помещали на дно специальной металлической ячейки и обрабатывали на качалке в термостатируемой при 50 °C водяной бане раствором ферментного препарата в буфере с соответствующим значением pH в течение 1 ч. Фермент предварительно разбавляли таким образом, чтобы его активность в реакционной смеси составляла 1,5 ед. КМЦазной активности или же концентрация белка равнялась 0,3 мг/мл, в случае, если удельная КМЦазная активность фермента мала. После этого образец ткани извлекали из ячейки, промывали водопроводной водой и сушили на воздухе в течение 1 суток. Для каждого фермента эксперимент проводили в трех повторностях. В каждом эксперименте ставили контроль, где такой же образец ткани обрабатывали в тех же условиях, но в отсутствие фермента.

Далее определяли интенсивность синего цвета в условных единицах следующим образом. Высушенные образцы ткани сканировали, полученные после сканирования изображения (в виде графических JPG файлов) обрабатывали с помощью.

38 компьютерной программы Adobe Photoshop (версия 4.0), определяя на цветовой гистограмме процент точек (пикселей) на выбранном участке изображения с интенсивностью синего цвета выше, чем на уровне 32 (percentile).

Для каждого фермента рассчитывали среднюю величину percentile. Тополитическую активность выражали в условных единицах, равных разности среднего значения percentile для контроля и среднего значения percentile для конкретного фермента.

5.6. Проведение ферментативного гидролиза микрокристаллической и карбоксиметилцеллюлозы.

Эксперименты по проведению полного гидролиза КМЦ и МКЦ проводили в термостатируемой ячейке при 50 °C в случае КМЦ и при 40 °C с перемешиванием в случае МКЦ. К 1%-ному раствору КМЦ или к 1%-ной суспензии МКЦ в 0,1 М Na-ацетатном буфере (рН 5,0) добавляли раствор фермента необходимой концентрации в том же буфере, при этом концентрация субстрата в реакционной смеси составляла 5 г/л. Далее через определенные промежутки времени отбирали пробы объемом 0,5−1,0 мл, в которых определяли содержание глюкозы и ВС. По этим данным строили кривые накопления продуктов гидролиза во времени и рассчитывали глубину гидролиза (в % от исходной концентрации субстрата в реакционной смеси).

5.7. Определение состава продуктов реакции гидролиза МУФ-целлобиозида.

Для определения состава продуктов использовали систему ВЭЖХ («Bio-Rad») и колонку (4×250 мм) с носителем Диасорб-ЖЬ («БиоХимМак», Россия) и соответствующей предколонкой. В качестве элюента использовали смесь ацетонитрила и воды в соотношении 70:30 соответственно. Скорость элюции составляла 1 мл/мин.

Продукты реакции регистрировали с помощью дифференциального рефрактометрического детектора фирмы «Кпаиег» (Германия).

5.8. Методы изучения стабильности целлюлолитических ферментов.

Эксперименты по изучению рН-стабильности, определению рНи температурного оптимума целлюлаз проводили следующим образом. В термостатируемую (30−90°С) пробирку помещали растворы ферментов в 0,1 М Ш-ацетатном (рН 5,0) или универсальном (рН 3,5−9,6) буферах. В начальный момент и далее через определенные промежутки времени отбирали пробы и определяли в них КМЦ-азную или РББ-КМЦазную активность. Результаты измерений отображали в процентах от максимального значения активности в зависимости от рН и температуры.

5.9. Методы изучения адсорбционных характеристик ферментов.

Адсорбционную способность выделенных ферментов оценивали по измерению адсорбционного коэффициента распределения (Кр), равного отношению количеств адсорбированного и находящегося в растворе фермента на линейном участке изотермы адсорбции. Для его определения строили прямую в координатах (Ао/Ас, С), где Аоисходная активность фермента, Ас — остаточная активность фермента в супернатанте после инкубации с МКЦ, С — концентрация МКЦ в суспензии, г/л. Тангенс угла наклона этой прямой соответствует Кр, л/г. Изучение адсорбции целлюлолитических ферментов проводили на МКЦ с концентрацией от 2 до 20 г/л при комнатной температуре в 0,1 М универсальном буфере, рН 7,0. Через 30 мин после прибавления раствора фермента к субстрату отбирали пробы, центрифугировали и анализировали в супернатанте активность по отношению к окрашенному субстрату ОЦ-41.

РОССИЙСКАЯ fotWPCTSEMH^j г.

5.10. Определение кинетических параметров ферментов.

Для определения значений максимальной скорости (Уга) и константы Михаэлиса (Км) получали зависимость начальной скорости образования продуктов от исходной концентрации субстрата и обрабатывали результаты в двойных обратных координатах Лайнуивера-Берка. Константу ингибирования Копределяли при различных концентрациях соответствующего ингибитора, результаты обрабатывали в координатах Диксона.

5.11. Выделение и очистка индивидуальных целлюлолитических ферментов целлюлазного комплекса С cellulolyticum.

Хроматографическое выделение индивидуальных компонентов целлюлазного комплекса С. cellulolyticum проводили с помощью системы хроматографии низкого давления Econo System («Bio-Rad») и системы хроматографии среднего давления FPLC System («Pharmacia»), Обе системы состояли из автоматического контроллера процесса, насоса, ультрафиолетового проточного детектора и коллектора фракций. Кроме того, в комплекте Econo System был проточный кондуктометр для контроля градиента.

В процессе выделения концентрацию белка определяли спектрофотометрически при 280 нм, калибровку строили по БСА, принимая, что раствор 1 г/л БСА дает поглощение 0,65 оптических единиц при использовании 1 см кюветы [217].

Обессоливание проводили на колонке (2,6×20 см) с Акрилексом П-4, уравновешенной 0,03 М натрий-ацетатным буфером, pH 4,75.

Ионообменную хроматографию на DEAE-Toyopearl проводили на колонке.

1,5×30 см), уравновешенной 0,03 М натрий-ацетатным буфером, pH 4,75. После нанесения раствора обессоленного фермента колонку отмывали стартовым буфером с.

41 рН 4,75 и элюировали связавшийся белок в градиенте NaCl от 0 до 0,25 М в течение 7 часов.

Ионообменную хроматографию на Macro Prep Q для фракций 30−39, полученных после DEAE-Toyopearl хроматографии, проводили в 0,03 М натрий-ацетатном буфере с рН 5,5. Связавшиеся в стартовых условиях белки смывали в градиенте 0−0,2 М NaCl в течение 2 часов.

Хроматофокусирование фракций 40−51 (DEAE-Toyopearl) проводили на колонке Mono Р HR (5×200 мм), уравновешенной 0,03 М имидазольным буфером, рН 5,75. Связавшиеся с носителем в стартовых условиях белки далее элюировали в линейном градиенте рН, который создавали пропусканием через колонку полибуфера РВ 74 («Pharmacia») (1:9), рН 4,0.

Гель-проникающую хроматографию при среднем давлении (FPLC) во фракциях 16−19, полученных после хроматофокусирования, проводили на колонке Superose-12 HR (10×200 мм), уравновешенной 0,05 М Na-ацетатным буфером (рН 4,5) с добавлением 0,2 М NaCl для предотвращения электростатических эффектов при разделении.

