Фотометрический НСТ-тест с нейтрофилами крови человека и его клинико-иммунологическая значимость у больных с травмой опорно-двигательного аппарата

АКТУАЛЬНОСТЬ ТЕМЫ

.

Нейтрофильные гранулоциты (НГ) являются основными эффекторами противоинфекционных механизмов иммунитета. Среди широкого спектра проявлений функциональной активности нейтрофилов особое место отводится кислородзависимому метаболизму — уникальной системе немитохондри-ального дыхания клетки, которое резко возрастает в процессе клеточной активации и потому носит название «респираторного взрыва». Этот процесс сопровождается повышенным потреблением глюкозы и кислорода, а также увеличением продукции активных форм кислорода (АФК): супероксид аниона, пероксида водорода, гидроксил радикала и синглетного кислорода (А.Н. Ма-янский, Д. Н. Маянский, 1989; S.W. Edwards, 1994). Кислородные радикалы являются не только основой антимикробного потенциала нейтрофилов, но и активными регуляторами тканевого метаболизма человека (Н.И. Бахов с со-авт., 1988; И. И. Долгушин, О. В. Бухарин, 2001). Показана высокая информационно-диагностическая значимость исследования кислородзависимого метаболизма нейтрофилов при бактериальных и вирусных инфекциях (R.D. Feigin, L.K. Pickering, 1975), коллагенозах (М.М. Дейл, 1999), сердечно-сосудистых заболеваниях (S. Kausalya, J. Nath, 1998), респираторном дистресс-синдроме (Г.А. Рябов, 1994) и деструктивном панкреатите (B.C. Тарасенко с соавт., 2000). Однако, особенности метаболической активности НГ при травме опорно-двигательного аппарата изучены недостаточно.

Заболевания и травма крупных суставов занимают одно из ведущих мест среди причин временной нетрудоспособности и инвалидизации больных (О.Ш. Буачидзе с соавт., 2001). Отмечается неуклонный рост количества медиальных переломов бедра, что связано с увеличением доли пожилых людей среди населения (G.H. Anderson et al., 1993; Н. Burger, 1999; С.Е. DeLaet, Н.А. Pols, 2000). Современным подходом к решению этого вопроса является выполнение первичного эндопротезирог-ания тазобедренного сустава (В.П. Охотский, И. Ю. Клюквин, 1999; Н. В. Корнилов, 2000; G.M. Robbins et al., 2001). Проведение оперативного вмешательства у пациентов старших возрастных групп на фоне посттравматической и возрастной иммуносупрессии, большого числа сопутствующих заболеваний, определяет необходимость оценки состояния иммунной системы, включая изучение функциональной активности нейтрофилов. Так, показана прогностическая значимость показателей гуморального звена иммунитета (уровень циркулирующих иммунных комплексов и интерлейкина-1) у пациентов с дегенеративно-дистрофическими заболеваниями тазобедренного сустава, подвергнутых эндопротезированию (А.В. Костюшко, 2000). Предложены схемы иммунодиагностики осложнений при эндопротезировании суставов, включающие определение уровня иммуноглобулинов классов М w G, активности NK-клеток, содержания малонового диальдегида, скорости и реакции торможения миграции лимфоцитов (Г.Л. Плоткин с соавт., 2001). Однако, целенаправленная оценка функциональной активности НГ, а также иммунокоррегирующая терапия не проводилась.

Одним из основных методов исследования функциональной активности НГ является тест с нитросиним тетразолием (НСТ). Метод основан на способности практически бесцветного НСТ восстанавливаться кислородными радикалами в темно-синий диформазан (ДФ). Наибольшее распространение в клинической практике получили варианты визуального учета НСТ-теста, основанные на микроскопическом подсчете процента нейтрофилов, содержащих в цитоплазме гранулы ДФ (В.Н. Park, S.M. Fikrig, Е.М. Smithwick, 1968; Т. К. Бумагина, Е. И. Шмелев, 1981; В. И. Щербаков, 1989; Б. С. Нагоев, Н.Г. Ораза-ев, 2000).

