Мониторинг эндогенной моноокиси углерода в выдыхаемом воздухе человека и животных методами лазерного спектрального анализа

Основные направления и актуальность исследований.

Диссертация посвящена разработке методов определения содержания эндогенной моноокиси углерода (СО) в выдыхаемом воздухе человека и лабораторных животных, основанных на высокочувствительном лазерном спектральном анализе, исследованиям с помощью этих методов основных закономерностей выделения эндогенного СО живыми организмами и разработке на этой основе новых неинвазивных диагностических подходов, которые могут быть применены в физиологических и клинических исследованиях.

Актуальность определения содержания СО в выдыхаемом воздухе, а также разработок аналитических устройств, предназначенных для подобных измерений, обусловлена тем, что моноокись углерода является одним из эндогенных газообразных соединений, играющих значительную роль в жизнедеятельности организма. Особенности процессов ее образования в организме и транспорта от тканей и органов в выдыхаемый воздух в настоящий момент недостаточно хорошо изучены, а разработка подходов к использованию СО в качестве молекулы-биомаркера требует тщательных предварительных исследований. Для этих целей должны использоваться новые методы высокочувствительного, достаточно точного и селективного инструментального анализа содержания СО в выдыхаемом воздухе, которые стали доступными лишь в последнее время.

В организме эндогенное СО образуется в результате ферментативно-управляемого катаболизма (разложения) гем-содержащих соединений [1−3]. Основная его продукция обусловлена гемолизом эритроцитарного гема в ходе эритропоэза, направленного на устранение стареющих клеток крови. Кроме того, некоторая доля эндогенного СО образуется при деградации миоглобина, нейроглобина, цитоглобиа, цитохромов и ряда металлсодержащих ферментов, таких как каталаза, пероксидаза, триптофанпирролаза, гуанилатциклаза, NO-синтаза и других. Также возможно образование относительно малого количества СО негемовой природы за счет перекисного окисления липидов, фотоокисления, а также активности ксенобиотиков и некоторых бактерий [3]. Результаты недавних биохимических исследований показывают, что СО в организме является не только конечным продуктом метаболических превращений упомянутых выше соединений, но и сигнальной молекулой (т.н. вторичным мессенджером), участвующей в механизме преобразования сигналов, регуляции клеточного метаболизма и в передаче информации [4,5].

Во избежание избыточного накопления, СО интенсивно выводится из организма. Для этих целей, помимо диффузии, транспорта в растворенном состоянии и конвективного газообмена, используется специальный механизм обратимого связывания этих молекул гем-содержащими белковыми структурами (гемоглобин, миоглобин, цитоглобин, нейроглобин, цитохром-аЗ), кратковременного буферирования на них и транспорта по градиенту концентраций 02 -от клеток и тканей в легкие [2,6−9]. Для выведения СО используется та же цепочка механизмов, с помощью которой осуществляется транспорт кислорода из легких и обеспечение дыхания клеток, только действующая в обратном направлении. В клетках СО может быть связано цитоглобином, нейроглобином [7−9] или цитохромами-аЗ (в митохондриях клеток). В мышечных тканях СО накапливается на миоглобине, а в крови — на гемоглобине. За счет потока кислорода, проникающего с кровью в ткани и клетки, между этими системами буферирования СО происходит постоянный обмен, так что молекулы СО постепенно продвигаются в направлении от клеток к легким. В легких СО диффундирует из крови в воздушное пространство легких и затем за счет вентиляции при дыхании выводится в атмосферу. На заключительном этапе пребывания эндогенного СО в крови, т. е. в альвеолярных капиллярах, темп его выделения в воздушное пространство легких находится в непосредственной зависимости от перфузии и эффективности доставки кислорода к альвеолярной мембране легких [3]. Эта эффективность может меняться за счет вариации как газодинамических, так и диффузионных характеристик используемых дыхательных смесей.