Во фракциях, содержащих белок, рН доводили до 5,0 с помощью 0,5 М ацетатного буфера и определяли ферментативные активности как описано в [214]. Белковый состав фракций, полученных после каждой стадии очистки, контролировали с помощью электрофореза в денатурирующих условиях и аналитического изоэлектрофокусирования.

5.12. Выделение рекомбинантной эндоглюканазы с молекулярной массой 25 кДа.

Хроматографическое выделение рекомбинантной эндоглюканазы с молекулярной массой 25 кДа из ферментного препарата Т. geodes проводили с.

42 помощью системы хроматографии низкого давления Econo System («Bio-Rad») и FPLC System («Pharmacia»),.

Обессоливание проводили на колонке (2,6×20 см) с Биогелем П-6, уравновешенной 0,03 М пиперазиновым буфером, pH 4,75.

Хроматофокусирование обессоленного препарата Т. geodes проводили на колонке Mono Р HR (5×200 мм), уравновешенной 0,03 М пиперазиновым буфером, pH 4,75. Связавшиеся с носителем в стартовых условиях белки далее элюировали в линейном градиенте pH, который создавали пропусканием через колонку раствора полибуфера РВ 74, pH 3,5.

5.13. Определение биохимических параметров очищенных ферментов.

Изоэлектрические точки белков определяли с помощью аналитического изоэлектрофокусирования (ИЭФ) на приборе Model 111 Cell, «Bio-Rad» (США), руководствуясь методикой [218]. Гомогенность очищенных ферментов контролировали также с помощью электрофореза (ЭФ) на приборе Mini Protein II («Bio-Rad», США) в 12% ПААГ согласно методике [219].

Общее содержание Сахаров определяли методом Дюбуа [220]. К 0,5 мл пробы, содержащей не более 100 мкг/мл Сахаров, добавляли 0,5 мл 5%-ного раствора фенола, перемешивали и быстро добавляли 2,5 мл концентрированной H2SO4. Через 30 мин на спектрофотометре Philips PU 8636 (Англия) определяли оптическую плотность при 490 нм. В качестве раствора сравнения использовали соответствующую смесь реагентов с пробой, не содержащей Сахаров. Калибровочный график строили по экспериментальным данным, используя маннозу в качестве стандарта.

5.14. Определение молекулярно-массового распределения ß—глюкана ячменя.

Для определения молекулярно-массового распределения (ММР) ß—глюкана и продуктов его гидролиза использовали метод высокоэффективной жидкостной гель-хроматографии на колонке с носителем Bio-Gel TSK 30 XL фирмы «Bio-Rad» (США). Элюцию проводили 0,1 M натрий-ацетатным буфером, pH 5,0 с добавлением 0,1 M NaCl для предотвращения полиэлектролитных эффектов. В качестве детектора использовали дифференциальный рефрактометр фирмы «Knauer» (Гермения). Объем вводимых проб составлял 0,3% от объема колонки. Скорость элюции равнялась 1 мл/мин. Колонку калибровали по глюкозе, целлобиозе и декстранам с молекулярной массой от 20 до 250 кДа (5 г/л).

5.15. Оценка влияния целлюлаз на ресорбцию индиго на целлюлозной матрице.

Готовили запасную суспензию индиго фирмы «Sigma» (США) в дистиллированной воде (5 мг/мл) при интенсивном перемешивании на магнитной мешалке в течение 15 мин. В качестве матрицы для окрашивания использовали белую хлопковую ткань (1,4×1,4 см, 27±2 мг), которую инкубировали с раствором ферментного препарата (1,8 мл) в соответствующем буфере в течение 10 мин при комнатной температуре. Далее в реакционную смесь добавляли 0,2 мл суспензии индиго, и стакан с реакционной смесью перемешивали в течение 30 мин на горизонтальной качалке (300 об/мин) в водяной бане (50°С). После этого образец ткани извлекали пинцетом, промывали дважды на качалке в течение 5 мин с 5 мл дистиллированной воды. После этого образцы ткани сушили на воздухе в течение суток. Для каждого образца фермента эксперимент проводили в трех повторностях. В случае контрольного опыта кусочек ткани обрабатывали в тех же условиях, но в отсутствие фермента.

Образцы высушенной ткани сканировали при разрешении 300 точек на дюйм с обеих сторон по два раза, поворачивая ткань каждый раз на 90°. Полученные электронные изображения обрабатывали с помощью программы Adobe Photoshop 4.0. Для каждого образца получали гистограмму интенсивностей на синем канале цветового спектра и определяли на ней процент точек (пикселей) на выбранном участке изображения до порогового значения 120 (percentile).

Для каждого фермента рассчитывали среднюю величину percentile, которая использовалась как мера сорбции индиго (индекс ресорбции индиго).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

ГЛАВА 6. ВЫДЕЛЕНИЕ И ОЧИСТКА ОСНОВНЫХ КОМПОНЕНТОВ ЦЕЛЛЮЛАЗНОГО КОМПЛЕКСА Chaetomium cellulolyticum. ИССЛЕДОВАНИЕ ИХ СПЕЦИФИЧНОСТИ.

Как уже отмечалось, в нашей лаборатории совместно с сектором биосинтеза и получения ферментов ИБФМ РАН был проведен скрининг продуцентов целлюлаз, активных и стабильных при нейтральных значениях pH и пригодных для обработки хлопчатобумажных изделий, в результате чего был найден мицелиальный гриб-продуцент «нейтральных» целлюлаз С. cellulolyticum. На первом этапе исследования нами была разработана схема выделения и очистки «мажорных» (по содержанию белка в исходном комплексе) компонентов данного целлюлазного комплекса, из которых выбирали наиболее эффективные при удалении индиго с поверхности джинсовой ткани. Данная схема представлена на рис. 5. Для выделения белков были использованы стадии грубого фракционирования с помощью ионообменной хроматографии на DEAE-Toyopearl с последующим тонким фракционированием с помощью ионообменной хроматографии на Macro Prep Q, высокоэффективного хроматофокусирования на Mono Р и гель-фильтрации.

6.1. Схема очистки ферментов С. cellulolyticum.

На первой стадии очистки ультрафильтрат культуральной жидкости С. cellulolyticum F-60−8 (#234.1) после обессоливания подвергали ионообменной хроматографии на DEAE-Toyopearl. Как видно из хроматограммы (рис. 6), часть белка (фракция I) выходила в свободном объеме колонки (15% от общего количества нанесенного белка),.

Ультрафильтрат культуральной жидкости С. cellulolyticum.

Ионообменная хроматография (ВЕАЕ-Тоуореаг1) фракция I фракция II фракция Ш фракция IV белки, элюирован- (фракции 30−39) (фракции 40−51) (фракции 52−60) ньге в свободном объеме колонки).

Ионообменная Хроматофоку-хроматография сирование (Macro Prep Q) (Mono Р).

Эндо-50 (pl 3,9).

Эндо-43 (pl 4,2) смесь 55 и 65 кДа Эндо-25 (pl 4,0) белков.

Гель-фильтрация (Superose 12).

ЦБГ-55 (pl 4,5) и белок 65 кДа (pl 4,4).

Рис. 5. Схема выделения и очистки «мажорных» компонентов целлюлазного комплекса С. сеПиЫуПсит Б-60−8 (#234.1). при элюировании в градиенте №С1 выходил один несимметричный пик (фракции с 30 по 65), обладающий КМЦазной активностью.

