Математическое моделирование процессов дерегуляции Ca2+-гомеостаза в нейронах головного мозга крысы при гиперстимуляции глутаматных рецепторов

Актуальность проблемы. Мозговая гипоксия/ишемия лежит в основе многих острых и хронических заболеваний центральной нервной системы, причем инсульт занимает одно из первых мест среди причин смерти людей в развитых странах. В течение последнего десятилетия достигнут значительный прогресс в изучении механизмов повреждения клеток мозга, вызванных ишемией/гипоксией. Установлено, что причина исключительно высокой (по сравнению с другими тканями) чувствительности клеток мозга к недостатку кислорода обусловлена нейротоксическим действием эндогенного возбуждающего нейромедиатора глутамата (Глу), высвобождающегося и накапливающегося в синаптических щелях при гипоксии.

Исследования, основанные на экзогенном воздействии Глу на культивируемые нейроны, позволили более детально изучать процессы, происходящие в нервных клетках при гиперстимуляции их высокими концентрациями Глу во время ишемии/гипоксии (Lipton, Р., 1999; Nicholls, D & Budd, S., 2000). Механизмы, посредством которых воздействие Глу может вызывать повреждение нейронов, пока до конца не ясны, однако установлено, что основным определяющим фактором является стойкое повышение.

2 о. 2— цитозольной концентрации Са ([Са '],), сохраняющиеся даже после устранения токсического воздействия Глу на нейрон. В настоящее время считается доказанным (Khodorov, В., et al., 1996 a, bKhodorov, В., et al., 1999; Vergun, О., 1999; Ходоров, Б., и др. 2001 а, б), что такое нарушение нейронального Са2+ гомеостаза обусловлено, главным образом, нарушением функционирования Са2±выводящих систем плазматической мембраны нервных клеток. Однако механизмы этого нарушения в настоящее время до конца не изучены.

Современный прогресс в изучении механизмов дерегуляции [Са2 ]i гомеостаза в большой мере связан с открытием роли митохондриальной дисфункции в этом процессе.

Nicholls, D & Budd, S. 2000). В частности, была выявлена высокая степень корреляции между Глу-индуцированным коллапсом потенциала на внутренней мембране митохондрий (А^м) и потерей клетками способности восстанавливать базальный уровень [Ca2″ ]i после Глу-воздействия (Khodorov, В., et al., 1996 aVergun, О., et al., 1999).

Настоящая работа посвящена изучению природы корреляции между митохондриальной деполяризацией (МД) и нарушением способности нейронов восстанавливать Са2^-гомеостаз после гиперстимуляции глутаматных рецепторов. С этой целью создана математическая модель, способная симулировать экспериментально 2 наблюдаемую динамику [Са ']- при воздействии на нейрон различных агентов. Модель оказала большую помощь в разработке экспериментальных подходов и интерпретации данных, полученных при изучении роли дисфункции митохондрий в механизмах нарушения [Са ], гомеостаза нейрона при токсическом воздействии Глу.

Цель работы. Целью данной работы было создание математической модели, позволяющей симулировать и проводить количественный анализ экспериментально наблюдаемых нарушений регуляции [Са2 ]i гомеостаза и ДЧ^ при гиперстимуляции Глу рецепторов нейронов головного мозга.

Основные задачи исследования. 1) На основе ранее опубликованных данных о системах регуляции Са2±гомеостаза нейрона создать математическую модель динамики [Са2 ]i в нормально функционирующем нейроне, устойчивом к токсическому воздействию Глу. 2) Исследовать с помощью этой модели различия в динамике восстановления [Са2″ ]- в различных нейронах после их кратковременного возбуждения. 3) Провести моделирование дерегуляции [Са2^], гомеостаза в молодых нейронах при воздействии на них Глу в сочетании с искусственно вызванной (с помощью митохондриальных ядов) деполяризацией митохондрий. 4) С помощью разработанной модели исследовать: а) механизм возникновения постглутаматного [Са2*]- платоб) природу дополнительного подъема [Ca2*]j при искусственно вызванной МД во время действия Глу на нейронб) Глу-индуцированные изменения [Са2*]- ответа при.

2 + десинхронизированной инактивации входящего и выходящего Са потока через нейрональную мембранув) правомерность гипотезы о вкладе митохондриального захвата Са2* и систем выведения Са2″ из нейрона в восстановлении базальной [Са2 ]{ в постглутаматный период. 5) Опираясь на результаты перечисленных выше исследований, построить модель нарушения [Са2″ ]- гомеостаза в зрелых нейронах, у которых Глу приводит к возникновению постглутаматного [Са ]i плато и сильной МД без применения митохондриальных ядов. С этой целью разработать феноменологическую модель деполяризации митохондрий и исследовать роль этой деполяризации в процессе дерегуляции [Са2 ]i гомеостаза во время и после воздействия Глу.

