Нитроксидергические нейроны ядер черепных нервов продолговатого мозга позвоночных

Исследование нейромедиаторных и модуляторных закономерностей функционирования мозга остается до последнего времени одной из актуальных проблем теоретической и медицинской нейробиологии. Этому способствует совершенствование методических подходов к изучению нейрохимии мозга и выявление новых нейромодуляторных субстанций, активно вовлеченных в нормальное функционирование мозга, а также в генез ряда патологических процессов.

Открытие нового межклеточного посредника оксида азота (N0) повлекло за собой изменение традиционных воззрений на многие механизмы нейрональной сигнализации в центральной нервной системе (Bredt, 1999; Moncada, 1999). Многообразие нейротропного действия NO и его потенциальная роль в ключевых функциях нервной клетки вызываег восхищение у исследователя. NO как пространственный сигнал выполняет в мозге многообразные функции — от локальной регуляции нейронной активности и ее сопряжение с активностью местного кровотока (Beckman, 1991; Macrae et al., 1991; Mayer et al., 1995) до участия в механизмах синаптической пластичности при формировании нейроадаптивных перестроек в физиологических условиях и нейродегенеративных расстройств при патологии (Dawson et al., 1991). Кроме того, велика роль этого сигнального механизма в обеспечении оптимальных условий нейрогенеза на ранних его этапах и при формировании нервных связей в период постнатального онтогенеза (Okamura et al., 1994).

Появившиеся в потоке литературы новые идеи оказалось невозможным подтвердить без знания филогенетических закономерностей становления NO-ергического пути нейропередачи, происходившего, несомненно, в зависимости от эволюции мозга.

Согласно современным представлениям, внутриклеточная сигнализация — более древний тип передачи информации по сравнению с межклеточным. Поэтому механизмы сопряжения рецепторов с синтезом мессенджеров и сами принципы функционирования внутриклеточной сигнализации для всех позвоночных в основном общие. (Реутов и соавт., 1997).

Хотя синтез NO первоначально был зарегистрирован в периферических тканях (Ignarro, 1990; Furchgott, 1988; Palmer, 1988), идея об эволюционно закрепленной значимости NO-зависимой передачи нервного сигнала находит свое подтверждение в многочисленных работах по сравнительной нейроморфологии. NO-ергические нервные цепи существуют у бактерий (Hendriks et al., 2000) и в нервной системе беспозвоночных, в частости — двустворчатых моллюсков (Дюйзен с соавт., 1999; Анникова с соавт., 1999, Annikova et al., 2000, 2001). В этой связи эволюционная история NO-ергических систем нейропередачи у позвоночных пользуется в настоящее время повышенным вниманием.

Несмотря на изобилие публикаций, посвященных топографии NO-синтезирующих нейронов в мозге некоторых видов млекопитающих (Mizukawa et al., 1989; Vinsent, Kimura, 1992; Forster, Southam, 1993; Ruggiero et al., 1996; Krowicki et al., 1997; Gerlach et al., 1995) и человека (Egberongbe et al., 1994) до настоящего времени отсутствует сравнительный анализ распространенности этого мессенджера в ЦНС немлекопитающих позвоночных. Фрагментарные, а зачастую — и противоречащие друг другу данные существуют о распределении NO-синтезирующих нейронов в мозге некоторых видов рыб (Li, Fumes, 1993; Schober et al., 1994; Holmqvist et al., 2000; Villani, Guarnieri, 1995; Funakoshi et al. 1997,1999; Villani, 1999), амфибий (Flores et al., 1996; Bruning, Mayer, 1996,2000; Allaerts et al., 1997; Munoz et al., 2000;), рептилий (Bruning et al., 1994; Luebke et al., 1992), птиц (Bruning 1993; Panzica et al., 1994). В указанных исследованиях основной акцент делается на анализ NO-ергических центров конечного мозга, связанных с обработкой специфической — зрительной и обонятельной информации. К сожалению, внимание исследователей обходит стороной структуры продолговатого мозга, в частности — ядра черепных нервов, хотя хорошо известно, что совершенствование и прогресс в развитии ЦНС, особенно на ранних этапах филогенеза, напрямую обусловлен именно становлением метаболических потребностей организма, обслуживаемых этими нервами.

Поэтому целью настоящей работы было сравнительное гистохимическое исследование NO-ергической функции ядер некоторых черепных нервов продолговатого мозга в ряду позвоночных, включая человека.

Задачи исследования.

1. С помощью гистохимического метода на NADPH-диафоразу изучить наличие, локализацию и активность NO-ергических нейронов в чувствительных, двигательных и вегетативных ядрах черепных нервов (тройничного, языкоглоточного, блуждающего и подъязычного) у отдельных видов рыб, рептилий, амфибий, птиц и млекопитающих.

2. Провести количественную и качественную оценку распределения нитроксидергических нейронов в исследованных ядрах черепных нервов у разных позвоночных.

3. Изучить организацию NO-ергических нейронов ядер черепных нервов продолговатого мозга у человека.

4. Исследовать в сравнительном аспекте нитроксидергическую организацию ядра солитарного тракта млекопитающих и человека.

5. На основании полученных данных определить возможные направления эволюционного преобразования NO-ергического сигнального пути в мозге позвоночных.