40-,.

-.40 Я.

30 ё, а к 4.

Номер фракции.

Рис. 6. Ионнообменная хроматография целлюлазного комплекса С. сеПиШуНситп Р-60−8 (#234.1) на БЕАЕ-Тоуореаг 1. Скорость 60 мл/ч, объем фракций 5 мл: 1 — Агво? 2 -КМЦазная активность, 3 — ионная сила.

Согласно данным электрофореза в денатурирующих условиях (рис. 7) «мажорные» белки наблюдали во фракциях II (объединенная фракция 30−39), Ш (объединенная фракция 40−51) и IV (объединенная фракция 52−60), а фракция I содержала большой набор белковых полос. Фракция II включала в себя «мажорный» белок с молекулярной массой 43 кДа, фракция Ш — три белка с молекулярными массами 25, 55 и 65 кДа, фракция IV содержала гомогенный белок с молекулярной массой 50 кДа (р13,9) (рис. 9). о кДа л.

I П.

•ZV-Ssi.

-«¡-газа.

Ш IV ' <

45 36.

29 24 20.

14,2.

Рис. 7. ДЦС-ЭФ (12% гель) фракций, полученных после первой стадии очистки целлюлазного комплекса С. сеИиШуНсит (крайняя правая дорожка — маркеры для ДЦС-ЭФ).

Фракции I, II, III и IV, полученные после первой стадии очистки, были проанализированы на способность к удалению индиго с поверхности джинсовой ткани. Результаты, представленные на рис. 8, свидетельствуют о том, что наибольшую депигментирующую активность проявляла фракция Ш, фракции П и IV занимали промежуточное положение, а фракция I практически не вызывала депигментацию ткани. Таким образом, по результатам проведенного теста для дальнейшей очистки и анализа были взяты фракции II, III и IV.

Рис. 8. Эффективность депигментации джинсовой ткани при обработке фракциями, полученными после первой стадии очистки целлюлазного комплекса С. cellulolyiicum.

Фракция П была подвергнута хроматографии на колонке Масго Prep Q, в результате чего был получен гомогенный белок с молекулярной массой 43 кДа (pl 4,2) (рис. 9). Фракция Ш была подвергнута хроматофокусированию, в результате чего белок с молекулярной массой 25 кДа (pl 4,0) был выделен в гомогенном состоянии, согласно данным электрофореза и изоэлектрофокусирования (рис. 9), а белок с молекулярной массой 55 кДа был получен в смеси с 65 кДа-белком. Для разделения белков с молекулярными массами 55 и 65 кДа применяли гель-фильтрацию на колонке Superose 12, что позволило выделить гомогенные по данным электрофореза и изоэлектрофокусирования белки с молекулярными массами 55 кДа (pl 4,5) и 65 кДа (pl 4,4) (рис. 9). Фракция IV, напомним, содержала гомогенный белок с молекулярной массой 50 кДа (pl 3,9). кДа Р|р|г а) Щ.

66 .

45 29.

1 2 3 4 5 6.

Р1.

Шг 5,9.

Шг'— - 4,6.

3,5.

Рис. 9. ДЦС-ЭФ (а) и аналитическое изоэлектрофокусирование (б) компонентов целлюлазного комплекса С. сеПиЫуИсит с молекулярными массами 25 кДа (2), 43 кДа (3), 50 кДа (4), 55 кДа (6(а) и 5(6)) и 65 кДа (5(а) и 6(6)) (1 — маркеры для ДДС-ЭФ и ИЭФ, соответственно).

Обычно грибные ферменты представляют собой гликозилированные белки, поэтому нами было исследовано общее содержание углеводов в выделенных ферментах С. сеИиЫуИсит (методом Дюбуа, при калибровке по маннозе) (табл. 1). Как видно из таблицы, белок с молекулярной массой 43 кДа оказался сильно гликозилированным, б).

2 3 4 5 6 поскольку содержал около 38 остатков Сахаров на 1 молекулу фермента, а белки с молекулярными массами 25, 50, 55 и 65 кДа были слабо гликозилированы и содержали, соответственно, около 1, 5, 3 и 4 остатков Сахаров на 1 молекулу белка.

Таблица 1.

Биохимические характеристики выделенных компонентов целлюлазного комплекса С. се11и1о1уИсит.

Молекулярная масса белка, кДа Р1 Содержание углеводов, %.

25 4,0 0,6.

43 4,2 16,15.

50 3,9 1,9.

55 4,5 0,85.

65 4,4 1,1.

Таким образом, после проведенной очистки целлюлазного комплекса С. сеПиШуИсит были получены гомогенные белки с молекулярными массами 25 кДа (р1 4,0), 43 кДа (р! 4,2), 50 кДа (р! 3,9), 55 кДа (р! 4,5) и 65 кДа (р! 4,4).

6.2. Субстратная специфичность выделенных ферментов.

Субстратная специфичность полученных гомогенных белков с молекулярными массами 25, 43, 50, 55 и 65 кДа представлена в таблице 2. Как видно из этих.

Таблица 2. Активности ферментов, выделенных из целлюлазного комплекса С. сеИиЫуйсит, по отношению к различным субстратам, ед/мг белка (рН 5.0) сл и>

Молекулярная масса, кДа КМЦ (ВС) КМЦ (впек) Р-Глю-кан РББ-КМЦ ОЦ-41 ФБ мкц МУФ-целло-биозид МУФ-лак-тошд п НФГ Целло-бкоза Лактоза Глюкуроно-ксилан.

25 25 14 5 20,2 5,1 0,05 0 0 0 0 0 0 0.03.

43 0,6 0,3 о, з 0,28 0,14 0 0 0 0 0 0 0 0.

50 7 3,5 7,1 2,9 1,1 ~0 0,02 0,5 0,55 ~0 ~о 0 0.

55 1 0,1 ОД 0,23 0,35 0,6 0,8 0,3 0,8 0,05 0,07 0 0.1.

65 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 результатов, белок с молекулярной массой 25 кДа обладал высокими по сравнению с другими препаратами активностями по отношению к КМЦ (25 ед/мг), {З-глюкану (5 ед/мг), а также высокой эндоглюканазной активностью (14 ед/мг). В то же время он не обладал большой активностью по отношению к кристаллическим видам целлюлозыМКЦ и фильтровальной бумаге. Поэтому, согласно современной классификации целлюлаз [200−201], белок с молекулярной массой 25 кДа можно отнести к эндоглюканазам (в дальнейшем мы будем называть его Эндо-25).

Несмотря на невысокие удельные активности по отношению ко всем исследованным субстратам, белок с молекулярной массой 43 кДа также может быть охарактеризован как эндоглюканаза (Эндо-43), поскольку он не проявлял характерных для целлобиогидролаз активностей по отношению к кристаллическим видам целлюлозы (МКЦ, фильтровальная бумага) и МУФ-целлобиозиду, а также не обладал р-глюкозидазной активностью (не имел активности по отношению к целлобиозе и иНФГ).

Белок с молекулярной массой 50 кДа. хотя и проявлял некоторую активность по отношению к МУФ-производным целлобиозы и лактозы, также может быть отнесен к эндоглюканазам (Эндо-50, соответственно), поскольку он имел достаточно высокие КМЦазную (7 ед/мг), эндо- (3,5 ед/мг) и (3-глюканазную (7,1 ед/мг) активности и не проявлял активности по отношению к МКЦ фильтровальной бумаге и /гНФГ.