Научная новизна. На базе современных представлений о кинетике транспорта Са2* через плазматическую мембрану нейрона и процессов захвата и выведения Са2^ митохондриями в работе впервые создана математическая модель нарушений нейронального Са2 гомеостаза при длительном воздействии возбуждающего нейромедиатора Глу. С помощью этой модели проведена симуляция процессов деполяризации митохондрии при длительном воздействии Глу. Впервые для симуляции нарушении нейронального Са2″ гомеостаза при токсическом воздействии Глу в модель введена система инактивации механизмов нейронального входа и выведения Са, зависящая от концентрации цитозольного Са2* и МД. На основе теоретического анализа, проведенного с помощью модели, показано, что МД является необходимым условием возникновения нарушений Са2″ гомеостаза при гиперстимуляции Глу рецепторов нейрональной мембраны.

Научно-практическая ценность. Работа имеет выраженную фундаментальную направленность. Проведенные исследования позволяют углубить существующие представления о механизмах регуляции [Са2 ], как в физиологических условиях, так и патологических состояниях. Результаты исследований могут найти применение в теоретической и экспериментальной патофизиологии, исследованиях по моделированию различных патологических состояний нейронов мозга, связанных с нарушением ионного гомеостаза. Возможно использование модели как в учебном процессе, так и при повышении квалификации научных сотрудников для более наглядной иллюстрации л основных механизмов [Са ],-гомеостаза нейронов в нормальных условиях и его нарушении при патогенном воздействии на мозг.

Апробация работы. Результаты диссертационной работы докладывались на: Межлабораторном семинаре лабораторий мембранологии НЦЗД РАМН и лаборатории общей патофизиологии нервной системы НИИ ОП и ПФ., заседании кафедры физики живых систем Московского Физико-технического института (июнь 2000), научной конференции МФТИ (Долгопрудный, 1998).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 10 работ.

Структура и объем диссертации

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, изложения и обсуждения результатов, заключения, выводов, приложения и списка цитируемой литературы. Работа изложена на 134 страницах и включает 42 рисунка. Список цитирования включает 92 источника.

выводы.

1) Разработана математическая модель (М-1), которая показывает, что для симуляции изменении [Ca2+]j во время и после Глу воздействия в молодом нормально функционирующем нейроне достаточно построить систему дифференциальных уравнений, описывающих Са2″ -потоки между наружной средой, цитозолем, митохондриальным матриксом и митохондриальным Са2~буфером.

2) С помощью модели М-1 показано, что: а) различия в динамике восстановления [Са2 ]i после короткого возбуждающего стимула в нейронах периферической и центральной нервных систем можно объяснить, если принять, что нейроны ЦНС способны сохранять в течение длительного промежутка времени, накопленный при стимуляции Са2+, за счет более медленного высвобождения его из митохондрийб) дополнительный подъем Са2+ в ответ на искусственную деполяризацию митохондрий метаболическими ингибиторами во время действия Глу может быть симулирован только в том случае, если принять, что он обусловлен торможением митохондриального захвата Са2*.

3) Построена модель М-2, которая показывает, что для симуляции Глу индуцированных нарушений [Ca2+]j гомеостаза в молодых нейронах, при искусственной деполяризации митохондриальной мембраны, необходимо предположить, что МД в сочетании с высокой [Ca2″ ]j индуцирует развитие инактивационного процесса, который синхронно подавляет входящий и выходящий Са2+ -потоки через плазматическую мембрану нейрона. Этот инактивационный процесс, в сочетании с блокадой митохондриального захвата Са2+, приводит к возникновению постглутаматного [Ca2+]j плато.

4) Исследования проведенные с помощью модели М-2 позволили, во-первых, предсказать изменения [Ca2*]i при несинхронной инактивации входящих и.

117 выходящих Са2″ потоков через плазматическую мембрану (например, при аппликации Глу и метаболических ингибиторов на фоне воздействия олигомицина), во-вторых подтвердить предположение, что система захвата Са2″ митохондриями способна обеспечивать освобождение цитозоля от избытка Са2+ при блокаде системы выведения Са2+ из клетки.

5) Построена модель М-3, которая показывает, что для симуляции Глу индуцированных изменений[Са2″ ]- в зрелых нейронах, у которых Глу приводит к возникновению постглутаматного [Са2 ]i плато и сильной МД без применения митохондриальных ядов, необходимо ввести в модель систему митохондриальной деполяризации и принять, что эта деполяризация обусловлена повышением [Ca2+]i и накоплением внутри митохондрий фактора X, потенцирующего деполяризующие действие [Ca2+]i.

