Пространственная структура и динамика трансмембранных доменов эфриновых рецепторов EPHA1 и EPHA2 по данным спектроскопии ЯМР

Рецепторные тирозинкиназы (РТК) являются мембранными белками и занимают центральное место в регуляции роста, пролиферации, дифференцировки и продолжительности жизни клеток организма, а также в управлении апоптозом и подвижностью клеток. РТК-системы принимают непосредственное участие в управлении развитием и гомеостазом всех тканей человеческого организма. Нарушения функционирования сигнальных РТК-систем ведут к таким заболеваниям, как: онкологические заболевания, остеопороз, гипертония, атеросклероз, диабет, нарушения иммунитета, воспалительные процессы, фиброзы почек, печени и легких, различные нейродегенеративные патологии.

Разработка новых соединений, модулирующих активность биологически-значимых белков, является важной составляющей современной медицины. В настоящий момент крупные международные фармацевтические компании, активно использующие геномные и постгеномные технологии, в качестве одного из своих стратегических направлений развития выбрали создание лекарственных препаратов, селективно действующих на РТК (1). На сегодняшний день получено множество пространственных структур внеклеточных и цитоплазматических доменов различных представителей РТК, однако нет практически никаких данных о структуре трансмембранных (ТМ) доменов, более того, об их взаимодействии в мембране. Важность последнего подтверждается тем, что необходимым условием функционирования РТК является димеризация и олигомеризация в клеточной мембране. В связи с этим, большой интерес представляет понимание механизмов межмолекулярных взаимодействий в гетерогенной среде, которой является липидный бислой биологической мембраны.

В данной работе исследованы структурно-динамические свойства димеров ТМ доменов двух РТК — человеческих белков EphAl и EphA2 и изучена их связь с биологической функцией. Приведенные данные являюттся важными как в фундаментальном смысле — для понимания факторов, контролирующих белок-белковое взаимодействие в мембране клетки, так и в прикладном — могут свидетельствовать об уникальной роли ТМ домена Eph рецепторов, как мишени для селективного воздействия лекарственных препаратов.

Изученные белки являются представителями семейства эфриновых рецепторов, или Eph (от англ. Erythropoietin-producing hepatocellular), самого большого семейства РТК (2). Eph рецепторы участвуют во многих процессах развития тканей: координируют рост, дифференцировку и формирование практически всех органов и тканей, в частности, нервной, сердечнососудистой, иммунной систем, костной, и эпителиальной тканей. Взаимодействия эфриновых рецепторов и их лигандов могут вызывать различные клеточные ответы, например, изменение подвижности, адгезию, отталкивание, особенно для нейрональных и эндотелиальных клеток. Нарушения в функционировании Eph рецепторов и их лигандов характерны для процессов опухолеобразования и метастазирования.

2. Обзор литературы.

5. Выводы.

1. Методом спектроскопии ЯМР высокого разрешения определены пространственные структуры и описана внутримолекулярная динамика трансмембранных доменов белков рецепторов EphAl и EphA2 в липидных бицеллах. Показано, что белки образуют параллельные симметричные димеры. Прямыми методами спектроскопии ЯМР исследованы интерфейсы димеризации. В липидных бицеллах правозакрученная димеризация ТМ домена EphAltm происходит посредством сдвоенного аналога гликофоринового мотива GG4, а левозакрученная димеризация ТМ домена EphA2tm — посредством семичленного мотива.

2. Показана возможность димеризации ТМ доменов Eph рецепторов по нескольким альтернативным мотивам с различной относительной упаковкой субъединиц. Для ТМ домена EphAl экспериментально зарегистрировано переключение с N-концевого на С-концевой димеризационный мотив. Эти данные являются аргументом в пользу «вращательно-сцепленного» механизма активации рецепторных тирозинкиназ.

3. Для димера EphAl выявлена и исследована зависимость структуры и динамики димера от ионогенного состояния Glu547, что позволяет сделать предположение об особенностях механизма передачи сигнала рецептором внутрь клетки. Полученные данные указывают на уникальную роль EphAl рецептора в качестве сенсора локального клеточного окружения.

4. Выявлено и исследовано слабое взаимодействие между ароматическими и основными остатками, стабилизирующее третичную и четвертичную структуры димера рецептора EpliA2. Полученные данные свидетельствуют о функциональной значимости слабых ароматических взаимодействий в процессе передачи сигнала мембранными белками.

Заключение

.

Мне хотелось бы выразить глубокую благодарность и признательность моему научному руководителю, профессору, д.х.н. Александру Сергеевичу Арсеньеву, который обеспечил возможность выполнения настоящей диссертационной работы, оказывал своевременную помощь и поддержку и проявлял неустанное благожелательное внимание на протяжении всего времени моей работы в лаборатории.

Хочу поблагодарить весь коллектив нашей лаборатории за помощь в выполнении экспериментальной работы и плодотворные обсуждения. Особую признательность хочу выразить сотрудникам лаборатории Э. В. Бочарову, В. В. Чупину и И. В. Масленникову.

Благодарю весь коллектив отдела структурных методов исследования ИБХ РАН и особенно Р. Г. Ефремова, П. Е. Волынского и Е. О. Артеменко за значительный вклад проделанную нами в работу.

Приношу свою глубокую благодарность сотрудникам Лаборатории инженерии белка ИБХ РАН М. В. Гончарук, Е. Н. Ткач и Я. С. Ермолюку за предоставление белка для исследований.

Работа финансировалась грантами Российского Фонда Фундаментальных Исследований и министерства Образования и Науки.