Белок с молекулярной массой 55 кДа был идентифицирован как целлобиогидролаза (ЦБГ-55), поскольку он проявлял характерную активность по отношению к МУФ-целлобиозиду и МУФ-лактозиду (0,3 и 0,8 ед/мг соответственно), обладал активностью по отношению к МКЦ (0,8 ед/мг) и фильтровальной бумаге (0,6 ед/мг), при этом его эндоглюканазная активность была незначительной (0,1 ед/мг). О принадлежности данного белка к целлобиогидролазам также свидетельствовал проведенный нами с помощью методов ВЭЖХ анализ состава продуктов реакции гидролиза МУФ-Сг. Хроматограмма, представленная на рис. 10, свидетельствует о том, что через 3 ч гидролиза единственным сахаридом, образующимся в результате реакции, является целлобиоза — отсутствие глюкозы в продуктах еще раз указывает на принадлежность белка с молекулярной массой 55 кДа к целлобиогидролазам. Следует отметить, что данный фермент, в отличие от других целлобиогидролаз [202−203], обладал заметной способностью к гидролизу не только КМЦ, но и ее окрашенных производных, а также Р-глюкана. п пппитигг.

Рис. 10. Хроматограмма, показывающая состав продуктов реакции гидролиза МУФ-целлобиозида под действием ЦБГ-55: кривая 1 — начальный момент реакции, кривая 2 -после 3 ч гидролиза.

Выделенный белок с молекулярной массой 65 кДа не обладал целлюлазными активностями и поэтому в дальнейшем не исследовался.

Таким образом, среди выделенных компонентов целлюлазного комплекса С. сеНиМуИсит белки с молекулярными массами 25. 43 и 50 кДа были отнесены к эндоглюканазам, а белок с молекулярной массой 55 кДа был идентифицирован как целлобиогидролаза.

ГЛАВА 7. ЗАВИСИМОСТЬ АКТИВНОСТИ И СТАБИЛЬНОСТИ ФЕРМЕНТОВ С. сеИиШуйсшп ОТ ТЕМПЕРАТУРЫ И рН СРЕДЫ.

7.1. рНи температурные зависимости активности ферментов.

Влияние температуры на КМЦазную активность выделенных компонентов целлюлазного комплекса С. сеПиШуИсит представлено на рис. 11. Все ферменты обладали высоким температурным оптимумом: в случае Эндо-25 и Эндо-50 он был равен 70 °C, в случае ЦБГ-55 — 65−70°С, а Эндо-43 проявляла максимум активности при температуре 60 °C. рН-Зависимость активности выделенных белков по отношению к РББ-КМЦ и.

КМЦ представлена на рис. 12. Если судить по рН-оптимуму, самыми «кислыми» белками являлись Эндо-43 и Эндо-50 (рН оптимумы — 4,5 и 5,0, соответственно), хотя.

Эндо-43 сохраняла до 50% от максимальной активности по обоим субстратам даже при рН 8, в отличие от Эндо-50, сохранявшей 35% активности по РББ-КМЦ и лишь 13%.

КМЦазной активности при рН 8. Эндо-25 и ЦБГ-55 можно отнести к «нейтральным», поскольку они имели максимумы активности при рН 5−6. В отличие от других целлюлаз [1−4], важной особенностью выделенных ферментов, за исключением Эндо.

50, является то, что они сохраняли высокие активности в широком диапазоне рН — от 5 до 8. Так, например, при рН 8 они сохраняли до 85−90% активности по РББ-КМЦ и до.

50% от максимального значения активности по КМЦ, за исключением Эндо-25, сохранявшей при рН 8 35% КМЦазной активности. Активность ферментов по.

Рис. 11. Зависимость КМЦазной активности целлюлолитических ферментов С. сеИиЫуйсит от температуры (0,1 М Иа-ацетатный буфер, рН 5,0- время реакции 5 мин).

Эндо-25.

СМСаэе —ЯВВ-СМСазе.

— 1-¦-Г" .

8 рН 10.

100? о д.

С 80.

Эндо-43 |.

СМСаве —л— ШЗВ-СМСаяе.

4 6 8 10.

РН 100'.

Эндо-50 I Л / N.

CMCa.se —ГШГ!-СМО*е.

-,-.-,—-,—-1-. — |.

0 2 4 б 8 10 рН 100.

2 о 0.

1 80.

ЦБГ-55 |.

СМСазе —ЦВВ-СМСазе 6 рН ю ж о.

Рис. 12. Зависимость от рН активности по отношению к КМЦ (50°С, время реакции.

5 мин) и РББ-КМЦ (40°С, время реакции 10 мин) для целлюлолитических ферментов С. сеИиШуИсгтг.

РББ-КМЦ имела еще более широкий рН-профиль: Эндо-25 и ЦБГ-55 сохраняли до 70% активности по отношению к окрашенному субстрату даже при рН 9.

Таким образом, исходя из значения рН-оптимума и уровня активности при нейтральных и щелочных значениях рН среды, наиболее перспективными для использования в этих условиях являются Эндо-25 и ЦБГ-55.

7.2. Стабильность ферментов целлюлазного комплекса С се11и1о1уйсит.

В технологических процессах обработки текстильных изделий, таких как биодепигментация или биоотделка, требуются ферменты, не только высокоактивные, но и стабильные в нейтральной и щелочной среде (рН 7−9). Эксперименты по изучению стабильности белков из С. сеПиШуИснт проводились при значениях рН от 5 до 9,6 и 50 °C. Упомянутые выше технологические процессы осуществляются обычно в течение 1−2 часов, поэтому максимальное время инкубирования ферментов в заданных условиях было выбрано равным 3 ч (рис. 13). Эндо-25 сохраняла в течение 3 ч инкубирования 100% КМЦазной активности при всех исследованных значениях рН. Эндо-43 сохраняла 100% активности при рН 5 и 6 и 65−70% КМЦазной активности при рН 7−8 в течение 3 ч. Однако при рН 9,6 полностью инактивировалась уже через 30 мин, а при рН 8,8 КМЦазная активность падала до 20% за 30 мин инкубирования. Эндо-50 сохраняла через 3 ч инкубирования 100% активности в диапазоне рН 5−8, а при щелочных рН (рН 9,6) через 30 мин полностью теряла активность. ЦБГ-55 показывала после 3 ч инкубирования 100% активности при рН 5, 6 и 7, 90% активности — при рН 8, 70% - при рН 8,8 и 40% - при рН 9,6.

Таким образом, самым стабильным ферментом при всех значениях рН являлась Эндо-25. Эндо-50 и ЦБГ-55 были наиболее стабильны в диапазоне рН 5−8, а Эндо-43 время итерирования, ч время инкубирования, ч.

Рис. 13. Стабильность целлюлолитических ферментов С. се11и1о1у1сит при различных значениях рН (50°С) сохраняла стабильность только при рН 5−6. Суммируя данные по рН-зависимостям и рН-стабильности для выделенных компонентов целлюлазного комплекса С. сеЦиЫуИсит, можно заключить, что Эндо-25 и ЦБГ-55 сохраняли высокие активности и при этом были стабильны в диапазоне рН от 5 до 8.