6) С помощью модели (М-3) показано, что вторая фаза МД является следствием регенеративного процесса, обусловленного наличием положительной обратной связи между изменениями [Са2 ]i и ДТМ: повышение [Ca2+]i усиливает МД, 1 которая, блокируя митохондриальный захват Са вызывает подъем [Са ]-. Этот регенеративный процесс завершается коллапсом ДЧ’м и установлением [Ca2″ ]i на уровне высокого плато.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

.

В настоящей работе сделана, насколько нам известно, первая попытка математического моделирования нарушения внутриклеточного Са2+ гомеостаза нейрона при токсическом воздействии возбуждающего нейромедиатора Глу на нервные клетки.

С этой целью первоначально была разработана математическая модель, позволяющая симулировать изменения [Са2*], в молодых, нормально функционирующих нейронах, устойчивых к нейротоксическому воздействию Глу. Для этого мы воспользовались опубликованными ранее данными о нейрональном транспорте Са2″, а именно: о Са2″ - потоках через плазматическую и митохондриальные мембраны нейрона и о связывании свободного митохондриального Са2″ с буфером. Для этого мы записали систему дифференциальных уравнений для изменения концентраций [Ca2+]j в цитоплазме, митохондриях и митохондриальном буфере (ур. 1−16). Оказалось, что с помощью этой системы уравнений, можно не только симулировать экспериментально наблюдаемые изменения [Ca2″ ]i в нормально функционирующем нейроне (Рис.9) на и проводить анализ причинно-следственных отношений лежащих в их основе.

Такой анализ позволил заключить, что различия в динамике восстановления уровня [Ca2″ ]i в различных (периферических и центральных) нейронах после возбуждающего воздействия можно объяснить различиями в функционировании их внутриклеточных оргенелл (Рис.12). Нейроны центральной нервной системы (гиппокампальных, кортикальных и церебеллярных) способны в течение длительного промежутка времени сохранять Са2+аккумулированный за время Глу воздействия в митохондриях благодаря медленному его выведению, тогда как более мощные системы выведения Са2″ митохондрий периферических нейронов (симпатических и нейронах дорзальных корешков) быстро освобождают их от избытка Са .

С помощью этой модели был симулирован наблюдаемый в эксперименте дополнительный подъем [Са2 ]-, вызываемый применением митохондриальных деполяризаторов (DNP, CN") во время воздействия Глу (13), и показано, что этот подъем обусловлен блокадой митохондриального захвата Са2+ на фоне его продолжающегося входа по Глу зависимым каналам, а не следствием частичного торможения систем выведения Са2+ из нейрона, как это предполагали некоторые авторы (рис. 25). Был также проведен анализ изменения [Ca2+]j ответа на воздействие Глу в зависимости от изменения различных параметров модели (рис. 10, 11, 13, 15), который показал, что данная модель ни при каких изменениях ее параметров не может симулировать стойкую.

2+ задержку восстановления [Са ]- в постглутаматный период при продолжающемся воздействии на нейрон митохондриальных деполяризаторов.

Для симуляции нарушения [Са2+]- -гомеостаза при сочетанном воздействии Глу и митохондриальных ядов нам пришлось ввести в модель систему инактивации транспорта Са2+ через нейрональную мембрану. При этом, мы приняли, что эта инактивация: а) зависит от [Са2″ ], и ЛЧ^Мб) синхронно тормозит как входящий, так и выходящий из нейрона Са2+ потоки (ур. 17−32).

В таком виде модель позволила не только симулировать высокое постглутаматное [Ca2+]i плато, но и показать правомерность гипотезы о взаимозаменяемости систем транспорта Са2″ через плазматическую и митохондриальную мембраны в процессе 2 освобождения цитозоля от избытка Са (рис. 14, 17). Моделирование также показало, что сложная динамика изменения [Са2″ ], при совместном действии на нейрон Глу, митохондриальных деполяризаторов и блокатора митохондриальной АТР-азы олигомицина и может быть объяснена десинхронизацией процессов торможения входящего и выходящего потоков Са2″ через плазматическую мембрану.

С помощью этой модели был проведен анализ динамики постглутаматного восстановления [Ca2*]i, и динамики изменений [Ca2+]i при удалении наружного Са2+ во время действия Глу в зависимости от параметров системы инактивации Са2* транспорта нейрональной мембраны (рис. 29, 31).

Проведенные с помощью математического моделирования исследования, в сочетании с накопленным экспериментальным материалом, позволили показать, что эти нарушения, могут быть количественно описаны, если принять что: МД во время Глувоздействия является не только непосредственной причиной блокады.