Необходимо выделить несколько наиболее важных процессов, в которых эндогенное СО участвует в организме [1,3−5]. Во-первых, СО является вторичным мессенджером для нейромедиаторов и гормонов, поскольку активизирует работу фермента гуанилат-циклазы, участвующей в образовании циклического гуанизинмонофосфата. Последним определяется уровень кальция в клетке, от которого в конечном счете зависит активность протеин-киназ и некоторых биохимических процессов. Кроме того, СО участвует в механизме регуляции тонуса кровеносных сосудов и возможно влияет на внутриклеточные механизмы формирования долговременной памяти. Во-вторых, СО разделяет с О2 общую систему транспорта и буферирования, что позволяет использовать его как маркер при исследовании механизмов и самого транспорта кислорода. В-третьих, существуют предположения, что СО выделяется при воспалительных процессах и поэтому может быть использовано как маркер работы антиокси-дантной системы. Наконец, в-четвертых, основная функция молекул СО определяется их ролью в регуляции обновления клеток крови, т. е. СО может служить индикатором и маркером катаболизма.

Таким образом, для использования эндогенного СО в качестве биомаркера физиологических процессов существенным является то, что интенсивность выделения СО с выдыхаемым воздухом зависит от скорости продукции СО в организме, биохимических параметров среды в клетках и тканях организма и химического состава вдыхаемой газовой среды.

Благодаря этому использование высокочувствительного, высокоточного и селективного мониторинга эндогенного СО в выдыхаемом воздухе может быть актуально и перспективно для исследований:

• интенсивности метаболических и индуцированных процессов, связанных с образованием СО;

• диффузионных и конвективных процессов переноса кислорода в легких;

• эффективности процессов переноса кислорода кровью от легких к тканям, включая перфузию и тканевую микроциркуляцию;

• интенсивности основного обмена, образования и накопления кислых продуктов в условиях тканевой гипоксии.

Следует особо отметить, что одним из важных и перспективных аспектов данного подхода, основанного на анализе химического состава выдыхаемого воздуха, является возможность неинвазивных исследований некоторых важных параметров организма и базирующейся на них диагностики нормальных и патологических процессов.

Сложность анализа содержания эндогенного СО в выдыхаемом воздухе обусловлена несколькими факторами. Во-первых, чувствительность газового анализа СО должна быть на уровне 10 мкг/м3. Во-вторых, поскольку выдыхаемый воздух является сложной газовой смесью, требуется высокая селективность анализа. Применяемый метод должен обеспечить измерение следовых концентраций СО в присутствии азота, кислорода, паров воды, СОг и других компонентов выдыхаемого воздуха. В-третьих, измерения СО желательно проводить в масштабе времени близком к реальному, не применяя накопления, обогащения и фильтрации газовой пробы. В-четвертых, применяемый метод должен обеспечивать возможность для долговременного и непрерывного мониторинга содержания СО в выдыхаемом воздухе с тем, чтобы можно было исследовать достаточно медленные физиологические процессы.

Один из возможных подходов к решению данной проблемы состоит в использовании лазерных технологий спектрального анализа, в частности, методов диодной лазерной спектроскопии, которая является признанным лидером в области высокочувствительного и высокоселективного газового анализа. Именно этот подход был применен и развит нами в данной работе.

Цели и задачи исследований.

Целью диссертации являлось исследование основных закономерностей выделения эндогенного СО с дыханием у человека и животных с помощью методов высокочувствительного лазерного анализа и разработка на этой основе новых методов неинвазивной биомедицинской диагностики.

В задачи исследования входили:

• Проведение разработки методов и средств высокочувствительного анализа и мониторинга содержания СО в выдыхаемом воздухе человека и лабораторных животных, основанных на использовании перестраиваемых диодных лазеров.

• Разработка методов и алгоритмов анализа данных мониторинга параметров дыхания, кровообращения и выделения эндогенного СО.

Исследование закономерностей выделения эндогенного СО с выдыхаемым воздухом в норме, при изменении состава вдыхаемой газовой смеси (вариации содержания СО в атмосфере, гипероксия, гипоксия, гиперкапния) и при выполнении различных физиологических тестов, таких как физическая нагрузка, гипервентиляция, задержка дыхания.

• Исследование содержания СО в выдыхаемом воздухе при некоторых заболеваниях.

• Оценка возможностей использования анализа содержания эндогенного СО в выдыхаемом воздухе в целях биомедицинской диагностики.

Научная новизна.