Принимая во внимание уровень активности и стабильность исследуемых ферментов при нейтральных и щелочных значениях рН мы пришли к выводу, что они потенциально могут быть использованы в составе моющих средств. При применении целлюлолитических ферментов по этому направлению поверхностно-активные вещества (ПАВ), входящие в состав моющих средств, могут влиять на активность и стабильность ферментов. Поэтому важно, чтобы ферменты сохраняли свою активность в присутствии ПАВ в течение, по крайней мере, 1−2 часов. В связи с этим нам представлялось интересным изучить влияние ПАВ на стабильность выделенных компонентов целлюлазного комплекса С. сеИиШуИсит. Наиболее часто используемыми в моющих средствах являются анионные ПАВ, примером которых могут служить линейные алкилбензолсульфонаты, алкильный радикал которых содержит от 10 до 18 углеродных атомов [204].

Нами была изучена стабильность выделенных белков в присутствии натриевой соли Сп-алкилбензолсульфоната (ЬАБ). Эксперименты проводились при 50 С и диапазоне рН от 4,8 до 9,0, концентрация ЬАБ составляла 2,5 г/л (рис. 14). Надо отметить, что для всех эндоглюканаз КМЦазная активность наиболее быстро падала как при самом кислом (рН 4,8), так и при самом щелочном из исследуемых значении рН (рН 9,0). Так, в случае Эндо-43 и Эндо-50, они полностью инактивировались, соответственно, уже через 30 и 15 мин инкубирования (рис 14). Эндо-25 через 1 ч сохраняла 97% активности при рН 6,6 и порядка 70−80% активности при рН 5,6, 7,2 и.

Эндо-43 pH 4,8 i—pH 5,6 —pH 6,6 —pH 7,2 pH 7,8 —X—pH 9,0.

1,5 2,0 время, ч время, ч.

0,0.

0,5.

ЦБГ-55.

— г.

1,0 1,5 2,0 время, ч т.

2,5.

3,0.

1.0 1,5 2,0 время, ч.

Рис. 14. Влияние LAS (2,5 г/л) на стабильность целлюлолитических ферментов С. cellulolyticum при различных значениях pH (50°С).

7,8- а через 2 ч инкубирования — порядка 60−70% КМЦазной активности в диапазоне рН 5,6−7,2 и 50% активности при рН 7,8. КМЦазная активность Эндо-43 через 30 мин инкубирования достаточно резко падала до 60% при рН 6,6 и 50% при рН 5,6 и 7,2 и в течение последующих 2,5 часов сохранялась на прежнем уровне. При рН 7,8 Эндо-43 сохраняла 40% активности в течение 1,5 часов инкубирования, а через 3 ч практически полностью теряла активность. КМЦазная активность Эндо-50 в диапазоне рН 5,6−7,2 изменялась практически одинаковым образом: в течение первых 30 мин инкубирования сохранялось 100% активности, за последующие 30 мин активность уменьшалась до 85% и в течение последующих 2 ч сохраняла свое значение. При рН 7,8 Эндо-50 была нестабильна: через час активность падала до 45%, а через 3 ч инкубирования фермент проявлял лишь 15% от максимальной активности.

ЦБГ-55, по сравнению с эндоглюканазами, была более стабильна: сохраняла 100% КМЦазной активности через 30 мин инкубирования в диапазоне рН 5,6−7,8, и через 1 ч — в диапазоне рН 5,6−7,2. Через 2 ч инкубирования фермент проявлял порядка 85−95% максимальной активности в интервале рН 4,8−7,8 и 70% КМЦазной активности при рН 9,0. Через 3 ч ЦБГ-55 проявляла порядка 65−70% максимальной активности при рН 6,6 и 7,8 и около 50−60% активности при всех остальных значениях рН.

Таким образом, сравнивая стабильность выделенных ферментов в отсутствие и в присутствии ЬАБ, можно заключить, что наименее чувствительными к присутствию ПАВ в системе оказались ЦБГ-55 и Эндо-25, поэтому они потенциально могут быть применимы в составе моющих средств на основе анионных ПАВ.

ГЛАВА 8. КИНЕТИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА ФЕРМЕНТОВ ЦЕЛЛЮЛАЗНОГО КОМПЛЕКСА С сеНиШуйсит.

8.1. Определение типа действия целлюлаз С сеНиШуйсит на основе полного ферментативного гидролиза карбоксиметил целлюлозы и микрокристаллической целлюлозы.

На основе анализа активности по отношению к разным субстратам выделенные компоненты целлюлазного комплекса С. сеНиШуйсит с молекулярными массами 25, 43 и 50 кДа были классифицированы как эндоглюканазы, а фермент с молекулярной массой 55 кДа был отнесен к целлобиогидролазам. Однако, чтобы с полной достоверностью отнести выделенные ферменты к классу эндоили экзодеполимераз, необходимо было получить дополнительные сведения о характере действия ферментов на полимерный субстрат. Для этого был проведен анализ соотношения общего количества Сахаров (ВС) и глюкозы, образующихся при гидролизе растворимого (КМЦ) и нерастворимого (МКЦ) целлюлозных субстратов (рис. 15). Эндо-25 и Эндо-43 не обладали активностью по отношению к МКЦ, поэтому для них был проведен гидролиз только КМЦ. Как видно из рис. 15, при действии этих ферментов на КМЦ глюкоза практически не образовывалась (относительное содержание глюкозы составляло 1,9% для Эндо-25 и 1,6% для Эндо-43). При действии Эндо-50 на КМЦ образовывалось несколько большее количество глюкозы, чем в случае Эндо-25 и Эндо-43, но не очень значительное: относительное содержание глюкозы в продуктах составляло 5%- при гидролизе МКЦ относительное содержание глюкозы составило 3%. Небольшое по отношению к олигосахаридам содержание глюкозы в продуктах гидролиза свидетельствует о том, что данные ферменты предпочтительно гидролизуют не концевые, а внутренние глюкозидные связи в субстрате, т. е. действуют по неупорядоченному (статистическому) механизму, что подтверждает.

0,3 0,2.

О (О 3.

0,1.

0,0.

Эндо-25 (а).

-¦—ВС.

•—глюкоза.

150 200 время, мин.

0,20-, Эндо-43 (а).

0,15.

5 0, и.

0,05.

0,00.

ВС —*— глюкоза.

О 50 100 150 200 250 300 время, мин к и я 3.

0,20.

0,15.

0,10.

0,05.

0,00.

Эндо-50 (а).

•—ВС —•—глюкоза.

300 время, мин время, мин ¦

0,4.

I 0,3.

0,1.

ЦБГ-55 (а).

50 100 150.

I— 200.

350 время, мин.

ЦБГ-55 (б).

150 200 250 300 350 400 время, мин.

Рис. 15. Образование продуктов в процессе гидролиза КМЦ (а) и МКЦ (б) под действием целлюлаз С. сеИиЫуИсит. концентрация Эндо-25 = 0,02 мг/млконцентрация Эндо-43 = 0,1 мг/млконцентрация Эндо-50 и.