2+ 2+ митохондриального Сазахвата, но в сочетании с высоким [Са ], играет ведущую роль в механизмах инактивации Сатранспортных систем нейрональной мембраны.

Следующим этапом наших исследований было моделирование изменения [Са2 ]- в зрелых нейронах, у которых Глу приводит к возникновению постглутаматного [Са2*]- плато и сильной МД без применения митохондриальных ядов. С этой целью мы симулировали экспериментально наблюдаемую динамику МД, для чего ввели в модель систему уравнений описывающих зависимость МД от [Са ]- и изменили имеющиеся уравнения так, чтобы симулировать влияние МД на [Са ]j. Полученная таким образом модель способна симулировать изменения [Ca2+]i и ДЧ^ в зрелых нейронах при длительном воздействии Глу (ур. 33−37). Длительное воздействие Глу вызывает в нейронах двухфазную МД в сочетании с двухфазным подъемом [Ca2+]i. Удаление Са2″ или блокада Глу-зависимых каналов в одних нейронах приводит к восстановлению Са2* а в других не влияет на [Са2″ ]- уровень. Мы считали это различие можно объяснить тем, что в последних инактивационные процессы развиваются быстрее, чем в первых. Моделирование показало, что экспериментально наблюдаемую динамику деполяризации внутренней мембраны митохондрий, можно симулировать, если принять, что существует некий деполяризующий фактор X, накопление которого приводит к усилению зависимости МД от [Ca2+]i и, как следствие, возникновению второй сильной фазы МД, и что обе эти фазы МД сильно зависят от [Ca2″ ]i (рис. 35−36).

Было также обнаружено, что блокада митохондриального захвата Са2*, вызванная МД, и развитие инактивации являются необходимыми и достаточными условиями для симуляции: 1) [Са2+], ответа и МД у зрелых нейронов при длительном воздействие Глу и 2) изменения [Ca2″ ]i и МД в ответ на удаление наружного Са2+ или фармакологическую блокаду Са2т каналов в начале второй фазы [Са2+]- подъема- 3) нечувствительность постглутаматного [Ca2+]i плато к этим воздействиям.

Таким образом, предложенная модель способна симулировать экспериментально наблюдаемые нарушения [Са2 ]i гомеостаза и коллапс ДТМ при гиперстимуляции Глу рецепторов нейронов головного мозга.

Исследования, проведенные с помощью этой модели, показали, что вторая фаза МД является следствием регенеративного процесса, обусловленного наличием положительной обратной связи между изменениями [Ca2*]i и Д? м. Это может быть.

1 го 2+ 1 наглядно продемонстрировано, если зафиксировать уровень [Са ]ilj- = 0) или dt dMP зафиксировать ДЧ^м (-= 0) во время развития второй фазы МД. Такое dt клампирование" приводит либо к резкому торможению падения ДЧ’м либо к резкому прекращению роста [Са2+], (рис. 39).

По нашей гипотезе — повышение [Ca2~]j вызывает деполяризацию митохондриальной мембраны, при этом происходит снижение скорости потенциалзависимого захвата Са2+ митохондриями, что, в свою очередь, приводит к повышению [Ca2+]j (рис. 40). Кульминацией этого патологического регенеративного процесса является постглутаматное [Са2*]- плато, обусловленное полным прекращение.

2+ 2-митохондриального захвата Са и инактивацией систем транспорта Са через нейрональную мембрану.

Таким образом, дерегуляция [Са ], гомеостаза нейронов при гиперстимуляции Глу рецепторов является следствием порочного круга между изменениями [Са2^], и ДТМ, а причиной возникновения этого порочного круга является накопление фактора X, потенцирующего деполяризующие действие [Ca2+]i.

Важным результатом исследований, проведенных с помощью предложенной нами модели, следует считать именно предсказание возникновения и накопления фактора X в митохондриях во время токсического воздействия Глу и коллапса ДЧ’м. При варьировании скорости накопления X установлено, что длительность первой фазы МД и [Са2 ]i сильно зависят от этой величины. Моделирование показало, что в случае медленного накопления фактора X во время Глу воздействия Глу-индуцированные изменения [Ca2+]i и ДЧ^ становятся сходными с теми, которые наблюдаются у молодых нейронов, устойчивых к токсическому действию Глу (рис. 41−42). Таким образом, проведенное математическое моделирование позволило поставить вопрос об идентификации фактора X, что, по всей видимости, даст ответ на вопрос о механизме Глу нейротоксичности. Исследования в этом направлении активно ведутся в нашей лаборатории.