Научная новизна. В настоящей работе впервые проведен сравнительный анализ распределения NADPH-диафораза-позитивных нейронов в ядрах черепных нервов продолговатого мозга позвоночных животных всех эволюционных групп, включая человека.

Впервые описана нитроксидергическая негомогенность ядра солитарного тракта у человека.

Дана количественная характеристика NO-синтезирующих нейронов в висцеросенсорных, висцеромоторных, соматосенсорных и соматомоторных ядрах черепных нервов продолговатого мозга у рыб (терпуга Hexagramus octogrammus, фолиса Pholis nebulosis, фолидапуса Pholidapus dybowskii, наваги Eleginus navaga, карася Carassius auratus), лягушки Rana temporaria, черепахи Trachemys scripta elegans, курицы Gallus domestica, крысы, кролика и человека.

На основании собственных и литературных данных представлена схема эволюции нитроксидергического сигнального пути в сенсорных, моторных и вегетативных ядрах черепных нервов продолговатого мозга позвоночных.

Теоретическое и практическое значение работы. Полученные в работе данные о топографии NO-синтезирующих клеток в своле мозга позвоночных расширяют представления о функциональных закономерностях эволюции нервной системы и могут быть использованы в области эволюционной нейроанатомии, нейрофизиологии и нейрохимии.

Апробация работы. Материалы диссертации были доложены на ежегодных научных конференциях студентов и молодых ученых Владивостокского медицинского университета (Владивосток, 1996;1999), IV международном симпозиуме фонда медицинского обмена Японии, России и стран Северо-восточной Азии (Саппоро, 1997), конференции молодых ученых России с международным участием, посвященной 240-летию ММА им. И. М. Сеченова (Москва, 1998), IV съезде российских морфологов с международным участием (Москва, 1998), 11-м Всероссийском съезде судебных медиков (Москва 2000), I и II Тихоокеанской научно-практической конференции студентов и молодых ученых-медиков с международным участием (Владивосток, 2000, 2001), научно-практической конференции «Медико-биологические и экологические аспекты здоровья человека на Севере» (Сургут, 2002).

Положения, выносимые на защиту.

1. Нитроксидергические нейроны определяются в структурах продолговатого мозга всех изученных видов позвоночных.

2. Ядро солитарного тракта человека и высших млекопитающих характеризуется неоднородностью распределения нитроксидергических нейронов.

3. Гомологичные структуры мозга на всем протяжении эволюционного развития проявляют сходный медиаторный (NO-ергический) химизм.

Структура и объем диссертации

Диссертация изложена на 123 страницах машинописного текста и состоит из введения, 4 глав, выводов и списка литературы. Диссертация иллюстрирована 28 рисунками и 2 таблицами.

7. Результаты исследования свидетельствуют о том, что в процессе филогенетического развития количество NO-синтезирующих нейронов в ядре солитарного тракта увеличивается, в спинальном ядре тройничного нерва остается неизменно низким, в дорсальном ядре вагуса у рептилий и амфибий NADPH-диафоразная активность отсутствует, появляется у птиц и сохраняется у млекопитающих. Двойное ядро содержит NO-ергические нейроны только у крыс и человека. Ядро подъязычного нерва NO-ергической активности не имеет на всех этапах филогенеза.

ГЛАВА 4.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

.

Несмотря на повышенный интерес исследователей к нитроксидергическому пути нейропередачи, этот процесс до настоящего времени остается загадочным и противоречивым. Эти противоречия касаются как самого распределения фермента синтеза NO в нервных центрах, клеточных типах в ЦНС животных, так и многоступенчатого процесса появления и исчезновения NOS-активных структур в филои онтогенезе мозга, а также — в неоднозначности физиологических эффектов N0 в развивающемся, здоровом и больном мозге.

Наибольшей (хотя и не абсолютной) стабильностью у всех представителей животного царства отличается лишь структура и биохимические особенности самого фермента синтеза N0.

В целом топография NO-синтазы показывает высокую степень гомологии распределения в некоторых нервных центрах позвоночныхпреоптическом поле, таламических ядрах, оптическом тектуме, ретикулярной формации среднего мозга, мозжечке. NADPH-d-позитивные клеточные группы обнаруживаются в гомологичных обастях мозга рыб, птиц (Bruning, 1993; Panzica et al., 1994), млекопитающих (Vinsent, Kimura, 1992). Вместе с тем характер ее топографического распределения в центральной нервной системе позвоночных может довольно сильно различаться. Так, например, с помощью биохимических и иммуноцитохимических методов доказано, что максимальные уровни NOS-активности у высших млекопитающих имеет мозжечок (Barjavel, Bhargava, 1994). В то же время у некоторых видов рыб (goldfish) в этой структуре мозга регистрируется очень низкая активность фермента (Virgili et al., 2001), приуроченная к клеткам Пуркинье (Oyan et al., 2000), N0-негативным у высших позвоночных (Охотин, Калиниченко, 1999). Аналогичные противоречия обнаруживаются также в обонятельных отделах и структурах спинного мозга, характеризующихся максимальной активностью фермента у рыб (Virgili et al., 2001) и очень низким содержанием его у высших позвоночных (Barjavel, Bhargava, 1994).