ЦБГ-55 = 0,04 мг/мл (0,1 М Ш-ацетатный буфер, рН 5,0- 50 °C (КМЦ);

40 °C (МКЦ)). принадлежность ферментов с молекулярными массами 25, 43 и 50 кДа к эндоглюканазам. Причем Эндо-50, по-видимому, характеризуется несколько более упорядоченным типом действия на целлюлозу, что подтверждается проявляемой ею активностью по отношению к МКЦ и МУФ-производным целлобиозы и лактозы (табл. 2).

Степень конверсии субстрата после завершения процесса гидролиза (рис. 15) для всех трех эндоглюканаз была невелика и составляла в случае гидролиза КМЦ 4,7% для Эндо-25, 3,7% для Эндо-43 и 3,4% для Эндо-50- степень гидролиза МКЦ под действием Эндо-50 равнялась 0,9%, что говорит о низкой осахаривающей способности данных компонентов целлюлазного комплекса С. сеИиШуИстп.

ЦБГ-55 при действии на КМЦ и МКЦ образовывала, по сравнению с выделенными эндоглкжаназами, более значительное количество глюкозы: отношение концентрации глюкозы к ВС составляло 17% при гидролизе МКЦ и 10% при гидролизе КМЦ. Полученные данные свидетельствуют о том, что данный фермент гидролизует субстраты по «концевому» механизму, характерному для экзодеполимераз, причем, геометрия активного центра ЦБГ-55, по-видимому, такова, что, в отличие от других целлобиогидролаз, объемные заместители, такие как карбоксиметильные группы или молекулы красителя, в полимерной цепи целлюлозного субстрата (РББ-КМЦ) не препятствуют действию фермента.

8.2. Изменение молекулярно-массового распределения р-глюкана при действии целлюлаз С. сеНиШуйсит.

Для определения механизма действия целлюлаз на полимерную молекулу субстрата, помимо изучения субстратной специфичности и состава продуктов гидролиза целлюлозных субстратов, нами с помощью ГПХ был исследован характер изменения молекулярно-массового распределения (ММР) Р-глюкана под действием выделенных целлюлолитических ферментов С. сеИиШуИсит при одинаковой глубине гидролиза по ВС (1,2%). Выбор Р-глюкана в качестве субстрата был обусловлен следующими причинами: во-первых, он не содержит в полимерной цепи заряженных боковых групп, как, например, карбоксиметилцеллюлоза, вследствие чего можно не опасаться проявления полиэлектролитных эффектови, во-вторых, все целлюлазы, выделенные из комплекса С. сеПиШуйсит, обладали высокой активностью по отношению к р-глюкану.

Исходное ММР (З-глюкана представляло собой один острый пик, максимум которого соответствовал молекулярной массе 210 000 Да (рис. 16). Изменения в ММР Р-глюкана, вызванные действием на него трех исследуемых эндоглюканаз, были в значительной степени схожи. Во всех случаях происходил сдвиг пика, соответствующего молекулярной массе 210 000 Да, в область полимера с более низкой молекулярной массой, однако появления при небольшой глубине гидролиза (1,2%) пика низкомолекулярных продуктов реакции не наблюдалось. Подобные изменения ММР Р-глюкана свидетельствуют, на наш взгляд, об эндо-типе деполимеризации полисахаридного субстрата под действием ферментов с молекулярными массами 25, 43 и 50 кДа [69, 130].

На гель-хроматограмме (рис. 16(г)), полученной для ЦБГ-55, наблюдалась обратная картина: сдвиг исходного пика, соответствующего молекулярной массе 210 000, в область полимера с более низкой молекулярной массой не наблюдался, но уже при небольшой глубине гидролиза (1,2%) появлялся пик низкомолекулярных продуктов, соответствующий олигосахаридам с СП от 2 до 6. Обнаруженные изменения в ММР Р-глюкана под действием ЦБГ-55 позволили сделать вывод о принадлежности данного фермента к экзодеполимеразам [69,130].

Эндо-25.

П л.

Эндо-43 '< л г%f (' Г{ ч f. I ! j I I.

— Г—1 1.

11,6 L.

ММ, кДа.

I i i t.

11? л-./ fi ^ i'.

11,6.

ММ, кДа.

Эндо-50 f- 2 i ! i I I.

210 11,6.

ЦБГ-55 ft Д i V.

If '•(.- 4.

ММ, кДа i I I.

210 11,6 0,6 ММ, кДа.

Рис. 16. MMP Р-глюкана до (кривая 1) и после обработки его (кривая 2) целлюлазами С. celluiolyticum (0,1 М Na-ацетатный буфер, рН 5,0- 50°С).

Известно [130], что ферменты, гидролизующие целлюлозу по концевому механизму (экзодеполимеразы), характеризуются, по сравнению с эндодеполимеразами, более упорядоченным типом действия на субстрат. Кроме того, степень упорядоченности действия самих эндоглюканаз на полимерный субстрат может различаться. Поэтому нам представлялось интересным провести сравнительную оценку упорядоченности действия исследуемых ферментов, на основании которой можно было бы получить дополнительные доказательства в пользу установленной нами классификации целлюлаз С. celluiolyticum. Степень упорядоченности (или неупорядоченности) действия ферментов-деполимераз, на наш взгляд, можно оценить по характеру уменьшения концентрации молекул высокомолекулярной части субстрата. Чем менее упорядоченно действует фермент, т. е. чем больше степень статистичности его атаки на субстрат, тем больше он уменьшает СП высокомолекулярных молекул (при одинаковой глубине гидролиза). В качестве критерия сравнения нами рассматривалось изменение средней СП высокомолекулярной фракции р-глюкана (100−220 кДа) под действием исследуемых ферментов при одинаковой глубине гидролиза по ВС (1,2%). Как видно из рис. 17, средняя СП высокомолекулярной фракции при действии ЦБГ-55 на Р-глюкан практически не изменялась (СП=1300 в случае нативного полимера и СП=1260 в случае ЦБГ-55), что говорит о высокой степени упорядоченности действия этого фермента на полимерный субстрат. При обработке Р-глюкана эндоглюканазами С. се1Ыо1уИсит, наоборот, средняя СП высокомолекулярной фракции уменьшалась в каждом случае почти в 2 раза, причем по характеру ее изменения исследуемые эндоглюканазы можно расположить в следующий ряд в порядке возрастания степени упорядоченности действия: Эндо-25, Эндо-50, Эндо-43.

Таким образом, обобщая полученные результаты, можно сказать, что ЦБГ-55 действует по высокоупорядоченному механизму и является экзодеполимеразой, а ферменты С. сеИиШуИсит с молекулярными массами 25,43 и 50 кДа атакуют молекулу целлюлозы по неупорядоченному (статистическому) механизму, характерному для ферментов эндо-типа действия, причем Эндо-25 характеризуется наименьшей степенью упорядоченности действия, а Эндо-43 — наибольшей.

1400 Ч.

Нативиыи полимер (100−220 кДа).

ЦБГ-55.

Эндо-43.

Эндо-25.

Эпдо-50.

Рис. 17. Изменение средней СП высокомолекулярной фракции р-глюкана под действием целлюлаз С. сеИиШуйсит при одинаковой глубине гидролиза по ВС (1,2%).

8.3. Кинетические параметры ферментов.

Кинетические константы ферментов С. сеНиЫуИсит были определены при гидролизе КМЦ (для эндоглюканаз и ЦБГ-55) и МУФ-Ог (для ЦБГ-55). Результаты, обработанные в двойных обратных координатах Лайнуивера-Берка, представлены в таблице 3.

