Характеристика штаммов кори, циркулирующих на территории Российской Федерации в период массовой вакцинопрофилактики

До настоящего времени среди инфекционных болезней человека значительное место занимает корь. Это заболевание имеет огромное социально-экономическое значение на протяжении всей истории цивилизации. Повсеместное распространение этой инфекции с периодическими эпидемическими подъемами, высокая восприимчивость к ней человека ставят корь в ряд тех болезней, которые наносят значительный урон здоровью населения.

Реальная возможность борьбы с корью появилась в 1954 году, когда I. Епс1ег5 и Т. РееЫэ (75) получили первый штамм вируса кори, ставший родоначальником многих вакцинных и диагностических препаратов. Со времени создания эффективных вакцин против кори, это заболевание стало контролируемым в некоторых странах мира (43,125), но, тем не менее, несмотря на явные успехи в борьбе с корью, достигнутые с помощью вакцинации, корь остается серьезной проблемой для многих стран.

Впервые вопрос о ликвидации кори встал в 1975 году, когда специалистами ВОЗ была разработана Расширенная Программа Иммунизации (РПИ), результатом которой, в частности, стало сокращение числа случаев кори на территориях, включившихся в выполнение РПИ. Позднее в 1991 году Панамериканская конференция выдвинула задачу элиминации кори на американском континенте к 2000 году. Результатом усилий, предпринимаемых для достижения поставленной задачи, явилось искоренение кори в Америке, где с 2000 года не было зарегистрировано ни одного случая этого заболевания, вызванного эндемичными штаммами вируса кори (19, 43).

Та же стратегия намечена в программе Всемирной Организации Здравоохранения «Здоровье для всех», провозгласившей в 1998 году в качестве одной из основных задач XXI века — глобальную ликвидацию кори к 2010 — 2020 гг. При этом Восточно-Средиземноморский и Европейский регионы должны сертифицировать элиминацию кори в 2007;2010 гг. (8).

Наличие в России высокоэффективной живой коревой вакцины позволило разработать Национальную программу ликвидации кори, утвержденную Приказом Минздрава России от 19.08.2002 года № 270. Одним из важных пунктов программы является подробная молекулярно-генетическая характеристика штаммов вируса кори с целью слежения за их циркуляцией среди населения на более современном уровне, так как молекулярно-генетические методы позволяют проводить оценку эпидемиологических связей между выделяемыми штаммами вируса кори и изучать пути их трансмиссии.

В мировом плане, изучение вируса кори на молекулярно — генетическом уровне позволило выявить существование различных генетических групп коревого вируса и соотнести эти группы с ареалами распространения, что дало возможность классифицировать все получаемые изоляты вируса кори. Это явилось предпосылкой для создания стандартной номенклатуры описания генетической характеристики диких штаммов вируса кори и его генотипирования. В 1998 г. все известные штаммы вируса кори были подразделены на 15 генотипов, которые объединены в 8 групп: А, В, С, Э, Е, V, в, Н (151). Генотипы различаются по количеству нуклеотидных замен на участке генома коревого вируса, состоящего из 450 нуклеотидов, кодирующих СООН — конец Ы-белка.

К 2001 году, с момента первой публикации стандартной номенклатуры, применяемой для классификации диких штаммов вируса кори (1998), количество охарактеризованных и изученных генотипов возросло с 15 до 22, что свидетельствует не только о расширении регионов изучения, но и о постоянном накоплении мутаций в геноме коревого вируса (152, 153).

Анализ данных литературы демонстрирует усилившееся в последние годы внимание исследователей к характеристике диких штаммов вируса кори, циркулирующих в настоящее время в разных географических регионах. При этом авторы преследуют несколько целей: во-первых, осуществление наблюдения за изменчивостью вируса кори и определение ее эпидемиологической значимостиво-вторых, генотипирование вируса кори, определение местных и завозных случаев кори и прерывание трансмиссии эндемичных штаммов коревого вируса для контроля выполнения программы элиминации кори на данных территориях.