Клеточные популяции в составе гомологичных образований мозга у представителей разных типов позвоночных также различаются. Это касается в первую очередь мотонейронов передних рогов спинного мозга: у рыб, амфибий и рептилий они NO-ергические, у высших млекопитающих — нет. Уникальные клеточные типы мозжечка — униполярный кисточковый нейрон и клетка Люгаро — детально описаны в мозге крысы и кролика, соответственно, лишь благодаря их NO-ергической (NADPH-d) активности (Mugnaini, Floris, 1996; Калиниченко, Гарцман, 1998). В мозжечке других позвоночных видов эти нейроны в норме NO-негативны.

Данные, полученные с использованием ингибиторов NOS доказывают неоднозначную функциональную роль самого нитроксида в осуществлении его физиологических актов. Так, например, N0 оказывает преимущественно ингибиторный эффект на двигательную активность личинок амфибий Xenopus Larvae, в то время, как у другого (близкородственного) вида Rana его эффект на моторный выход прямо противоположный, несмотря на то, что морфологическое распределение его в моторных ядрах у сравниваемых видов животных оказывается идентичным (McLean et al., 2000).

Неоднозначны также эффекты NO на высвобождение разных нейротрансмиттеров в нейронах, солокализующих нитроксид. Так, NO потенцирует высвобождение ГАМК (Ohkuma et al., 98), ацетилхолина (Kilbinger, 1996), Kraus, Prast, 2001) и дофамина (Lorrain, Hull, 1993), но может взаимодействовать с предшественником синтеза серотонина (Fossier et al., 99) или самим нейромедиатором (Kuhn, Artur, 1997), угнетая серотонинергическую активность. Этими специфическими особенностями действия NO могут быть объяснены его разные модуляторные эффекты в различных регионах мозга.

Накопленные к настоящему времени данные свидетельствуют о том, что система NO-ергической медиации и ее функциональная предназначенность претерпевала значительные изменения в ходе эволюции.

Современные исследования сравнительно-эволюционного становления нервной системы базируются на двух фундаментальных подходах. Каждый из этих подходов вносит свой вклад в теории эволюции нервной системы. Один из них описывает те свойства нервной системы, которые обеспечивают морфологический субстрат передачи информации (т.н. критерий положения), а именно — характер и распределение клеточных популяций, особенности траектории их афферентно-эфферентных связей и т. д. (Сепп, 1959; Никитенко, 1969).

Другой подход акцентирует свое внимание на особенностях обработки информации на каждом этапе (т.н. критерий медиаторного химизма), изучая нейротрансмиттерные закономерности протекания физиологических процессов (Сахаров, 1974). Если карту мозга рассматривать с точки зрения медиаторной специфичности его клеточных популяций в эволюционном ряду, то она представляется в виде мозаики, рисунок которой на первый взгляд может показаться неупорядоченным и прихотливым. С одной стороны, не видно закономерностей связи между этой мозаикой и функциональной организацией нервной системы, поскольку распределение химически специфичных нейронов не следует за анатомическим членением нервной системы и в составе отдельных ядер нейронный состав достаточно полиморфен. Это теоретический подход оказывается применимым к изучению любой системы химической сигнализации, в том числе — и нитроксидергической.

В настоящей работе мы уделили внимание системам NO-ергической продукции в ядрах черепно-мозговых нервов позвоночных. Выбор исследуемых отделов мозга обусловлен тем, что развитие системы блуждающего нерва, ядра которого занимают основной объем продолговатого мозга, считается ключевым моментом формирования заднего мозга у рыб, а филогенетическое совершенствование его клеточного состава и связей отражает адаптивные перестройки, связанные с изменением условий жизнедеятельности у более высших систематических групп (Кононова, 1957; Бродал А., 1960; Боголепов, 1961). Мозговой центр, регулирующий деятельность органов, совместно вырабатывающих внутреннюю среду, начинает складываться уже на этапе круглоротых и, несмотря на многочисленные межвидовые особенности, общий план его устройства и основные закономерности функционирования остаются типовыми у всех позвоночных, включая человека (Оленев, 1987; Адрианов, 1995; Андреева, Обухов, 1999).

Полученные в нашей работе данные относительно гистохимического распределения активности синтеза оксида азота, при их сравнении с литературными, позволяют сделать некоторые обобщения:

1. Нитроксидергическая сигнализация, как путь межнейронной коммуникации, присутствует в структурах продолговатого мозга всех изученных видов позвоночных.

2. Гомологичные структуры мозга у представителей разных систематических групп имеют сходный медиаторный (NO-ергический) химизм.

3. Наибольшим филогенетическим постоянством обладает висцеро-сенсорный компонент ядер продолговатого мозга позвоночных.

4. Число и активность NO-ергических нейронов в гомологичных подразделениях продолговатого мозга позвоночных характеризуется выраженными межклассовыми и межвидовыми различиями, что является отражением разной функциональной иили эволюционной значимости этого сигнального пути.

5. Нейрохимическая дифференцировка ядра солитарного тракта в головном мозге позвоночных сопровождает его морфо-функциональное усложнение на этапах филогенеза.

6. Эволюционная история NO-ергического механизма нейропередачи в моторных подразделениях черепно-мозговых ядер подвержена значительным преобразованиям.