Впервые методы высокочувствительного лазерного анализа были применены для определения и долговременного мониторинга содержания СО в выдыхаемом воздухе человека и лабораторных животных, что позволило исследовать основные закономерности выделения этого вещества с дыханием и продемонстрировать диагностическую значимость лазерного анализа СО в биомедицинских приложениях.

Впервые получены следующие результаты:

Разработан автоматический диагностический комплекс для измерения параметров газообмена, включающий в себя лазерный анализатор СО, анализаторы О2 и СО2, ультразвуковой измеритель потока газа. Основные технические параметры комплекса: Анализатор СО: время анализа — 5 счувствительность -5 мкг/м3- точность определения концентрации СО — 3%- объем аналитической кюветы — 1 лселективность анализа —100%- время непрерывного мониторинга — не ограничено. Анализатор 02: время анализа — 100 мсчувствительностьот 0.1%- точность — 1% от полной шкалы измерений. Анализатор СО2: время анализа — 100 мсчувствительность — от 0.01%- точность 0.2% всей шкалы измерения. Ультразвуковой измеритель потока газа: диапазон измерений -0.006−20 л/сточность измерений ~1%- инерционность — 2−10″ 3 ссопротивление дыханию — не выше 50 Паизмерения в кислородно-азотно-аргоновой и кислородно-гелиевой средах в диапазоне давлений от 0.1 до 25 МПА при парциальном давлении кислорода от 0.01 до 0.1 МПА и произвольном процентном соотношении азотной и аргоновой составляющих газовой смеси.

Разработаны методы регистрации выделения эндогенного СО в различных экспериментальных условиях на человеке и животных: метод отбора пробы в изолированную емкость для определения среднего количества СО, выделяемого за один выдох, в том числе, при использовании маневра с задержкой дыханияметода мониторинга концентрации СО в усредненном выдыхаемом воздухе для исследований выделения СО в покое, при дыхании искусственными дыхательными газовыми смесями и при выполнении физиологических тестовметод мониторинга концентрации СО в альвеолярном воздухеметод определения скорости выделения эндогенного СО с выдыхаемым воздухомметод исследования выделений СО с выдыхаемым воздухом в условиях гипербарии.

Установлены основные закономерности выделения эндогенного СО в норме и в покое. Определена средняя концентрация СО в выдыхаемом воздухе и альвеолярном воздухе, а также скорость выделения СО с выдыхаемым воздухом в норме. Обнаружено наличие циркадного ритма в скорости выделения СО с.

10 выдыхаемым воздухом. Продемонстрировано влияние загрязнений атмосферного воздуха экзогенным СО на содержание моноокиси углерода в выдыхаемом воздухе. Определена динамика выделения СО с выдыхаемым воздухом у курильщиков.

Установлены закономерности и измерены основные параметры динамики выделения эндогенного СО с выдыхаемым воздухом у людей и лабораторных животных при дыхании гипероксическими и гипоксическими дыхательными газовыми смесями, а также у лабораторных животных при сочетанном влиянии гипероксии и гиперкапнии и при дыхании газовыми смесями с добавлением аргона.

Определены основные закономерности и измерены основные параметры динамики выделения эндогенного СО при проведении различных физиологических тестов: физической нагрузки различной мощности и длительности, гипервентиляции различной глубины и задержек дыхания различной длительности. Для физической нагрузки продемонстрировано наличие корреляции изменений скорости выделения СО с выдыхаемым воздухом с рН артериализован-ной крови и с концентрацией лактата в капиллярной крови. Для гипервентиляции обнаружено наличие корреляции изменений скорости выделения СО с выдыхаемым воздухом с рН артериализованной крови.

Определены средние уровни выделения эндогенного СО с выдыхаемым воздухом при ряде заболеваний органов дыхания. В частности продемонстрировано снижение концентрации СО в выдыхаемом воздухе при хроническом обструк-тивном бронхите, фиброзах легких, анемии и бронхиальной астме. В случае идеопатической интерстициальной пневмонии обнаружено уменьшение скорости выделения СО с выдыхаемым воздухом, коррелирующее с уменьшением диффузионной способности легочной мембраны. Было продемонстрировано значительное увеличение выделения СО над нормой при поражениях печени.

Практическая ценность работы.

Разработаны инструментальные методы и средства для автоматизированного мониторинга содержания СО и других параметров дыхания у человека и лабораторных животных.

