Обращенно-фазный вариант тонкослойной хроматографии в химико-токсикологическом анализе ряда лекарственных средств основного характера

Актуальность проблемы. В структуре отравлений химической этиологии значительную долю занимают отравления лекарственными средствами, что обусловлено их широким ассортиментом и постоянно обновляющейся номенклатурой. На основании статистических данных в отношении медикаментов, обнаруживаемых в ходе проведения экспертных исследований на территории Пермского края за период 2007;2011 гг. [4], показано преобладание соединений с основными свойствами, что обуславливает необходимость более детального изучения веществ данной группы.

Ввиду сложности клинической интерпретации отравлений в практике химико-токсикологического анализа большое значение имеет использование высокочувствительных и специфичных методов анализа [34, 35, 43].

Одним из наиболее эффективных методов при проведении скрининга «лекарственных ядов» является хроматография в тонком слое сорбента (ТСХ), достоинствами которой являются доступность, простота выполнения, экспрессность, экономичность, возможность сочетания с другими методами анализа с целью повышения качества и достоверности полученных результатов [5, 16, 30, 61, 62, 74, 75, 78, 93, 94, 99]. ТСХ предпочитают пользоваться в случаях анализа широкого спектра объектов, в том числе при проведении мониторинга лекарственных средств в биосредах при наличии минимального оснащения [10, 17, 74].

Динамика развития метода ТСХ привела к созданию новых типов сорбентов, совершенствованию способов, методических приемов и техники хроматографирования, включая подготовительные операции, расширению способов детектирования, автоматизации самого метода и процедуры обработки хроматограмм [6, 7, 17, 22, 26, 65, 70, 77, 83, 84, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 96, 100, 101].

С целыо оптимизации условий ТСХ-скрининга большого круга соединений необходимо учитывать также влияние соэкстрактивных веществ биоматериала (при проведении химико-токсикологических исследований наиболее информативным и доступным биологическим объектом является моча). Распространенными способами выделения экзотоксикантов из мочи являются жидкость-жидкостная экстракция (ЖЖЭ) и твердо-фазная экстракция (ТФЭ) [8, 19,38, 45].

Большинство существующих методик химико-токсикологического анализа на основе ТСХ предполагает использование нормально-фазного (НФ) варианта (полярные сорбенты, элюэнты неполярного характера). Применение в качестве сорбента силикагеля с привитыми алкильными цепочками и полярных элюентов — обращенно-фазной (ОФ) разновидности метода в настоящее время недостаточно широкое, хотя этот вариант хроматографии имеет ряд преимуществ, т.к. химически модифицированный силикагель:

• расширяет диапазон селективности метода ТСХ за счет реализации распределительного механизма удерживания сорбатов в отличие от НФ ТСХ, где преобладающим является адсорбционный механизм;

• позволяет разделять алифатические гомологи за счет большего влияния на процесс удерживания площади контакта молекулы в сравнении с НФ ТСХ, обладающей селективностью по отношению к изомерам;

• позволяет уменьшить токсичность аналитической методики ввиду применения в качестве составляющих подвижной фазы водно-спиртовых и водно-ацетонитрильных смесей;

• исключает необходимость контроля влажности в отличие от слоев на основе силикагеля или оксида алюминия [10, 44, 67].

Разновидностью силикагеля с привитыми углеводородными фрагментами является сорбент С18, большая распространенность применения которого характерна для колоночной жидкостной хроматографии. Однако в плоскостной хроматографии применение С18 значительно меньше в связи с малой изученностью. Тем не менее, стоит отметить, что сырье для получения этого сорбента является доступным, что позволяет производить его в количествах промышленного масштаба. Схожесть анизотропных свойств С18 с биологическими мембранами обеспечивает возможность изучения липофильности соединений, кроме того, выраженные неполярные свойства сорбента способствуют удерживанию веществ гидрофобного характера (в виде оснований). Представленные характеристики определяют возможности применения данного сорбента в планарной хроматографии.

В целом, необходимо подчеркнуть, что меньшая доля применения ОФ ТСХ в практике химико-токсикологического анализа обусловлена недостаточным количеством разработок в области применения этого варианта хроматографии при анализе биологических объектов, в связи с чем ассортимент ОФ пластин российских производителей является неполным для объективной оценки возможностей использования данной разновидности метода ТСХ.

Для решения разнообразных аналитических задач в области анализа биоматериала исследователь должен располагать возможностью использования ряда сорбентов, уникальных по свойствам, химии поверхности, технологии получения. Поэтому актуальными являются оценка аналитических возможностей ОФ ТСХ с применением сорбента С18 и разработка скрининговых методик идентификации ряда токсикологически важных веществ.

Целью работы является разработка методик определения ряда токсикологически важных лекарственных средств основного характера методом обращенно-фазной тонкослойной хроматографии с применением сорбента С18.