Основными недостатками такого подхода является отсутствие количественной регистрации кислородных радикалов, генерированных пулом нейтрофилов, а также субъективность учета результатов реакции. Для объективизации оценки результатов исследования предложены различные варианты фотометрического учета НСТ-теста (R.L. Baenher, D.G. Nathan, 1968; В. К. Вагнер с соавт., 1989; B. EL Мельников, 1991; М.Р. Richardson et al., 1998; М.В. Че-решнева с соавт., 2000). Эти методики подразделяются по способу экстрагирования восстановленного НСТ и регистрации оптической плотности полученного раствора. Экстракцию ДФ осуществляют органическими растворителями (диоксан, пиридин, диметилформамид) на кипящей водяной бане, а оптическую плотность регистрируют с помощью спектрофотометра (A.JI. Не-вмятуллин с соавт., 1985; В. К. Вагнер с соавт., 1989; М.Р. Richardson et al., 1998; М. В. Черешнева с соавт., 2000). Однако использование кипящих токсических растворителей, больших объемов реагентов и отсутствие автоматизированной регистрации результатов реакции существенно ограничивают производительность и значительно повышают трудоемкость исследования функциональной активности НГ в клинико-лабораторной практике. В этой связи, ряд исследователей (G. Virella et al., 1990; Е. П. Киселева и А. В. Полевщиков, 1994; А. А. Капралов с соавт., 1997) предлагают регистрировать результаты НСТ-теста с помощью многоканальных фотометров в 96 луночных иммунологических планшетах. Однако использование реактивов, изменяющих функциональное состояние клеток, незначительный диапазон получаемых результатов, отсутствие контролей на реагенты, ограничивают их широкое использование.

Таким образом, до настоящего времени отсутствуют доступные и объективные методы количественного исследования кислородзависимого метаболизма нейтрофиловне представлена характеристика функциональной активности лейкоцитов у пациентов с травмой опорно-двигательного аппаратане изучена динамика кислородного метаболизма НГ в зависимости от выбранной тактики лечения медиальных переломов бедране обосновано проведение иммунокоррекции у больных после первичного эндопротезирования тазобедренного сустава.

ЦЕЛЬ ИССЛЕДОВАНИЯ:

Разработать фотометрический НСТ-тест с нейтрофилами крови человека и оценить его клинико-иммунологическую значимость у больных с травмой опорно-двигательного аппарата.

ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ:

1. Оптимизировать процедуру выделения и количество нейтрофильных гранулоцитов крови человека, участвующих в реакции восстановления НСТ.

2. Усовершенствовать условия проведения НСТ-теста и способ фотометрической регистрации его результатов.

3. Провести сравнительную оценку кислородзависимого метаболизма нейтрофилов крови здоровых и пациентов с различной патологией.

4. Оценить клинико-иммунологкческую значимость разработанного НСТ-теста для оценки эффективности иммунокоррекции у больных после первичного эндопротезирования тазобедренного сустава.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА:

Разработан способ диагностики функционального состояния нейтрофилов человека (патент Российской Федерации на изобретение № 2 218 567 от 24.12.2003), основанный на использовании высокоочищенного пула нейтрофилов крови человека при заданной концентрации и соотношении клетка/индуктор, а также двух-волновой регистрации продуктов реакции с помощью многоканального фотометра.

Обосновано использование заданной концентрации нейтрофилов (50 0000±50 ООО клеток/лунке), опсонизированного и неопсонизированного зимо-зана в соотношении 20±2 частиц/клетку в качестве индукторов кислородзависимого метаболизма нейтрофильных гранулоцитов, а также 2-х волновой (тестовая А,=630 нмреферентная А.=490 нм) регистрации продуктов реакции в НСТ-тесте.

Доказана высокая чувствительность разработанного варианта НСТ-теста для оценки активности процесса образования активных форм кислорода при воздействии ингибиторов кислородзависимого метаболизма нейтрофилов.

Показана высокая информационная значимость использования двух корпускулярных индукторов кислородзависимого метаболизма нейтрофильных гранулоцитов (опсонизированный и неопсонизированный зимозан) для оценки дискретности клеточного ответа, опосредованного через различные рецепторы и внутриклеточные пути активации.

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ:

На разработанный способ диагностики функционального состояния нейтрофилов человека оформлено рационализаторское предложение (№ 662, НИИ скорой помощи им. Н.В.Склифосовского) и с 1999 года метод используется в практической деятельности лаборатории клинической иммунологии и диагностики СПИД.

Выявлено, что 47% больных со свежими медиальными переломами бедра имеют нарушения кислородзависимого метаболизма нейтрофилов и обосновано проведение у них профилактической иммунокоррекции с помощью препаратов, обладающих выраженным эффектом в отношении фагоцитарного звена иммунитета.