Таблица 3.

Кинетические константы целлюлаз С. сеНиЫуИсит (рН 5,0).

Фермент Км, мг/мл у Л'<�" * т 5 мкМ/мин*мг Км, мМ У У* * т, мкМ/мин *мг Концентрация фермента, мг/л.

КМЦ (50°С) МУФ-вз (40°С).

Эндо-25 62±2,2 41±1,4 — - 6.

Эндо-43 12,7±0,3 0,8±0,1 — - 30.

Эндо-50 13,3±0,3 2,8±0,2 — - 20.

ЦБГ-55 4,0±0,14 0,95±0,06 0,016±0,001 0,015±0,001 100.

Величины константы Михаэлиса {Км) и максимальной скорости, отнесенной к концентрации фермента 1 мг/мл (V,/0, или максимальная удельная активность) лежали в диапазоне значений, известном для целлюлаз из других источников. Для сравнения, величина Км при гидролизе КМЦ для эндоглюканаз 1-У целлюлазного комплекса Р. уеггисикш/т лежала в диапазоне 12,5 — 50 г/л [205], а Км и V, при гидролизе МУФ-Ог для целлобиогидролазы 022 Р. х’еггисгйояит составляли 0,037±0,0035 мМ и 4,0±, 15 мкМ/мин [206].

8.4. Ингибирование продуктом реакции целлобиогидролазы целлюлазного комплекса С сеПиМуНсит.

В работе [207] было обнаружено, что целлобногндролаза I Т. гееле/ при действии на арил-(3-лактозид и арил-р-целлобиозид сильно ингибируется продуктами реакциилактозой и целлобиозой. Для ЦБГ-55 изучение ингибирования продуктами реакции (целлобиозой и лактозой, см. раздел 6.2) проводили при гидролизе соответственно МУФ-целлобиозида и МУФ-лактозида, определяя зависимости начальной скорости гидролиза МУФ-производных целлобиозы и лактозы от концентрации продуктов при различных концентрациях субстратов.

Полученные данные обрабатывались в координатах Диксона (рис. 18). Как видно из приведенных графиков, ингибирование продуктом реакции проходит и в том, и в другом случае по смешанному механизму с константой ингибирования 1±0,08 мМ в случае МУФ-целлобиозида и 2,8±0,22 мМ в случае МУФ-лактозида.

Рис. 18. Ингибирование ЦБГ-55 продуктом реакции. Зависимости начальных скоростей гидролиза МУФ-целлобиозида (а) и МУФ-лактозида (б) от концентрации соответствующего ингибитора, обработанные в координатах Диксона при различных концентрациях субстрата: 1 — 0,5 мМ- 2 — 0,25 мМ- 3 — 0,125 мМ (рН 5,0- 40°С).

8.5. Адсорбционные характеристики ферментов.

Для многих целлобиогидролаз и эндоглюканаз, наряду с каталитическим доменом, характерно наличие и сорбционного домена (например, для эндоглюканаз I, II и целлобиогидролаз I, II из Т. reesei [170, 172]), за счет которого осуществляется прочная сорбция ферментов на поверхности целлюлозы. Поэтому для выделенных ферментов целлюлазного комплекса С. cellulolyticum нами было проведено определение коэффициента распределения на МКЦ при комнатной температуре и различных концентрациях субстрата. Оказалось, что Эндо-25 и Эндо-50 вообще не адсорбируются на МКЦ, а Эндо-43 и ЦБГ-55 адсорбируются очень слабо (Ар = 0,01 л/г в обоих случаях). Полученные результаты косвенно свидетельствуют об отсутствии целлюлозосвязывающего домена в исследуемых ферментах. Интересным является тот факт, что, несмотря на вероятное отсутствие сорбционного домена в структуре ЦБГ-55, она обладала способностью гидролизовать нерастворимую целлюлозу, хотя в ряде случаев отмечено, что возможность гидролиза зависит от способности фермента адсорбироваться на субстрате. Так, целлобиогидролаза I, выделенная из А. ficuum, адсорбировалась на МКЦ и гидролизовала ее, а целлобиогидролаза II из того же комплекса не адсорбировалась и не гидролизовала нерастворимую целлюлозу [208].

8.6. Синергизм между эндоглюканазами и целлобиогидролазой.

Современные представления о схеме действия целлюлазного комплекса позволяют предположить, что в ферментной системе, состоящей из эндоглюканазы и целлобиогидролазы, можно наблюдать эффект синергизма: в результате гидролиза под действием эндоглюканазы в субстрате образуется большое количество концевых групп, которые далее подвергаются атаке со стороны целлобиогидролазы.

А— теоретическая сумма активностей ферментов —в— экспериментальная сумма активностей.

Содержание Эндо25 в смеси ферментов, %.

Содержание Эндо-50 в смеси ферментов, %.

Рис. 19. Эффект синергизма при совместном действии Эндо-25(а), Эндо-50(б) и ЦБГ-55 на микрокристаллическую целлюлозу (40°С, рН 5,25 мин).

В нашей работе изучение синергизма проводилось в реакционной системе, содержавшей МКЦ в качестве субстрата, каждую (одну) из выделенных эндоглюканаз и ЦБГ-55. В качестве коэффициента синергизма принималось отношение экспериментально определяемой активности (скорости образования ВС) в смеси ферментов к теоретической сумме активностей индивидуальных ферментов: результаты представлены на рис. 19. Как видно из приведенных графиков, в случае Эндо-25 максимального значения коэффициент синергизма достигал при соотношении эндоглюканазы к целлобиогидролазе 3:1 (по белку) и составлял около 1,3. В случае Эндо-50 максимальное значение коэффициента синергизма, равное 1,35, достигалось при соотношении эндоглюканазы к целлобиогидролазе 3:2. Явление синергизма в действии Эндо-43 и ЦБГ-55 на МКЦ не наблюдалось. Полученные значения коэффициента синергизма являются достаточно низкими и, возможно, свидетельствуют о незначительной осахаривающей способности исходного целлюлазного комплекса. Для сравнения, коэффициент синергизма в действии на ФБ эндоглюканазы В4 и целлобиогидролазы 0222 из целлюлазного комплекса Р. >ет<�снкт<�т, характеризующегося высокой способностью к осахариванию целлюлозосодержащих материалов, достигал максимального значения порядка 7 [222]. Максимальное значение коэффициента синергизма в действии на МКЦ эндоглюканазы-25 и целлобиогидролазы-022 из того же комплекса составило около 3 [206].

ГЛАВА 9. ИССЛЕДОВАНИЕ ВОЗМОЖНОСТИ ПРИМЕНЕНИЯ ЦЕЛЛЮЛАЗ С.

СЕниьоьтсим.

9.1. Тополитическая активность ферментов.

Как уже отмечалось в литературном обзоре (гл. 1), тополитическая активность отражает способность целлюлаз к «мягкому» действию на поверхность субстрата без глубокой деструкции целлюлозной матрицы. Результатом этого является, например, удаление ферментом красителя, микроворсинок, загрязнений с поверхности целлюлозы или целлюлозной ткани. Ранее [7] было показано, что тополитическую активность фермента можно охарактеризовать по эффективности удаления красителя с поверхности целлюлозной (джинсовой) ткани (депигментирующая способность).