Необходимо заметить, что если за рубежом такие исследования уже вошли в повседневную практику, то в России имеются только разрозненные данные о генотипах диких штаммах вируса кори, циркулирующих на территории Российской Федерации, тогда как только постоянное наблюдение за всеми изменениями вирусного генома на определенной территории в течение длительного времени позволяет документировать прерывание трансмиссии эндемичного генотипа вируса кори на данной территории и является одним из основных методов оценки эффективности выполнения программы элиминации кори.

В связи с изложенным ЦЕЛЬЮ настоящей работы явилась молекулярно-генетическая характеристика штаммов вируса кори, циркулирующих среди населения на территории Российской Федерации.

В соответствии с поставленной целью в ЗАДАЧИ исследования входило:

1. Подбор праймеров и отработка условий проведения реакции обратной транскрипции и полимеразной цепной реакции.

2. Определение нуклеотидной и аминокислотной последовательности СООН-концевого участка N-гена и полноразмерного Н-гена разных штаммов вируса кори.

3. Определение генотипов штаммов вируса кори, циркулирующих на территории России в разные годы вакцинопрофиоактики.

Многоплановость исследований потребовала при выполнении работы комплекса с различными специалистами. В этой связи в диссертации нашли отражения результаты работ, проведенных совместно с вирусологами и эпидемиологами ГУ «МНИИЭМ им Г. Н. Габричевского» МЗ РФс сотрудниками лаборатории молекулярной диагностики и генно-инженерных конструкций Всероссийского Научно-исследовательского института сельскохозяйственной биотехнологии РАСХНс сотрудниками Measles Virus Section, Centers for Disease Control and Prevention (CDC), Atlanta.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА РАБОТЫ:

Впервые проведен анализ нуклеотидной и аминокислотной последовательности СООН — концевого участка N-гена 21 штамма вируса кори и полноразмерного Н-гена 5 штаммов вируса кори, выделенных на территории Российской Федерации в период с 1988 по 2003 годы. Установлено, что в настоящее время наблюдается изменение генотипической картины штаммов вируса кори, циркулирующих на территории России. Если в 80-е годы на данной территории циркулировали штаммы генотипа А, который являлся эндемичным для России в довакцинальный период, то в последнее время циркуляция данного генотипа не зафиксирована. В настоящее время на территории Российской Федерации наиболее постоянной циркуляцией отличается вирус кори, принадлежащий к генотипу 04, который и является эндемичным для России в данный момент.

Выявлено, что для вируса кори, циркулирующего на территории России характерно ежегодное увеличение количества мутаций, как на нуклеотидном, так и на аминокислотном уровне, что свидетельствует о необходимости постоянного слежения за изменчивостью вируса кори.

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ РАБОТЫ заключается в создании на основе разработанных специфических праймеров для СООН-концевого участка И-гена вируса кори и определении оптимальных условий проведения реакции обратной транскрипции и полимеразной цепной реакции «Набора реагентов для выделения РНК и диагностики вируса кори методом обратной транскрипции и полимеразной цепной реакции в одной пробирке» (ДВК-ПЦР) в соответствии с п. 3.6. ГОСТ Р15.013−94. Проект технических условий данного набора был представлен и рассмотрен на заседании комиссии по РИА — и ИФА-наборам Комитета по новой медицинской технике МЗ РФ 20.10.2002 года.

МАТЕРИАЛЫ ДИССЕРТАЦИИ НАШЛИ ОТРАЖЕНИЕ:

1. В депонировании одного из изученных штаммов вируса кори MVi/Moscow.Rus/05.99[D4] в Государственную коллекцию вирусов (ГУ «НИИ вирусологии им. Д. И. Ивановского РАМН», Москва, Россия). Данному штамму присвоен номер ГКВ № 2360.

2. В депонировании 11-ти изученных штаммов вируса кори, циркулирующих на территории Российской Федерации, в Международную коллекцию штаммов (CDC, Atlanta, США) и передачи нуклеотидных последовательностей данных штаммов в Genebank (NCBI, Bethesda, США).