С помощью фотометрического НСТ-теста в травматологическую практику внедрен алгоритм иммунологического пособия пациентам с медиальными переломами бедра, заключающийся в приоритетном исследовании в предоперационном периоде метаболической активности нейтрофилов, выявлении им-мунокомпромитированных пациентов и включении в схему послеоперационного ведения таких больных иммунокорректоров.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ.

Результаты работы доложены на юбилейной научной конференция «Современные технологии и перспективы развития военной травматологии и ортопедии» (Санкт-Петербург, 2000) — городской научно-практической конференции «Первичное эндопротезирование тазобедренного сустава у больных пожилого и старческого возраста с медиальными переломами бедра» (Москва, 2001) — всероссийской юбилейной научно-практической конференции «Лечение сочетанных травм и заболеваний конечностей» (Москва, 2003) — межклинической конференции проблемно-плановой комиссии по неотложной травматологии НИИ скорой помощи им. Н. В. Склифосовского (Москва, 2003).

ПУБЛИКАЦИИ.

По теме диссертации опубликовано 11 работ, получен патент РФ на изобретение.

ОБЪЕМ И СТРУКТУРА ДИССЕРТАЦИИ.

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, трех глав собственных исследований, заключения, выводов, рекомендаций в практику и списка цитируемой литературы, состоящего из 83 отечественных и 130 зарубежных источников. Диссертация изложена на 129 страницах, содержит 10 таблиц, 17 рисунков.

выводы.

1. Разработан чувствительный количественный фотометрический НСТ-тест, основанный на использовании высокоочищенного (98%) пула нейтрофилов крови человека при заданной концентрации и соотношении клетка/индуктор и двух-волновой регистрации продуктов реакции.

2. Стандартизованы условия проведения НСТ-теста, включающие использование нейтрофилов (500±50 тыс. клеток в лунке), индукторов опсонизиро-ванного и неопсонизированного зимозана (20±2 частиц на клетку) с тестовой (при 630 нм) и референтной (при 490 нм) фотометрией конечного продукта в лунке планшета, обеспечивающие высокую воспроизводимость результатов исследования.

3. Определены референтные значения фотометрического НСТ-теста нейтро-фильных гранулоцитов первичных доноров крови и регламентированы нормативные параметры для их использования в клинико-иммунологических лабораториях.

4. Клинической апробацией доказана высокая эффективность предложенного НСТ-теста для оценки патологических состояний человека, сопровождающихся как активацией кислородзависимого метаболизма нейтрофилов, так и его подавлением.

5. Показана высокая информационная значимость применения двух корпускулярных индукторов кислородзависимого метаболизма нейтрофилов для оценки дискретности клеточного ответа, опосредованного через различные рецепторы и внутриклеточные пути активации.

6. Выявлено значимое подавление кислородзависимого метаболизма нейтрофилов у 47% больных со свежими медиальными переломами бедра и обосновано проведение у них профилактической иммунокоррекции «Полиок-сидонием» в раннем послеоперационном периоде.

7. Использование «Полиоксидония» у больных пожилого возраста с хирургическим лечением травмы опорно-двигательного аппарата способствует коррекции фагоцитарного звена иммунитета, ранней активизации пациентов и снижению количества гнойных осложнений.

РЕКОМЕНДАЦИИ В ПРАКТИКУ.

1. Для получения «чистой» популяции НГ (95−97%) со средним выходом 3−4 млн и жизнеспособностью 97−98% в тесте с 1% раствором трипанового синего следует применять метод центрифугирования в ступенчатом градиенте плотности смеси фиколл — урографин (1,114 г/мл и 1,076 г/мл) в режиме 15 мин при 250 g с последующим гипотоническим лизисом примеси эритроцитов.

2. Наиболее полную оценку состояния рецепторного аппарата НГ обеспечивает использование расширенного набора корпускулярных индукторов (неопсонизированный и опсонизированный зимозан) в соотношение индуктор/клетка — 20: 1.

3. С целью повышения специфичности регистрации продуктов реакции восстановления НСТ целесообразно использование двухволнового метода измерения. Применение микропланшетных многоканальных фотометров и микрообъемов реагентов повысит производительность и экономичность способа количественной оценки КЗМ нейтрофилов крови человека.

4. Исследование функциональной активности нейтрофилов с помощью фотометрического НСТ-теста является приоритетным при оценке иммунного статуса больных с медиальными переломами бедра. В 47% случаев у таких пациентов выявляются нарушения в фагоцитарном звене иммунитета, что требует проведения профилактической иммунокоррекции.