Эти главные выводы необходимо сопроводить большим количеством комментариев.

Функция оксида азота как посредника химической коммуникации нейронов зарегистрирована у всех представителей животного царства. Простейшие нервные системы червей, ганглионарные скопления насекомых и моллюсков имеют в своем составе нервные клетки, синтезирующие нитроксид (Martinez, 1995, Colasanti, Ventturini, 1998, Дюйзен, Анникова, 2000). Некоторые исследователи склонны считать, что зарождение NO-синтетической способности организмов происходило параллельно со становлением процессов внутриклеточного дыхания, когда использование микроорганизамами нитритредуктазных систем (наряду с цитохромоксидазными) повышало их адаптационные возможности в условиях недостатка кислорода (Реутов и соавт., 1997). До настоящего времени сохранились бактерии, в организме которых NO используется в качестве акцептора электрона в окислительном фосфорилировании. В этой связи предполагается, что эволюционная история этого сигнального пути происходит от внутриклеточного своего воплощения, постепенно приобретая возможности в осуществлении межклеточных коммуникаций (Реутов и соавт., 1997).

Вместе с тем у некоторых видов животных исследователями зарегистрированы так называемые «эволюционные провалы» NOергической функции, интерпретация которых до настоящего времени находится в рамках методологических возможностей. Будучи изоморфными, NO-синтазные системы организмов являются вместе с тем и достаточным полиморфными. К явлению полиморфизма можно отнести тот факт, что NOS I, II и III типов являются продуктами разных генов (Pollock et al., 1991). У большинства животных эти ферменты и кодирующие их нуклеотидные последовательности, в основном, характеризутся высоким уровнем сходства. Однако у некоторых видов моллюсков недавно были описаны специфические изоформы NOS (Korneev et al., 1997, Luckhart, Rosenberg, 1999). Химически вариабельными являются и ферменты синтеза N0 у эволюционно близких видов (например — моллюсков), что отражается в особенностях их иммуноцитохимического распределения (Hurst et al., 1999). Поэтому не исключено, что в тканях животных, якобы не имеющих NO-синтазы, присутствует особая ее изоформа, не выявляемая с помощью традиционных гистои иммуноцитохимических методов. Нельзя отрицать также, что в нервных структурах этих животных могут отсутствовать конститутивные формы энзима.

В продолговатом мозге исследованных нами видов животных NADPH-диафоразная реактивность всегда присутствует в висцеро-сексорных ядрах, в то время как сомато-моторные ядра (ядро подъязычного нерва) в норме NADPH-диафораза-негативны. Распределение NOS активности в висцеро-моторных (дорсальное ядро вагуса и его аналоги) и сомато-сенсорных (спинальное ядро тройничного нерва) подразделениях варьирует у представителей различных зоологических групп.

Подъязычный и блуждающий нервы формируют основной висцеральный сенсорный компонент у всех позвоночных — от рыб до млекопитающих. Однако центральные представительства этих нервов, имея значительное топографическое сходство, достаточно сильно отличаются в функциональном отношении (Northcutt, 1999). Поэтому интерпретацию NO-ергической активности этих структур невозможно проводить без анализа их филогенетических особенностей.

Система выработки стандартной внутренней среды у позвоночных складывалась постепенно, и вместе с тем происходило формирование центрального аппарата, организующего эту функцию в виде системы блуждающего нерва (Сепп, 19S9). Потребность постоянного снабжения кислородом органов и тканей сформировала аппарат дыхания, включающий в себя элементы гладкой и поперечно-полосатой мускулатуры, центры головного и спинного мозга и ряд гуморальных и нервно-гуморальных приспособлений. Общий план построения аппарата дыхания сохраняется в общем у всех позвоночных вплоть до человека. Однако, наряду с этим, существуют многочисленные функциональные и нейрохимические особенности нервной регуляции его работы у каждого.

У морских рыб особенно хорошо обеспечиваются необходимые свойства внутренней среды относительным постоянством свойств морской воды. У рыб нет каротидного интерорцепторного аппарата — функцию регистратора насыщения воды углекислотой выполняют у них экстерорецепторы — кожные вкусовые почки. Во вкусовых почках оканчиваются чувствительные волокна тех же нервов, которые образуют жаберные нервы — лицевого, языкоглоточного и блуждающего (Андреева, Обухов, 1999). В этой связи дыхательный центр рыб представляет собой прежде всего аппарат, осуществляющий автоматическую смену инспираторной и экспираторной фаз. Рыбы, живущие в условиях, неблагоприятных для дыхания, — придонные карповые рыбы — обладают менее совершенной системой адаптации дыхательной функции в связи с условиями окружающей среды. У них возбудимость дыхательного центра в случае недостатка кислорода наступает гораздо позже, чем общее повышение рефлекторной возбудимости. При переходе к наземному образу жизни нервы, приводившие у рыб импульс от вкусовых почек, объединяют свои корешковые волокна в так называемом солитарном тракте. В этот период происходит смена функционального значения вкусовых почек и смена функции дыхательного центра.