НА ЗАЩИТУ ДИССЕРТАЦИИ ВЫНОСЯТСЯ СЛЕДУЮЩИЕ.

ПОЛОЖЕНИЯ:

1. С помощью реакции обратной транскрипции, полимеразной цепной реакции и секвенирования установлено, что на территории России в период с 1988 по 2003 годы циркулировали штаммы вируса кори четырех генотипов: A, D4, D6 и HI.

2. В течение последних 15 лет на территории России произошли изменения в генотипическом пейзаже штаммов вируса кори. Циркуляция штаммов генотипа А, эндемичного для России в довакцинальный период, в последние годы не зафиксирована. Наиболее постоянной циркуляцией отличается вирус кори, принадлежащий к генотипу D4, который и является эндемичным для России в настоящее время.

Для штаммов вируса кори генотипа Э4, выделенных на территории Российской Федерации характерно интенсивное ежегодное накопление мутаций на нуклеотидном и аминокислотном уровне, что свидетельствует о важности постоянного слежения за дикими штаммами вируса кори с помощью методов молекулярной эпидемиологии.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

110 выводы.

1. Разработаны оригинальные праймеры: МУ-Ш/МУ-Р2 и МУ-К-ИЛ/МУ-Ы-Р1, фланкирующие 685 и 545 нуклеотидов (соответственно) С-концевого участка гена нуклеопротеина вируса кори, используемого при генотипировании, а также отработаны условия для проведения реакции обратной транскрипции и полимеразной цепной реакции при использовании данных праймеров. Предложена схема проведения реакций, продемонстрирована ее высокая чувствительность и специфичность. Показано, что получаемые продукты реакции могут быть использованы для изучения нуклеотидной и аминокислотной последовательностей вирусных изолятов.

2. Впервые проведен анализ нуклеотидной и аминокислотной последовательности СООН-концевой части Ы-гена с целью генотипирования 21 штамма вируса кори, циркулировавших на территории России в период с 1988 по 2003 годы. Установлено, что в 1988 году на территории России циркулировали штаммы вируса кори, относящиеся к генотипу, А и близкие по молекулярно-генетическим характеристикам к штамму Эдмонстон. В период с 1999 года по 2003 год на территории России выделен вирус кори трех генотипов 04, Об и Н1.

3. Анализ нуклеотидной и аминокислотной последовательности полноразмерного Н-гена штаммов вируса кори, изолированных на территории России в период с 1999 по 2003, подтвердил принадлежность вируса кори к генотипам 04, Об и Н1, установленным при секвенировании СООН-конца Ы-гена.

4. Результаты генотипирования штаммов вируса кори, изолированных на территории Российской Федерации в разные годы вакцинопрофилактики, выявили изменения генотипической картины вируса кори, циркулирующего на данной территории. Циркулировавший ранее на территории России вирус, принадлежащий к генотипу А, в последнее время не регистрируется, а его место занял вирус генотипа D4. Анализ частоты обнаружения штаммов вируса кори разных генотипов позволяет предположить, что в настоящий момент генотип D4 является эндемичным для России. Вирусы других генотипов, вызывающие на территории России локальные случаи кори, по-видимому, являются импортированными из других стран.

5. Определение нуклеотидной и аминокислотной последовательности двух наиболее вариабельных участков генома вируса кори (СООН-конца N-гена и полноразмерного Н-гена) свидетельствует об усилившейся в последнее десятилетие изменчивости вируса кори. Полученные данные говорят о важности изучения молекулярно — генетической и биологической характеристики штаммов вируса кори в период реализации программ элиминации кори в мире.

За помощь в выполнении работы автор выражает глубокую благодарность сотруднику Института им. Баха РАН, кандидату биологических наук Ворониной Ольге Львовне.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

.