5. Включение в комплекс лечебно-профилактических мероприятий имму-номодулятора «Полиоксидоний» в течение пяти дней по 6 мкг/сут внутримышечно позволит избежать развития гнойных осложнений у больных после первичного эндопротезирования тазобедренного сустава.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

.

Нейтрофильные гранулоциты являются одними из основных и самыми многочисленными представителями фагоцитарного звена иммунитета, а также количественно доминирующим типом белых клеток крови человека. Это делает их важнейшими участниками воспалительного процесса, в котором они занимают передовую линию клеточной защиты от внедрившихся патогенов. В нейтрофиле существует две системы бактерицидности: кислороднезависимая и кислородзависимая. Нарушения кислородзависимого метаболизма нейтрофилов приводят к росту инфекционной заболеваемости и повышению количества осложнений гнойно-септического характера, в связи с чем, исследование функциональной активности НГ и последующая целенаправленная иммуно-коррекция представляется важным и актуальным разделом современной медицины.

В этой связи, перед нами стояла цель разработать и внедрить в клиническую практику способ количественной оценки кислородзависимого метаболизма нейтрофилов человека. На настоящий момент данным требованиям в наибольшей степени отвечают разновидности хемилюминесцентного анализа и фотометрические варианты теста восстановления нитросинего тетразолия. Широкое использование метода хемилюминесценции ограничивается необходимостью применения достаточно дорогостоящих люминометров, а также отсутствие стандартов на условия проведения анализа, что не позволяет корректно оценивать данные, полученные независимыми лабораториями. Предлагаемые варианты визуального учета НСТ-теста основаны на методике, предложенной Park В.Н., Fikrig S.M. и Smithwick Е.М. в 1968 году и не позволяют проводить количественной оценки активности продукции кислородных радикалов пулом нейтрофилов, а также не лишены субъективности при учете результатов реакции. В большинстве фотометрических вариантов НСТ-теста, включая впервые предложенную Baehner R.L. и Nathan D.G. (1968) методику количественного учета НСТ-теста, используются токсические растворители (диоксана, пиридина, диметилформамида), большие объемы реагентов, а также отсутствует автоматическая регистрация результатов реакции. Среди предложенных автоматизированных вариантов фотометрического НСТ-теста заслуживают внимания методики, предложенные G. Virella с соавторами (1990) и Е. П. Киселевой, А. В. Полевщиковым (1994).

В первом случае, авторы осуществляли кинетическую колориметрию суспензии НСТ-содержащих нейтрофилов проинкубированных с так называемыми «опсонизированными иммуносферами» (IgG-coated immunobeads), что позволило им не проводить экстрагирование внутриклеточно образовавшегося ДФ. Однако, основным недостатком такого подхода является ограничение по спектру используемых индукторов: возможна работа лишь с растворимыми веществами, так как использование корпускул (зимозан, латекс) не позволяет корректно регистрировать кинетику восстановления НСТ без его экстрагирования.

Е.П. Киселева и А. В. Полевщиков предложили метод автоматизированного учета НСТ-теста, основанный на использовании для постановки реакции 96-луночных плоскодонных планшетов и последующего учета результатов на многоканальном спектрофотометре. Тест проводится с выделенными нейтро-филами крови в концентрации 1*106 клеток/мл, в присутствии раствора НСТ (4 мг/мл), буферного раствора (спонтанный вариант) или определенного разведения индуктора (продигиозан или опсонизированный комплементом морской свинки зимозан) — индуцированный вариант. Образовавшийся внутриклеточно ДФ экстрагируется смесью 2 М КОН и диметилсульфокси-да/димексида, а оптическая плотность полученного раствора регистрируется при длине волны 620 нм.

Существенным недостатком вышеуказанного способа, при принципиально правильных методологических подходах, явился незначительный динамический диапазон определяемой клеточной активности. По-видимому, это связано с использованием в процессе выделения нейтрофилов хлористого аммония, модифицирующего клеточную активность, либо с недостаточной концентрацией индуктора и/или его антигенными свойствами (в качестве опсо-нина использовали комплемент морской свинки). Кроме того, используется одноволновой принцип фотометрии и отсутствуют результаты использования метода в клинической практике.