Система N0 является высокочувствительным сенсором гипоксических, шоковых, травматических и других метаболических сдвигов, происходящих тканях (Реутов и др., 1997). Поэтому вполне закономерно, что максимальная активность NO-ергической продукции приурочена к висцеро-сенсорному компоненту центральной регуляции функций организмов вне зависимости от их филогенетического положения. Это предположение подтверждается результатами настоящего исследования.

По нашим данным, ядро солитарного тракта и его аналоги у всех позвоночных имеют высокий уровень активности синтеза N0. По нашим данным, в мозге морских рыб NO-ергической активностью обладают около 60% нейронов вагусного комплекса. У карповых, в связи с особенностями их жизнеобитания, вагусные доли формируют два ламинарно организованных гигантских разрастания на боковых поверхностях продолговатого мозга. Сенсорный слой этих долей характеризуется максимальной нитроксидергической активностью, связанной, вероятно, с приходящими сюда чувствительными волокнами. Подтверждением тому является высокая активность NADPH-диафоразы в нейронах и волокнах чувствительных ганглиев.

Висцеральная сенсорная система рыб функционально может быть подразделена на экстероцептивный компонент, иннервирующий органы глотки и жаберные структуры через бранхиальные ветви вагуса, и интероцептивный компонент, иннервирующий внутренние органы через висцеральные ветви (Kanval, Caprio 1987; Funakoshi et al., 99). Результаты ретроградного мечения показали, что у некоторых видов рыб (T.NifloblesFunakoshi et al., 1999) NOS присутствует в обоих этих компонентах, в то время, как другие виды (T.Scyllia — Funakoshi et al., 1997) обнаруживают NOS реактивность только в висцеральном компоненте и лишь в небольшом числе волокон, принадлежащих жаберным ветвям и IX нерву. В этой связи предполагается, что висцеральная сенсорная NO-ергическая иннервация внутренних органов является общей чертой X нерва у всех позвоночных вплоть до человека, в то время как иннервация жабр характерна только для Teleost (пока нет данных о водных амфибиях, также имеющих жабры). Так, известно, что от 55 до 85% нейронов, формирующих бранхиальные нервы у рыб (cod fish, Gadus morhua), являются NO-ергическими (Gibbins et al., 1995). Однако вопрос об их тканевых мишенях является предметом дискуссий.

В своем исследовании Funakoshi с соавт., (1999) продемонстрировали, что жаберные ветви вагуса, содержащие NO, иннервируюг, преимущественно, артериальное русло жабр. Эти артерии у рыб выполняют барорецепторную (а также — хемоцептивную, проприоцептивную и ноцицептивную) функцию (Nilsson, 1984; Olsson, Karlia 1998). Предполагается, что свободные нервные окончания-барорецепторв 1 и 2 жаберных дуг у рыб являются аналогами таковых каротидного синуса и каротидного тела аорты (соответственно) у высших позвоночных и активируются при повышении кровяного давления. У крыс нитринергическая сенсорная вагусная иннервация каротидных образований зарегистрирована в работе Hohler с соавт. (1994). Здесь NO выступает как аутокринный модулятор активности барорецепторов за счет изменения активности натриевых каналов (Li et al., 1992). Таким образом NO представляется мощным модулятором кардиоваскулярной функции у всех позвоночных (от рыб до млекопитающих) на всех уровнях ее регуляции — от каротидной рецепции и проведении сигнала через первично-чувствительные нейроны до специфических центров ядра солитарного тракта (или его аналогов). Причем эта функция остается эволюционно закрепленной вне зависимости от устройства и локализации этих центров. Однако, без специальных исследований нельзя с точностью утверждать, что NO-ергическая регуляция дыхания у низших и высших позвоночных абсолютно идентична.

Важное изменение, которое претерпевает система блуждающего нерва у наземных позвоночных, связана с размежеванием функции дыхания и глотания. У наземных позвоночных, как установлено рядом авторов, углекислота крови оказывает аутохтонное действие на клетки дыхательного центра и кроме того, действует на каротидный аппарат. В реализации этих эффектов роль NO точно доказана. Так, например, перфузия изолированного мозга лягушки донорами N0 сопровождается электрофизиологической активацией респираторных центров, в то время как ингибиторы подавляют спонтанную активность этого региона (Hedric, Morales, 1999). По нашим данным, в мозге лягушки число NO-ергических клеток в солитарном ядре составляет около 40%, а у черепахи их число достигает 50%.

Следует отметить, что у всех этих видов животных NO-ергические нейроны распределены гомогенно на всей протяженности ЯСТ. Начало нейрохимической дифференцировки в ростро-каудальном протяжении ядра зарегистрировано нами в мозге птиц. Несмотря на относительно небольшое число (около 40%) NO-продуцирующих клеток, их распределение варьирует в зависимости от топографического уровня ядра. По-видимому, его NO-ергическая неоднородность у птиц отображает начало сенсорной и функциональной дифференцировки ядра солитарного тракта.

Ядро солитарного тракта высших позвоночных является цитоархитектонически сложным образованием мозга, участвующим в приеме, интеграции и передаче сенсорной информации, включая кардиоваскулярную, респираторную, гастроинтестинальную и вкусовую информацию (Loewy, 1990; Esteves et al., 2000). Каудальные его отделы являются местом первого синаптического контакта барорецепторов, хеморецепторов и сердечных афферентных волокон. Известно, что у млекопитающих первичные сенсорные нейроны этих ядер активно синтезируют нитроксид, а их афферентные волокна распространяются в трахее, каротидном теле и каротидном синусе и базилярной артерии. Кроме того, нитроксидергическая чувствительная вагусная афферентация широко представлена в пищеварительном тракте, особенно — пищеводе млекопитающих (Андреева и соавт., 1999).