Сформулированы требования к условиям проведения анализа содержания эндогенного СО в выдыхаемом воздухе для целей биомедицинской диагностики.

Продемонстрирована возможность неинвазивного определения ряда важных физиологических параметров (скорости катаболизма гем-содержащих белков в организме, уровня гемоглобина, вариаций эффективности транспорта кислорода к тканям, вариаций кислотно-основного состояния в организме) с помощью анализа содержания эндогенного СО в выдыхаемом воздухе.

Показана возможность и эффективность предлагаемого подхода в исследованиях по спортивной и гипербарической физиологии. В частности, установлена связь динамики выделения эндогенного СО с выдыхаемым воздухом и лактатом крови при физических нагрузках. Так же разработанные методы могут быть использованы для изучения воздействия на организм индифферентных газов, таких как гелий, аргон и криптон, а также для контроля терапевтического воздействия на организм гипероксических и гипоксических газовых смесей.

Разработанные методы могут быть использованы для целей неинвазив-ной биомедицинской диагностике.

ПОЛОЖЕНИЯ ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ:

1. Применение методов диодной лазерной спектроскопии эффективно для высоко-чувствительного и высокоселективного анализа и долговременного мониторинга содержания эндогенной моноокиси углерода в выдыхаемом воздухе человека и лабораторных животных в реальном времени.

2. Динамика выделения эндогенной моноокиси углерода с выдыхаемым воздухом является показателем физиологического состояния организма при проведении различных функциональных проб и воздействии измененных факторов газовой среды. Отклонения скорости выделения эндогенного СО от нормы могут использоваться для неинвазивной биомедицинской диагностики.

Апробация работы.

Материалы диссертации докладывались и обсуждались на следующих международных, всесоюзных, всероссийских и региональных научных конференциях, симпозиумах и семинарах: Международной конференции SPIE «Биомедицинская оптика» (Лиль, Франция, 1994; Барселона, Испания, 1995; Сан-Хосе, США, 1995; Сан-Хосе, США, 1996), Международной конференции SPIE «Передовые технологии для мониторинга окружающей среды» (Денвер, США, 1996), Международной конференции SPIE «Биомедицинские датчики, визуализация и слежение» (Сан-Хосе, США, 1997), V Конференции по биологии при высоких давлениях (С.-Петербург, 1997), 7-ой Всероссийской школе по физиологии дыхания (Бологое, 1998), 11 Международной конференции по авиакосмической медицине и биологии (Москва, 1998), Международной конференции по заболеваниям органов дыхания и астме, (Сан-Диего, США, 1999), II Российской школе для практических врачей «Свободные радикалы и болезни легких» (Рязань, 1999), Конференции «Возможности и перспективы использования индифферентных газов в водолазной практике, биологии и медицине» (Москва, 1999), 11 Ежегодном конгрессе Европейского Респираторного Сообщества (Берлин, Германия, 2001), 12 Ежегодном конгрессе Европейского Респираторного Сообщества (Стокгольм, Швеция, 2002), 13 Ежегодном конгрессе Европейского Респираторного Сообщества (Вена, Австрия, 2003), 14 Ежегодном конгрессе Европейского Респираторного Сообщества (Глазго, Великобри-таня, 2004).

Кроме того материалы диссертации были представлены на семинарах ИОФАН им. A.M. Прохорова, семинарах ФИАН им. П. Н. Лебедева, ГНЦ РФ.

ИМБП РАН, Института пульмонологии РАМН, Московской медицинской академии, Берлинского технического университета, Берлинского университета им. Гумбольдта, Калифорнийского университета в Санта-Барбаре, Медико-биологического департамента Космического центра им. Дж. Кеннеди, НАСА, Семинаре по лазерной медицине Российской Лазерной Ассоциации и Общемосковском семинаре по проблемам физиологии дыхания и пульмонологии.

Диссертация была апробирована на заседании секции «Экологическая медицина и барофизиология» Ученого совета ГНЦ РФ — ИМБП РАН от 13.04.2005 г.

Публикации.

Основные результаты исследований по теме диссертации опубликованы в 17-ти статьях и тезисах докладов на конференциях.

Структура диссертации.