В этой связи, для достижения поставленной цели основными задачами данного исследования явились: оптимизация условий выделения и количества нейтрофильных гранулоцитов при проведения НСТ-теста, разработка условий и способа фотометрической регистрации его результатов, а также определение референтных значений и клиническая апробация разработанного способа количественной оценки КЗМ НГ человека.

В качестве объекта изучения наиболее предпочтительным является использование выделенных нейтрофилов венозной гепаринизированной крови человека, что позволяет проводить селективную оценку их функциональной активности. В качестве метода выделения оптимальным является использование ступенчатого центрифугирования на двойном градиенте плотности смеси фиколл — урографин (1,114 г/мл и 1,076 г/мл) в течение 15 мин при 250 g. Использование с целью деконтаминации выделенных НГ процедуры гипотонического лизиса эритроцитов позволяет существенно снизить временные и материальные затраты и добиться чистоты выделения жизнеспособных (97 — 98%) нейтрофилов на уровне 95−97%. Эти подходы и были использованы в нашей работе.

Важным этапом на пути стандартизации условий проведения реакции восстановления НСТ явилось определение оптимального соотношения вносимого в реакционную лунку количества клеток и индуктора. Установлено, что при использовании количества нейтрофилов в диапазоне от 200 до 750 тысяч в лунке изменения оптической плотности раствора диформазана носят линейный характер как в спонтанном, так и в индуцированном тестах. Выбор из этой зоны оптимума концентрации 500 ± 50 тысяч нейтрофилов в лунке был обусловлен тем, что достаточно частым осложнением ургентной патологии (массивная кровопотеря, гиповолемия) является лейкопения, а использование более низкой концентрации приводит к росту погрешности метода.

При использовании корпускулярных индукторов КЗМ НГ (н/з, о/з, латекс) в соотношениях от 320 частиц/клетку до 1:1 отмечено линейное нарастание оптической плотности во всем отмеченном диапазоне концентраций. Сравнительный анализ использованных корпускулярных индукторов выявил, что максимальную степень клеточной активации вызывает опсонизированный зимозан. Начиная с соотношения 20:1 он в 1,5 раза сильнее стимулирует выработку кислородных радикалов в сравнении с неопсонизированным зимоза-ном. Использование в аналогичной концентрации латексных частиц вызывало незначительное увеличение метаболической активности нейтрофилов, которое не превышало 30% от уровня спонтанной клеточной активности. По всей видимости, это связано с тем, что под воздействием вносимого в свободный объем лунки латекса (по сути полистироловых шариков) активируется не более 30% активного пула нейтрофилов, большая часть которого уже вступила в гидрофобные контакты с пластиковой поверхностью лунок планшета.

В процессе исследования влияния растворимых индукторов КЗМ НГ был использован широко используемый формиловый пептид, обладающий рецепторопосредованным механизмом действия. Установлено дозозависимое увеличение метаболической активности нейтрофилов при использовании концентрации от 0.1 до 1000 нмоль/л, когда значения индуцированного теста достигали максимума, но были в среднем на 50% меньше в сравнении с клеточным ответом на зимозан. Дальнейшее повышение концентрации fMLP приводило к относительному угнетению КЗМ НГ.

При выборе подходящего растворимого индуктора КЗМ НГ также использовали новый вакцинный препарат «Пиопол», представляющий собой комплекс очищенных концентрированных протективных антигенов условно-патогенных микроорганизмов и иммуномодулятора «Полиоксидоний». В качестве объекта сравнения использовали адсорбированную коклюшно-дифтерийно-столбнячную вакцину, для которой ранее установлено стимулирующее влияние на КЗМ лейкоцитов крови [33].

В нашей работе вакцины «Пиопол» и АКДС продемонстрировали отсутствие как прямого, так и костимулирующего (усиление индуцированного теста) воздействия на КЗМ НГ. Кроме того, под воздействием нативных или слабо разведенных вакцин отмечалось значительное (до 85%) подавление метаболической активности нейтрофилов. После проверки предположений о возможной чрезмерной антигенной нагрузке концентрированных комплексных препаратов и/или присутствии в вакцинах токсических примесей «неантигенной» природы, удалось выявить, что ингибирующим воздействием на метаболическую активность нейтрофилов обладает минорная добавка — мертиолят. Последний является ингибитором тканевого дыхания и используется в качестве консерванта.

Таким образом, проведенные исследования позволяют рассматривать фотометрический НСТ-тест как высокочувствительный метод оценки специфичности реакций, сопровождающихся продукцией АФК, а оптимальными по степени активации и вовлечения различных рецепторных структур нейтрофи-ла индукторами КЗМ — опсонизированннй и неопсонизированный зимозан.