Функциональную дифференцировку ядра солитарного тракта описывали многие авторы. Rugierro с соавт. (1996) показали, что это ядро участвует в модуляции висцеро-сенсорных сигналов и автономной рефлекторной функции. Так называемая вкусовая зона ядра, получающая афференты от оросенсорных (вкусовых) рецепторов, локализована в рострально-центральных отделах (Hamilton, Norgren, 1984). Трахео-бронхиальное дерево, гортань, глотка проецируются в дорсальное, промежуточное и интерстициальное подьядра (Lin et al., 2000) — пищевод, рот, желудок — в центральное ядро (Altshuler et al., 1989, Hamilton, Norgren, 1984 [крыса] Gwyn et al., 1985 [макака]). Показано, что NO-ергические нейроны центрального подьядра формируют основные проекции к двойному ядру кролика (Gai et al., 1995). В этом подъядре у крысы содержится максимальное число дважды меченых (NOS-нейронов +Glu волокон) структур (Lin et al., 2000). Желудок получает чувствительную иннервацию от желатинозного подьядра. (Lin et al., 2000). Каротидное тело и барорецепторы отправляют афферентную импульсацию в медиальное, комиссуральное и дорсо-латеральное ядро — так называемую кардиоваскулярную зону ядра солитарного тракта. Дорсо-латеральный регион содержит много дважды меченных (NOS+Glu)cTpyKTyp, в то время, как комиссуральное подьядро практически не имеет таких взаимоотношений (Lin et al., 2000).

Наше исследование позволяет зарегистрировать неравномерное распределение NO-ергических нейронов в подъядрах ядра солитарного тракта у млекопитающих.

Так, у крысы медиальное, вентромедиальное и интерстициальное подъядра характеризуются средне-интенсивным окрашиванием как нейропиля, так и нервных клеток. Желатинозное подьядро не содержит диафораза-позитивных нейронов, нейропиль его также не окрашивается. Промежуточное, дорсолатеральное и комиссуральное подъядра характеризуются высокой плотностью диафораза-позитивных нейронов на фоне низкоактивного нейропиля. В центральном подьядре отмечено высокая активность гистохимического окрашивания как нейронов, так и нейропиля. Солитарный пучок на NADPH-диафоразу не окрашивается. Всего в ядре солитарного тракта крысы фермент содержат около 65% нейронов.

На поперечных срезах продолговатого мозга кролика топография одиночного ядра и его подъядер не отличается от мозга крысы, однако характер гистохимического окрашивания его клеточных элементов несколько иной: в медиальном подьядре локализуется больше NADPH-диафораза-позитивных нейронов и волокон, в центральном и комиссуральном, наоборот, активность нейропильного окрашивания ниже. В желатинозном подъядре встречаются редкие диафораза-позитивные волокна.

У человека диафоразапозитивные нейроны ядра солитарного тракта имеют особенности в подъядерном распределении. Так, в промежуточном и интерстициальном подъядрах, в которые проецируются органы дыхания, отмечается низкая активность NO в нейропиле, однако промежуточное подъядро характеризуется высокой активностью диафоразы в нейронах. Центральное подъядро, получающее абферентацию от органов желудочно-кишечного тракта, имеет высокую активность как в нейропиле, так и в нейронах. Желатинозное подъядро, получающее сенсорную информацию от желудка, только у человека содержит небольшое количество волокон и нейронов. У остальных млекопитающих это подъядро характеризуется полным отсутствием диафораза-позитивных элементов. Медиальное, дорсолатеральное и комиссуральное подъядра — так называемая кардиоваскулярная зона ядра солитарного тракта — содержат большое количество NO-синтезирующих нейронов, медиальное и дорсолатеральное так же имеют высокоактивный нейропиль.

Методом ретроградного мечения было установлено, что большинство вагусных афферентов в ядре солитарного тракта являются NOS-позитивными (L.-H.Lin et al., 2000). В краниальных сенсорных ганглиях млекопитающих распределение NO-ергических клеток отличается. Например, большее их содержание обнаруживается в узловатом ганглии, меньше — в яремном и каменистом и самое меньшее — в тройничном (Aim et al., 1995, Ichikava, Heike, 1996, Kadota et al., 1996). Это свидетельствует о том, что в разных сенсорных системах черепно-мозгового обслуживания в норме N0 скорее всего участвует в висцеральных, а не соматических путях передачи информации. Подобное распределение было обнаружено также у некоторых рыб — dogfish (Funakoshi et al., 1997). Максимальная активность присутствует в первично-чувствительных нейронах так называемой «общей висцеральной сенсорной системы» (Finger, 1993) у рыб, которая представлена здесь ядрами IX и X пар черепных нервов и кроме этого, обрабатывает вкусовую и обонятельную информацию. Однако не все NOS-ергические волокна в этой структуре приходят с вагусным нервом. Предполагается, что другим их источником могут быть парасимпатические моторные нейроны и проекции от нейроэндокринных систем (Rugiero et al., 96). Кроме того большой вклад в афферентное обеспечение ядра солитарного тракта вносят NO-ергические клетки разных регионов продолговатого мозга (латеральное и парагигантоклеточное ядра ретикулярной формации и каудальные ядра шва), чья функция традиционно рассматривается как интеграторная регуляция сенсорных стимулов с вегетативными ответами (Esteves et al., 2000).