Для достижения поставленной цели предстояло решить следующие задачи:

• Изучить хроматографическое поведение анализируемых веществ с целыо поиска оптимальных условий определения при общем и частном скрининге.

• Определить чувствительность различных детекторов при ненаправленном и направленном исследовании методом ОФ ТСХ.

• Разработать методики пробоподготовки модельной смеси мочи на основе жидкость-жидкостной и твердо-фазной экстракции для последующего определения методом ОФ ТСХ.

• Определить степень извлечения ряда исследуемых соединений в модельных смесях мочи денситометрическим методом.

• Апробировать предложенные методики изолирования на реальных образцах мочи и внедрить результаты научного исследования в экспертную практику.

Научная новизна. Проведено исследование по изучению хроматографического поведения наиболее важных с токсикологической точки зрения экзотоксикантов в условиях ОФ ТСХ с применением в качестве неподвижной фазы силикагеля с привитыми углеводородными радикалами С18. Разработаны условия для частного скрининга исследуемых групп веществ. Определена общая система растворителей при ненаправленном исследовании, а также метчик, состоящий из четырех представителей исследуемых соединений. Определена чувствительность различных детекторов при идентификации аналитов на пластине.

На основании проведенной сравнительной характеристики различных способов пробоподготовки модельной смеси мочи с последующей адаптацией к методу ОФ ТСХ разработана оптимальная по величине степени извлечения аналитов и минимальному количеству соэкстрактивных веществ методика жидкость-жидкостной экстракции в сочетании с вымораживанием. Преимущества данного способа изолирования были подтверждены на примере реальных образцов мочи пациентов.

Практическая значимость. Разработанные методики обнаружения ряда токсикологически важных лекарственных средств основного характера в условиях обращенно-фазной тонкослойной хроматографии с применением сорбента С18 расширяют возможности использования планарной хроматографии в химико-токсикологическом анализе. Применение в комплексе двух вариантов ТСХ, основанных на различных механизмах удерживания сорбатов, способствует повышению достоверности результатов при проведении экспертных исследований на предварительном этапе.

Предложенные методики обнаружения ряда токсикологически важных веществ в условиях ОФ ТСХ внедрены в практическую деятельность химико-токсикологической лаборатории ГБУЗ «Пермский краевой наркологический диспансер» (акт внедрения от 03 сентября 2012 г.), судебно-химических отделений ГКУЗОТ «Пермское краевое бюро судебно-медицинской экспертизы» (акт внедрения от 30 августа 2012 г.), ГБУЗ СО «Бюро судебно-медицинской экспертизы», г. Екатеринбург (акт внедрения от 17 сентября 2012 г.), КОГБСЭУЗ «Кировское областное бюро судебно-медицинской экспертизы» (акт внедрения от 02 октября 2012 г.), ФГБУЗ ЦМСЧ № 71 ФМБА России, г. Озерск Челябинской области (акт внедрения от 15 октября 2012 г.).

Разработанное в ходе выполнения диссертационной работы учебное пособие «Нормально-фазный и обращенно-фазный варианты тонкослойной хроматографии в химико-токсикологическом анализе», включающее подробное изложение теоретических основ нормально-фазного и обращенно-фазного вариантов ТСХ, а также сводную информацию по определению ряда токсикологически важных групп лекарственных средств методом ТСХ, внедрено в учебный процесс ГБОУ ВПО ОрГМА Минздравсоцразвития России, г. Оренбург (акт внедрения от 20 сентября 2012 г.). Материалы диссертации прошли апробацию при проведении элективного курса «Хроматографические методы анализа», организованного на кафедре токсикологической химии ГБОУ ВПО ПГФА Минздравсоцразвития России для студентов 4 и 5 курсов (акт внедрения от 23 марта 2012 г.), а также цикла повышения квалификации специалистов в области клинической лабораторной диагностики (акт внедрения от 20 апреля 2012 г.).

По результатам исследований подготовлено, утверждено Ученым советом Российского центра судебно-медицинской экспертизы и разослано в территориальные бюро судебно-медицинской экспертизы информационное письмо «Применение обращенно-фазной тонкослойной хроматографии на предварительном этапе химико-токсикологических исследований».

Апробация работы. Основные положения диссертационной работы доложены в ходе Российской научно-практической конференции с международным участием «Актуальные вопросы судебно-химических, химико-токсикологических исследований и фармацевтического анализа» (Пермь,.

2009 г.) — 75-й Всероссийской научной конференции студентов и молодых ученых с международным участием, посвященной 75-летию КГМУ «Молодежная наука и современность» (Курск, 2010 г.) — 74-й итоговой студенческой научно-практическая конференции с международным участием, посвящений 100-летию со дня рождения профессора A.M. Дыхно (Красноярск,.