Существенно повысить специфичность разработанной методики на этапе регистрации результатов реакции восстановления НСТ позволило использование 2-х волнового метода измерения. Максимум специфического поглощения для раствора ДФ был выявлен на длине волны — 630 нм (тестовая), а значение референтной длины волны — 490 нм. В этой связи, нами предложено оценивать концентрацию ДФ по разнице значений оптических плотностей, получаемых с использованием указанных светофильтров. Необходимые расчеты большинство современных многоканальных фотометров производят в автоматическом режиме, а также позволяют представлять полученные результаты в удобных единицах измерения (в частности в mOD) и при необходимости экспортировать их в лабораторную информационную систему. Повышение информативности получаемых результатов достигается за счет интегральной оценки всех параметров разработанного НСТ-теста: уровней спонтанной (сНСТ) и индуцированной (н/зНСТ, о/зНСТ) активности нейтрофилов, резервных возможностей функциональной активности клеток (КАо и КАн), степени дискретности клеточной активности на различные стимулы (КО).

Таким образом, соблюдение разработанных принципов проведения фотометрического НСТ-теста, а именно: использование концентрации НГ в лунке планшета 500 ± 50 тыс. клеток, применение корпускулярных индукторов (н/з и о/з) в концентрации 20±5 частиц на клетку и 2-х волновое* измерение продуктов реакции (тестовая X = 630 нмреферентная X = 490 нм), позволило достичь высокой воспроизводимости (коэффициент вариации 10−15%) и чувствительности метода: пороговая концентрация клеток в спонтанном тесте составляет 50 тыс. клеток/лунке.

Заключительным этапом перед клинической апробацией метода явилась разработка референтных значений фотометрического НСТ-теста. При выполнении данного раздела было протестировано несколько категорий условно здоровых людей: кадровые доноры плазмы, медработники и первичные доноры крови, допущенные к кроводаче. Установлено, что спонтанная клеточная активность в выбранной совокупности здоровых людей не подчиняется нормальному распределению — вместо одного «колоколоподобного» пика отмечено три пика клеточной активности. Осуществление детальной оценки влияния каждой подгруппы здоровых лиц на характер распределения всей совокупности позволило выявить, что между ними имеются достаточно выраженные различия по активности КЗМ НГ. Для доноров плазмы и медработниками характерным оказался «двугорбый» профиль активности, в то время как распределение значений сНСТ среди первичных доноров крови имело характер нормального.

После аналогичной обработки данных, полученных в индуцированных тестах, было установлено, что распределение параметров у доноров плазмы характеризовалось резким сдвигом в область низких значений. Медработники, напротив, имели тенденцию к повышению активности КЗМ нейтрофилов в ответ на дополнительную стимуляцию двумя разновидностями зимозана. Промежуточное положение и нормальный характер распределения клеточной активности также отмечался среди первичных доноров крови. Выявленную разнохарактерность в этих группах можно объяснить следующими причинами: систематические процедуры плазмафереза (среднее количество сеансов -24), осуществляемые в течение длительного промежутка времени, по-видимому, способны снижать АФК-продуцирующий потенциал нейтрофилов кадровых доноров. До настоящего исследования, приведенные в литературе данные о влиянии стажа донорства на показатели иммунного ответа затрагивали изменение титров антител и процента иммуноактивных лиц среди доноров [24]. Повышение КЗМ среди медработников можно расценивать как ответную реакцию организма на тесный контакт с инфекционными агентами.

Таким образом, подученные характеристики каждой группы здоровых людей позволили считать первичных доноров крови оптимальным выбором для расчета референтных значений разработанного теста. В основном, вычисление референтного интервала производится с помощью параметрического метода статистического анализа в диапазоне отклонений ±1,5−2,0 ст от средней величины [24]. Однако, использование параметрического метода возможно лишь при выполнении условия нормальности распределения измеряемого признака [18]. Таким образом, доказав нормальный характер распределения метаболической активности нейтрофилов первичных доноров крови и учитывая то, что по данным А. И. Воробьева (1985) для гематологических показателей наиболее приемлемым является референтный интервал, отграниченный отклонениями ±1,5 а от средней величины, мы применили данный подход в нашей работе. Полученные результаты отражают адекватность указанного подхода для разработки референтных значений фотометрического НСТ-теста и позволяет расценивать первичных доноров крови в качестве наиболее репрезентативных представителей здоровой популяции.