Итак, в нервной системе всех исследованных нами видов позвоночных, сенсорный компонент центральной висцеральной регуляции функций (ядро солитарного тракта и его аналоги) закономерно имеют NO-ергическую активность. Это особенное свойство выражено с таким постоянством, что позволяет судить об однотипных, эволюционно закрепленных механизмах обработки приходящей информации. Накопленные данные, хотя они и далеки от полноты, дают представление о том, что обработка этого типа информации осуществлялась достаточно сходным образом. Эти выводы подкрепляются результатами сравнительного исследования NO-ергических систем у беспозвоночных, где максимальная активность NO-продуцирующих систем регистрируется в хемосенсорных системах (Muller, Hildebrandt, 1995). Поскольку филогенетически различные животные имеют много сходных черт в обеспечении респираторного ритмогенеза, выдвинута гипотеза об эволюционной устойчивости этой функции (Tierney, 1996). Кроме того, у млекопитающих NADPH-диафораза-позитивные терминали в ядре солитарного тракта наиболее многочисленны в подъядрах, иннервирующих пищевод и желудок, и менее многочисленны в тех, что иннервируют трахею, глотку, гортань и кардиоваскулярные органы, что подтверждает идею о мощной NO-ергической модуляции вагусных рефлексов с органов пищеварительного канала. Таким образом предоминантное участие NO в вагусной висцеральной сенсорной системе, передающей информацию от целомических пищеварительных органов может считаться общим свойством всех позвоночных — от рыб до млекопитающих, поддержанным входе эволюции.

Не вызывает сомнений, что межклассовые различия в характере распределения позитивных нейронов определяются дифференцировкой и усложнением этой структуры мозга, наиболее ярко представленной в мозге высших позвоночных.

Соматосенсорный компонент представлен в продолговатом мозге спинальным ядром тройничного нерва. Характер распределения в не. NADPH-диафоразного окрашивания позволяет идентифицировать две зоны — поверхностную и глубокую. Первая характеризуется наличием редкого, средне-интенсивного нейропиля. В глубоком слое нейропиль окрашен в целом более слабо, но в нем встречаются немногочисленные средне-активные нейроны с радиально ветвящимися отростками. Здесь выявлено закономерно низкое содержание NO-синтезирующих нейронов у всех исследованных видов (от 2 до 9%).

В аналогичном исследовании Egberongbe с соавт. (1994), изучая распределение NO-синтазной иммунореактивности в мозге человека, так же описывает NO-синтазную активность в спинальном ядре тройничного нерва. При этом авторы не исключают возможности экспрессии фермента в ответ на периферическую болевую стимуляцию из области иннервации этого нерва.

Внсцеромоторный компонент ядер продолговатого мозга представлен дорсальным ядром вагуса и двойным ядром или их гомологами.

В нашем исследовании показано, что нервные клетки моторной зоны вагусного ядра золотистого карася имеют, в зависимости от вида, от 50 до 60% нитроксидергических нервных элементов. Полученные нами данные о наличии NO-ергической активности в нейронах моторных ядер изучаемых нами видов рыб находятся в соответствии с обнаруженными другими авторами (Villani, Guarnieri, 1995; Villani, 1999). В работе Gibbins с соавт. (1995) показано, что подавляющее большинство нейронов (55−85%), иннервирующих жабры, являются NO-ергическими, подтверждая, что наличие NO является характерным для краниальной парасимпатической системы на ранних стадиях эволюции.

В работе итальянских исследователей (Villani et al., 1994) показано, что у другого вида рыб (золотой рыбки) NADPH-d-нейроны, обнаруживающиеся в моторном слое вагусной доли, как и у других представителей ciprinid, связаны, в основном, с обслуживанием вкусового аппарата.

У наземных позвоночных (рептилий, амфибий) и у птиц, как показано в нашей работе, этот регион мозга NO-ергических клеток не содержит. «Восстановление» нитроксидергической продукции происходит в дорсальном вагусном ядре лишь у млекопитающих, однако их нейроны характеризуются более низким (по сравнению с рыбами) уровнем активности фермента. Так, если у рыб оптическая плотность варьирует в пределах 120- 125 ЕОП в зависимости от вида, то в мозга крысы, кролика и человека она не превышает 115 ЕОП. Максимальное количество NADPH-диафораза-позитивных клеток обнаружено у крысы (17−19%) и кролика (15−18%), у человека их доля несколько меньше — 8−11%.

Эволюционные колебания NO-синтетической способности моторных подразделений находят свое отражение и в онтогенетических их преобразованиях. Все мотонейроны на ранних этапах онтогенеза временно продуцируют NO (Villani, 1999). Это относится и к моторным ядрам ствола мозга человека, которые в процессе нейрогенеза также проходят несколько фаз чередования экспрессии и элиминации активности NO-синтазы. В последующем некоторые мотонейроны ствола сохраняют способность синтезировать нитроксид, а некоторые — теряют (Gonzales-Hernandez et al.,.