Эксперименты по изучению депигментирующей способности целлюлаз С. сеНиМуИсит проводили при нормировании их по одинаковой весовой концентрации. Депигментирующую способность выражали в условных единицах, соответствующих интенсивности синего цвета на цветовой гистограмме изображения, полученного после сканирования образца джинсовой ткани, обработанной ферментом. В качестве контроля использовали ферментный препарат/5, сстеъсет #440.1 (11 201), который, как ранее было показано в нашей лаборатории, обладает высокой тополитической активностью. Кроме того, определяли депигментирующую способность и исходного ферментного препарата С. се11иЫу/гсит, из которого выделяли индивидуальные ферменты (исходный комплекс).

Результаты, представленные на рис. 20, свидетельствуют о том, что самый большой эффект обесцвечивания ткани и, следовательно, самую высокую тополитическую активность проявляла Эндо-25, причем данная эндоглюканаза не уступала препарату Р. сапеясет (34 усл.ед. в случае Эндо-25 и 36 усл.ед. для Р. сажьсет) и была значительно лучше ферментного препарата С. сеИиЫуИсит (19 усл.ед.). Эндо-50 имела наименьшую тополитическую активность, а Эндо-43 и ЦБГ-55 занимали промежуточное положение (следует заметить, что тополитическая активность целлобиогидролаз ранее в литературе не была отмечена).

Рис. 20. Тополитическая активность (депигментирующая способность) целлюлаз С. сеНиЫуНсит (концентрация белка = 0.3 мг/мл;

0,1 М Na-aцeтaтный буфер, рН 5,0- 50°С).

9.2. Оценка влияния целлюлаз С се11и! о1уНсшп на ресорбциго индиго.

В последнее время в процессах обработки джинсовых изделий с целью частичного удаления индиго ферменты практически вытеснили использовавшиеся ранее пемзу и химические реагенты. Однако при ферментативной обработке джинсовой ткани возникает одна немаловажная проблема — это ресорбция индигового красителя на белых нитях ткани, что портит внешний вид изделий для потребителя [210]. В ряде работ [6, 212] было показано, что главным фактором, способствующим ресорбции красителя, является связывание целлюлаз с поверхностью джинсовой ткани (адсорбционная способность фермента) — именно с адсорбированными ферментами связывается индиго при ресорбции. При этом, чем больше фермента сорбируется на поверхности ткани, тем выше степень ресорбции красителя. Поскольку исследуемые нами белки не адсорбировались на МКЦ, то логично было предположить, что при их использовании будет наблюдаться низкая ресорбция индиго на поверхности джинсовой ткани. Это предположение было проверено нами экспериментально.

Изучение влияния индивидуальных целлюлаз С. сеИиШуИсит на ресорбцию индиго (индекс ресорбции индиго) проводили при нормировании их по одинаковой весовой концентрации. Индекс ресорбции индиго (ИРИ) выражали в условных единицах, соответствующих интенсивности синего цвета на цветовой гистограмме изображения, полученного после сканирования образца белой хлопковой ткани, обработанной ферментом и индиго. В качестве контроля использовали ферментные препараты Т. гееяе1 (#210.27) и Р. ует/си1о.тт (#3−55.1), имеющие [41], соответственно, высокий и средний ИРИ. Кроме того, оценивали влияние на ресорбцию индиго и исходного ферментного препарата С. сеИиЫуйсит (исходный комплекс) (рис. 21).

Т.геехе! сходный комплекс С.сеНиШхпсит.

Эндо-43.

Р. хеггиси1овит.

Эндо-25 ч.

ЦБГ-55.

Эндо-50.

Рис. 21. Влияние целлюлаз С. се11и1о1уПсит наресорбцию индиго в процессе обработки хлопчатобумажной ткани (концентрация белка = 0,1 мг/мл- 0,1 М Иа-ацетатный буфер, рН 5,0- 50°С).

Как видно из приведенной диаграммы, все исследуемые ферменты, за исключением Эндо-43, имевшей среднее значение ИРИ, характеризовались низким значением ИРИ. Так, значение ИРИ для Эндо-25 и ЦБГ-55 было в полтора раза меньше среднего показателя, а для Эндо-50 — даже в 2 раза.

Таким образом, с одной стороны, нашла новое подтверждение точка зрения о влиянии адсорбционной способности целлюлаз на ресобцию индиго, а с другой стороны, мы установили, что ферменты С. сеПиМуИсит не оказывают большого влияния на усиление ресорбции индиго при ферментативной обработке хлопчатобумажной ткани. Обобщая результаты, представленные в этой главе, следует сказать, что мы установили возможность применения целлюлаз С. сеНиШуйсит для обработки текстильных изделий, поскольку они обладали способностью удалять индиго с поверхности джинсовой ткани не приводя к ресорбции красителя.

Резюмируя полученные данные, можно отметить, что среди выделенных компонентов целлюлазного комплекса С. сеПиМуИсит ферменты с молекулярными массами 25, 43 и 50 кДа являлись эндоглюканазами, а фермент с молекулярной массой 55 кДа — целлобиогидролазой. Эндо-25 и ЦБГ-55 проявляли высокую активность при нейтральных и щелочных рН. Эндо-25, Эндо-50 и ЦБГ-55 были устойчивы в широком диапазоне рН. Все исследованные компоненты целлюлазного комплекса С. сеПиМуИсит проявляли низкую способность к усилению ресорбции индиго при ферментативной обработке хлопчатобумажной ткани. Наибольшую тополитическую активность, оцененную по эффективности депигментации джинсовой ткани, проявляла Эндо-25. Таким образом, принимая во внимание высокую стабильность, активность и тополитическую способность этого фермента, его можно рассматривать как ключевую тополитическую эндоглюканазу целлюлазного комплекса С. сеПиШуИсит.

выводы.

• Разработана схема выделения «мажорных» компонентов целлюлазного комплекса С. сеИиШуИсит, которая заключалась в групповой очистке ферментов с последующим их тонким фракционированием методами высокоэффективной ионообменной, гель-проникающей хроматографии и хроматофокусирования.

• Впервые выделены гомогенные по данным аналитического электрофореза и изоэлектрофокусирования три эндоглюканазы (Эндо-25, Эндо-43, Эндо-50) и целлобиогидролаза (ЦБГ-55) целлюлазного комплекса С. сеПиЫуИсит, определены их биохимические, физико-химические характеристики и субстратная специфичность.

• Установлено, что Эндо-25, в силу ее высокой стабильности, активности и тополитической способности, является ключевой тополитической эндоглюканазой целлюлазного комплекса С. сеИиШуИсит.

• Установлено, что Эндо-25 относится к семейству К (45 семейство) (З-гликаназ, к которому также относится тополитическая эндоглюканаза V из Н. тзо1ет.

• Из ферментного препарата Т. geodes, полученного после клонирования гена тополитической Эндо-25 С. се11и1о1уИсит, выделена гомогенная по данным аналитического электрофореза и изоэлектрофокусирования рекомбинантная Эндо-25. Определены ее биохимические, физико-химические характеристики и субстратная специфичность.

• Показано, что рекомбинантная Эндо-25 по своим характеристикам (молекулярная масса, изоточка, субстратная специфичность, рН-оптимум, стабильность, тополитические свойства) практически не отличается от нативного фермента.