Диссертация состоит из введения, 4-х глав, заключения, приложения и списка литературы, изложена на 194-ти страницах печатного текста, включает 51 рисунок, 8 таблиц и список литературы из 171 наименований.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

.

Результаты данной диссертационной работы, основными целями которой являлись разработка методов высокочувствительного анализа и мониторинга содержания СО в выдыхаемом воздухе, основанных на использовании перестраиваемых диодных лазеров, исследование с помощью данного подхода основных закономерностей выделения эндогенного СО с дыханием у человека и малых животных и разработка неинвазивных методов биомедицинской диагностики, базирующихся на лазерном анализе состава выдыхаемого воздуха, позволяют сделать следующие выводы:

1. Методы диодной лазерной спектроскопии могут быть эффективно использованы для высокочувствительного и высокоселективного анализа и долговременного мониторинга содержания эндогенного СО в выдыхаемом воздухе человека и лабораторных животных. При использовании для спектрального анализа СО в выдыхаемом воздухе перестраиваемых диодных лазеров реализуются следующие параметры: спектральный диапазон.

— 4.7 мкм, чувствительность — 5 мкг/мЗ, динамический диапазон 5 мкг/мЗ.

— 100 мг/мЗ, селективность анализа — близкая к 100%, время анализа — 5 с, объем аналитической кюветы — 1 л, время непрерывного мониторинга — не ограничено.

2. Лазерный анализ позволяет детектировать в режиме близком к режиму реального времени вариации содержания эндогенного СО в выдыхаемом воздухе человека и лабораторных животных, обусловленные изменением параметров дыхания (гипервентиляции и задержке дыхания), состава вдыхаемой газовой смеси (в условиях гипероксии, гипоксии, гиперкапнии, при гипербарическом воздействии, вариациях СО в атмосферном воздухе и добавлении индифферентных газов) и физической активности.

3. В норме концентрация эндогенного СО в выдыхаемом воздухе человека имеет максимум в диапазоне 0.8−1.0 мг/м3 и рапределение ее отличается от нормального. Скорость выделения СО составляет 0.51 ±0.18.

157 мкмоль/мин. Выделение СО имеет циркадный ритм с максимумом в дневные часы и минимумом в полночь, глубина модуляции при этом составляет ~30%. Загрязнение атмосферного воздуха экзогенным СО и/или курение вызывает увеличение содержания СО в выдыхаемом воздухе, величина которого может достигать более 30 мг/м3.

4. При дыхании гипероксическими газовыми смесями наблюдается резкое возрастание скорости выделения СО с выдыхаемым воздухом. Динамика процесса выделения СО при дыхании чистым кислородом имеет следующие характеристики: относительное увеличение выделения в максимуме —600%, время релаксации (по уровню 0.5) составляет от 70 до 150 минут и определется уровнем гемоглобина в крови и диффузионными характеристиками легочной мембраны. Максимальная амплитуда зависит от концентрации кислорода, а также от уровня содержания С02 и Аг во вдыхаемой гипероксической газовой смеси.

5. Динамика выделения СО с выдыхаемым воздухом, обусловленная физической нагрузкой и гипервентиляцией, определяется объемом вентиляции, скоростью потребления кислорода и скоростью образования и/или выделения С02. Вариации скорости выделения СО коррелируют с изменением кислотно-основного состояния крови и содержанием молочной кислоты в крови. Концентрации и скорости выделения СО при физической нагрузке определяются мощностью и длительностью последней, диапазон их изменений составляет ~280%. При гипервентиляции концентрации и скорости выделения СО определяются объемом и длительностью гипервентиляции.

6. Кратковременная задержка дыхания (до 30 с) приводит к возрастанию концентрации СО в выдыхаемом воздухе, которое сменяется снижением скорости выделения при более длительных задержках. В норме относительное увеличение концентрации СО в выдыхаемом воздухе при задержке -30 с составляет -160%. Уровень концентрации СО, достигаемый при задержках 20−30 с зависит от положения тела испытуемого (лежа или сидя). Содержание СО в выдыхаемом воздухе, в том числе, динамика выделения при задержках дыхания, изменяется при патологиях органов дыхания и нарушениях катаболизма гем-содержащих белков, что может быть использовано для целей неинвазивной биомедицинской диагностики.