1994). Как видно из нашей работы, выполненной на мозге взрослых людей, до 10−12% нейронов двойного ядра и 8−11% клеток заднего ядра вагуса NO-продуцирующие. У крысы двойное ядро содержит 6−9% N0-ергических клеток В наших предыдущих работах (Shumatov et al., 1997) мы показали, что мотонейроны спинного мозга крысы и человека в норме не синтезируют нитроксид.

В условиях специфической патологии (перерезки периферических нервов — спинномозговых, подъязычного, блуждающего) мотонейроны черепных и спинномозговых нервов взрослых животных приобретают способность экспрессировать синтазу NO. Следует отметить, что эти изменения происходят параллельно со снижением метаболической активности (цитохромоксидазы) (Ichikawa, Helke, 92), что может служить проявлением перехода нейрона на более энерго-экономный путь метаболизма.

Функциональное значение N0 в моторных ядрах мозга до конца не ясно. Известно, что преганглионарный отрезок парасимпатического нервного пути сформирован, преимущественно холинергическим типом нейрона. (Мотавкин, Охотин, 1978, 1980). Будучи первым звеном парасимпатической регуляции тонуса гладкой мускулатуры, NO оказывает выраженное модулирующее воздействие на периферический выброс ацетилхолина. Исследование этих механизмов давно и с большим успехом проводятся группой, руководимой Мотавкиным П. А. (Мотавкин, Черток, 1979, 1980; Мотавкин, 1992; Мотавкин с соавт., 1997, 1999, 2000; Зуга, 1996, 1998; Зуга с соавт., 1996, 1997; Мотавкин, Гельцер, 1998; Гельцер с соавт., 1997, 2001; Невзорова с соавт., 1997, 1998; Елисеева 2000, 2001; Елисеева с соавт., 1997,1998,2000,2001).

Известно, что присутствие нитроксида например, в нейронах дорсального моторного ядра вагуса у крыс топографически согласовано с наличием в них фермента синтеза глутамата — фосфат-активируемой глутаминазы (Senba et al., 2001). Этот медиатор рассмаривается авторами в качестве ко-трансмиттера ацетилхолина в некоторых нейронах. Нитроксид находится с глутаматом во взаимомодулирующих взаимоотношениях, которые лежат в основе длительных нейропластических перестроек при патологии, либо могут обуславливать тоническое долговременное воздействие на свои мишени (Bliss, 1994).

Соматомоторная зона представлена ядром подъязычного нерва. Выделение этого ядра, происходящее уже у амфибий, вплоть до млекопитающих и человека не сопровождается появлением в его нейронах нитроксидергической медиации. У всех изученных в настоящей работе видов животных нейроны этого ядра NADPH-d-негативны.

Таким образом, изучая распределение активности NOS в структурах продолговатого мозга, можно зарегистрировать, что становление нитроксидергического сигнального пути подчинено общим законам эволюции — от диффузных, неспециализированных форм к дискретным специализированным формам структурной и функциональной организации.

Выявленные в нашей работе закономерности эволюции системы NO в ядрах черепных нервов продолговатого мозга позвоночных представлены в кладистиграмме (рис. 28). Изученные нами виды отмечены звездочкой. ft ч1) ^ ' «^ V. «' «v ' ft J о ft ft i< - 4 Л «4 ^ o-< ^.

V^Cvv 'vi W -' 's' ' * J У' > ft ' ft' -X- '- ft V * «» /- -/•" .

Hi Tiucl. nilcl. dors. -/HP uucl.tr. ambiguus n. vagi — ./vsma solitarius Рис. 28. Эволюция системы NO в ядрах черепных нервов продолговатого мозга позвоночных.

Трудность и неоднозначность в интерпретации любых эффектов NO, особенно в ЦНС, определяется тем, что даже в рамках выполнения одной специфической функции в пределах отдельного мозгового подразделения, N0 участвует в осуществлении нескольких параллельно протекающих процессов — его высвобождение из клеток-источников не только изменяет физиологическую активность нейронов-мишеней, но и определяет его нейротрансмиттерный потенциал. Кроме того, N0 активно включается в процессы синтеза, высвобождения и регуляции рецепторной чувствительности в собственном нейроне, а также обеспечивает сопряжение его синаптической активности с метаболическими потребностями (оптимизация кровотока, изменение процессов гликолиза и энергопотребления).

Однако, при кажущейся неспецифичности своих клеточных эффектов нитроксид зарекомендовал себя как весьма специфический участник физиологических и патологических событий. Известно, что отдельные виды мозговой патологии имеют точную топографию NO-зависимых эффектов. В этой связи исследователи единогласно приходят к мнению о том, что вектор действия NO-ергической трансмиссии определяется прежде всего специфическим характером нейротрансмиттерных и метаболических процессов воспринимающей стороны, определяя степень адаптивных и/или нейротоксических эффектов NO в них. Поэтому сравнительный подход к изучению эволюционного становления NO-ергического сигнального пути должен лежать в основе интерпретации биологической роли оксида азота в мозге.