Первым этапом клинической апробации явилась сравнительная оценка КЗМ НГ больных с различной патологией с использованием визуального и фотометрического вариантов НСТ-теста. Установлено, что на фоне обширного гнойно-воспалительного процесса — распространенный перитонит, ожоговая травма — происходит достоверное увеличение спонтанной клеточной активности, регистрируемое обеими модификациями теста. Данные изменения могут указывать на то, что в начальной фазе (до 3-х суток) массивной антигенной нагрузки мобилизация фагоцитарного звена иммунитета идет по пути увеличения количества активированных нейтрофилов, а также повышения их удельной активности. Аналогичные изменения регистрировались визуальным НСТ-тестом у пациентов с медиальными переломами бедра и с отравлением психотропными препаратами. С помощью разработанной методики, удалось выявить значимое угнетение КЗМ НГ у этих больных, что указывает на способность фотометрического НСТ-теста выявлять также снижение суммарного бактерицидного потенциала фагоцитов. Указанные изменения спонтанного уровня активации у токсикологических больных также сопровождались выраженным подавлением клеточного ответа на дополнительную стимуляцию корпускулярными индукторами как в фотометрическом, так и в визуальном вариантах НСТ-теста. Достоверное снижение значений индуцированных тестов у пациентов с медиальными переломами бедра было отмечено только в фотометрическом НСТ-тесте. У ожоговых больных и пациентов с распространенным перитонитом процент активированных латексом НГ практически не отличался от нормы. Напротив, лейкоциты пациентов данных групп в ответ на стимуляцию зимозаном отвечали достоверным повышением продукции активных форм кислорода. Кроме того, у больных с перитонитом было отмечено разнонаправленное изменение функциональной активности клеток: достоверное повышение активности в н/зНСТ сочеталось с практически неизменным ответом на о/з. По всей видимости, такая клеточная реакция (в первую очередь) зависит от рецепторной перестройки НГ, возникающей в силу целого ряда причин. Во-первых, — выраженная воспалительная реакция сопровождается выбросом из костномозгового депо большого количества юных форм нейтрофилов, обладающих незрелым рецеп-торным аппаратом [111]. Во-вторых, — в связи с процессами интернализации и/или «шеддинга» рецепторов к Fc фрагментам иммуноглобулинов класса G (в частности FcyRII, FcyRIII), происходящими при активации НГ [108]. В-третьих, -возможна опосредованная через интегрины (осуществляют рецепцию н/з) негативная регуляция КЗМ нейтрофилов в ответ на стимуляцию о/з что, по-видимому, связано с вовлечением конкурентных путей клеточной активации, использующих общие вторичные мессенд,^еры (тирозини фосфатидилинозитол-киназы) [213]. Таким образом, предложенное использование о/з и н/з позволяет выявлять случаи функциональной дискретности нейтрофилов в ответ на стимуляцию, опосредованную через различные рецепторные структуры и пути активации. Так, анализ распределения больных с медиальными переломами бедра показал, что в 47% наблюдений выявлено подавление метаболической активности нейтрофилов в обоих индуцированных тестах, селективное подавление активации на о/з в 23% случаев и лишь 29% пациентов имели адекватный ответ на оба стимула.

На следующем этапе клинической апробации оценивали клинико-иммунологическую значимость разработанного теста для оценки эффективности проводимой иммунокоррекции у больных с медиальными переломами бедра. Этот вид травмы характерен для пациентов старших возрастных групп, что является закономерным результатом сосудисто-дистрофических и эндокринных нарушений, и сопровождается большим числом сопутствующих заболеваний. Это приводит к длительному течению репаративных процессов и существенно повышает риск развития гнойных осложнений и летальных исходов, что у части пациентов является противопоказанием к проведению оперативного вмешательства. Остеосинтез бедра и первичное эндопротезирование тазобедренного сустава являются операциями выбора у другой части пациентов. Последний способ является наиболее эффективным и, вместе с тем, одним из наиболее травматичных в современной ортопедии. Таким образом, наличие вторичного иммунодефицита (возрастного, посттравматического, послеоперационного) в условиях длительного контакта с агрессивной, антибио-тикорезистентной микрофлорой диктует необходимость проведения иммуно-мониторинга у пациентов с медиальными переломами бедра.