2010 г.) — межрегиональной научно-практической конференции с международным участием, посвященной 75-летию судебно-медицинской службы Кировской области «Актуальные вопросы судебно-медицинской науки и практики» (Киров, 2010 г.) — итоговой научной конференции сотрудников КГМУ, Центрально-Черноземного научного центра РАМН и отделения РАЕН, посвящ. 76-летию Курского государственного медицинского университета «Университетская наука: взгляд в будущее» (Курск, 2011 г.) — научно-практической конференции с международным участием, посвященной 85-летию со дня рождения заслуженного деятеля науки РФ, профессора В. И. Алисиевича «Морфология критических и терминальных состояний» (Москва,.

2011 г.) — научно-практической конференции с международным участием, посвященной 75-летию Пермской государственной фармацевтической академии «Актуальные проблемы науки фармацевтических и медицинских вузов: от разработки до коммерциализации» (Пермь, 2011 г.) — 77-й Всероссийской научной конференции студентов и молодых ученых «Молодежная наука и современность» (Курск, 2012 г.) — научно-практической конференции с международным участием «Актуальные проблемы судебно-медицинской экспертизы» (Москва, 2012 г.).

Объем и структура работы. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части (4 главы), общих выводов, списка литературы, включающего 103 наименования (из них 36 источников зарубежной литературы), приложения. Работа изложена на 149 страницах машинописного текста, включает 68 таблиц, 58 рисунков и 4 раздела приложения, включающего параметры удерживания исследуемых соединений в различных хроматографических условиях (к обзору литературы), характеристику исследуемых веществ, входящих в состав лекарственных форм, протоколы расчета содержания анализируемых соединений в моче денситометрическим методом, документы по внедрению результатов научных исследований.

ВЫВОДЫ ПО ГЛАВЕ 5.

1. Оценена степень извлечения рассмотренных в данной главе соединений при их изолировании из модельной смеси мочи по разработанной нами методике жидкость-жидкостной экстракции в сочетании с вымораживанием — ЭВ (II). Так, для трамадола, кодеина, морфина, тригексифенидила, клозапина, карбамазепина выход составил 93,67- 77,67- 57,33- 57,67- 95,67- 92,33%, соответственно. Погрешность определения не превышает ± 6%.

2. В отношении методики ЖЖЭ стоит отметить наложение области балласта на зону распределения морфинатригексифенидил обнаружен в следовых количествах, не подлежащих расчету. Для трамадола, кодеина, клозапина, карбамазепина величина степени экстракции составила 55,00- 62,67- 77,30- 79,00%, соответственно.

3. В отношении применения картриджей Evolute ABN стоит подчеркнуть их пригодность при качественной идентификации аналитов в условиях ОФ ТСХ, но для количественного определения денситометрическим методом нами были отмечены ограничения их использования, что, вероятно, требует проведение дополнительных этапов очистки полученных извлечений.

4. Наиболее приемлемым способом изолирования с наибольшим выходом анализируемых соединений и наименьшим количеством соэкстрактивных веществ является вариант ЭВ (II). Применение традиционного метода ЖЖЭ также возможно в связи с получением экстрактов, содержащих значительную часть аналитов. Приведенные выводы подтверждены проведением изолирования доксиламина и карбамазепина из реальных образцов мочи.

Определена чувствительность детекторов в отношении анализируемых веществ при ненаправленном исследовании (УФ-облучение при 254 нм, раствор нингидрина, реактив РРЫ, реактив Драгендорфа). В схему детектирования дополнительно введена обработка пластины парами йода.

Рассмотренные способы детектирования веществ в условиях общего и частного скрининга позволяют обнаруживать вещества в моче в концентрациях, соответствующих их приему в терапевтических дозах.

3. Разработаны оптимальные условия пробоподготовки модельной смеси мочи жидкость-жидкостной экстракцией в сочетании с вымораживанием для последующего ОФ ТСХ-определения аналитов в извлечениях. Экстрагентом на стадии вымораживания является ацетонитрил, на этапе ЖЖЭ — хлороформ при рН 10.

4. Произведена сравнительная оценка эффективности извлечения анализируемых соединений при применении различных подходов к изолированию денситометрическим методом. Наиболее приемлемым вариантом изолирования с наибольшим выходом аналитов и наименьшим количеством соэкстрактивных веществ является жидкость-жидкостная экстракция в сочетании с вымораживанием (степень извлечения аналитов составляет 57,33 — 95,67%).

5. Подтверждена приемлемость использования методики на основе ЖЖЭ в сочетании с вымораживанием на примере анализа реальных образцов мочи пациентов при отравлении доксиламином, карбамазепином в сравнении с методами традиционной ЖЖЭ и ТФЭ. Концентрации экзотоксикантов в образцах мочи, рассчитанные денситометрическим методом составили 4,6 мкг/мл для доксиламина, 1,73 мкг/мл для карбамазепина. Погрешность определения не превышает ± 6%.