Анализ данных литературы показал, что геном вируса кори кодирует информацию о 8 структурных белках, три из которых (Н, F и М) связаны с оболочкой вириона коревого вируса, а три (Ь, Р и ^ связаны с нуклеокапсидом. Детальное изучение строения и функций вирусных белков показало существование у вируса кори выраженных антигенно-генетических мутаций, особенно в N и Нбелках. Это диктует необходимость дальнейшего наблюдения за изменчивостью вируса кори.

Анализ данных литературы свидетельствует об усилившемся в последние годы внимании исследователей к характеристике диких штаммов вируса кори, циркулирующих в настоящее время в разных географических регионах. При этом авторы преследуют несколько целей: во-первых, осуществление наблюдения за изменчивостью вируса кори и определения ее эпидемиологической значимостиво-вторых, генотипирование вируса кори, определение местных и завозных случаев кори и прерывание трансмиссии местных штаммов коревого вируса для контроля за выполнением программы элиминации кори на данных территориях.

Нетрудно заметить, что если за рубежом такие исследования уже вошли в повседневную практику, то в России имеются только разрозненные данные о диких штаммах вируса кори, циркулирующих на территории Российской Федерации. Принятая Всемирной организацией здравоохранения программа глобальной элиминации кори и Национальная программа ликвидации кори к 2010 году на территории Российской Федерации (Приказ Минздрава России от 19.08.2002 года № 270), требуют подробной молекулярно-генетической характеристики штаммов вируса кори, циркулирующих на территории России, с целью слежения за их циркуляцией среди населения.

Таким образом, анализ данных литературы дал возможность сформулировать основную задачу данной работы: изучить и генотипировать штаммы вируса кори, изолированные на территории России в разные годы массовой вакцинопрофилактики.

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ ГЛАВА 4. Материалы и методы исследования.

4.1. Выделение изолятов от больных корью.

Выделение изолятов вируса кори из инфекционного материала проводили на базе лаборатории прикладной иммунохимии Московского научно-исследовательского института эпидемиологии и микробиологии имени Г. Н. Габричевского.

Материалом для выделения вируса служили: взвесь мононуклеарных клеток, полученная из гепаринизированной венозной крови больных корью, плазма и сыворотка крови.

Венозную кровь собирали в стерильных условиях в пробирки с гепарином (5 мл + 0,2 мл гепарина). Взятые образцы доставлялись в лабораторию для выделения вируса. При выделении фракции моноцитов из гепаринизированной крови в пробирку с кровью добавляли желатин из расчета 1 мл 10% желатина на 5 мл крови. Полученную смесь тщательно перемешивали. Затем пробирку помещали в термостат фирмы Jouan (Франция) на 40 минут при температуре 37 °C. По истечении данного времени жидкость, образовавшуюся над осадком, отсасывали в центрифужную пробирку, добавляли 5 мл среды RPMI-1640 и центрифугировали в центрифуге с качающимся ротором фирмы Jouan (Франция) при 1000 об/мин. в течение 10 минут. Затем аккуратно отсасывали среду и клеточную взвесь суспендировали в небольшом объеме питательной среды.

Изоляты вируса кори культивировали на перевиваемых культурах клеток В-95а и Vero. Культуры клеток выращивали в среде RPMI-1640 с 5% эмбриональной телячьей сыворотки (BioClot (Pty)Ltd, Германия) при температуре 37 °C.

Инфицирование клеточных культур вирусом кори осуществляли путем внесения вируса непосредственно в питательную среду. Все манипуляции по получению вируссодержащей жидкости проводили в строго стерильных условиях, в ламинаре II степени защиты SterilCARD III фирмы The Baker Company (США).

Всего исследованы 21 штамм вируса кори, полученные от больных в период с 1988 по 2003 годы (табл.4). Определение генотипов данных штаммов проводили на базе двух лабораторий — на базе лаборатории молекулярной диагностики и генно-инженерных конструкций Всероссийского Научно-исследовательского института сельскохозяйственной биотехнологии, РАСХН и на базе Measles Virus Section, Centers for Disease Control and Prevention (CDC), Атланта, США.