По данным иммунологического исследования крови на 1-м этапе наблюдения (первая неделя после поступления) иммунная система пациентов характеризовалась достоверным повышением уровня лейкоцитов на 21% в сочетании со снижением относительного количества лимфоцитов на 28%, преимущественно за счет относительного и абсолютного дефицита В-лимфоцитов на 23 и 30% соответственно. На фоне неизмененного уровня IgM и IgG отмечалось достоверное повышение уровня сывороточного IgA на 46%, суммарного количества ЦИК на 23%. Изменения в фагоцитарном звене иммунитета характеризовались следующим образом: по данным визуального НСТ-теста отмечался рост количества только спонтанно активированных нейтрофилов (на 91%), что сопровождалось достоверным снижением К, А на 32%. Истощение резервов метаболической активности в ответ на дополнительную стимуляцию также зарегистрировано с помощью разработанного теста: КАо был снижен на 23%, КАн — на 25%. Однако данные изменения были обусловлены подавлением индуцированной активности в о/зНСТ и н/зНСТ на 26%. Уровень спонтанной клеточной активности в сНСТ, а также процент фагоцитирующих латекс нейтрофилов не изменялись. С учетом выявленных отклонений в комплекс лечебно-профилактических мероприятий 29 пациентам после первичного эндопротезирования тазобедренного сустава был включен иммуномодулятор «Полиоксидоний», который назначали в течение пяти дней после операции по 6 мкг/сут внутримышечно.

Иммунологический мониторинг пациентов на 2-м этапе наблюдения (вторая неделя после поступления в группе с консервативной тактикой лечения и вторая неделя после операции в других группах) позволили выявить, что вне зависимости от выбранной тактики лечения у всех пациентов с медиальными переломами бедра отмечалась тенденция к сохранению повышенного количества лейкоцитов и относительной лимфопении на фоне стойкого достоверного повышения гывороточного уровня IgA в среднем на 52%.

Основные отличия по группам были выявлены в фагоцитарном звене иммунитета. Параметры визуального НСТ-теста у пациентов, не получавших иммунокоррекцию, характеризовались сохранением достоверно повышенного уровня спонтанной клеточной активности, отсутствием активации в ответ на латекс и снижением резервов функциональной активности НГ. В группе больных с иммунокоррекцией отмечалась нормализация всех параметров теста.

По результатам фотометрического НСТ-теста КЗМ НГ характеризовался наличием разнонаправленных изменений по группам больных с медиальными переломами бедра. Так при оперативном лечении (остеосинтез бедра и ЭТС) регистрировалось подавление исходно сниженных значений индуцированных тестов. У больных, лечившихся консервативно, отмечено достоверное угнетение КЗМ лишь в ответ на дополнительную стимуляцию н/з, что, по всей видимости, обусловлено отсутствием иммуносупрессивного воздействия оперативного вмешательства. Включение в схему послеоперационного ведения больных после первичного эндопротезирования тазобедренного сустава им-муномодулятора «Полиоксидоний» позволило избежать углубления иммуно-супрессии и достичь нормализации всех параметров фотометрического НСТ-теста. Положительная лаоораторная динамика сопровождалась неосложнен-ным течением послеоперационного периода у данных больных: отсутствовали осложнения гипостатического характера, заживление ран происходило первичным натяжением.

Таким образом, выявленные изменения в иммунной системе пациентов с медиальными переломами бедра, в основном, касаются КЗМ НГ. Оперативное вмешательство вне зависимости от методики его выполнения (остеосинтез бедренной кости или первичное эндопротезирование тазобедренного сустава) обладает супрессивным воздействием на продукцию кислородных метаболитов пулом нейтрофилов в ответ на бактериальную стимуляцию. Одним из методов коррекции иммунодефицитного состояния у таких пациентов может служить применение в комплексе лечебно-профилактических мероприятий иммуномодулятора «Полиоксидоний». Использование фотометрического НСТ-теста позволяет осуществлять контроль эффективности проводимой им-мунокорригирующей терапии.

Разработанный способ количественной оценки КЗМ НГ отвечает современным требованиям к методам лабораторной диагностики иммунодефицит-ных состояний и имеет высокую диагностическую значимость при состояниях, сопровождающихся как активацией (перитонит, ожоговая болезнь), так и подавлением клеточной активности (отравление психотропными препаратами, медиальные переломы бедра). Это позволяет рассматривать фотометрический НСТ-тест в качестве эффективного метода в диагностическом арсенале современных клинико-диагностических и иммунологических лабораторий.