Определение экспрессии гена fum1 и fum2 в листьях кукурузы в условиях гипоксии

В ходе работы нами была экстрагирована тотальная РНК из зеленых листьев кукурузы по средству гуанидин-тиоционатного метода. Используя данную методику, нам удалось получить высокоочищенную суммарную клеточную РНК, анализ которой проводился в 1% агарозном геле. После чего полученную РНК использовали в реакции обратной транскрипции с целью получения кДНК. Уровень экспрессии генов fum1 и fum2, отвечающих за кодирование двух отличных друг от друга изофермента фумаратгидротазы, оценивался с помощью метода ПЦР в реальном времени, который позволил нам выявить содержание исследуемого фермента в образце.

Проведенный анализ образцов кДНК из кукурузы с праймерами к гену fum1 в условиях нормы и гипоксии позволил установить, что в растениях, находящихся в кислородной среде относительная концентрация мРНК исследуемого гена практически не изменялась на протяжении 24 часов инкубации оставаясь на уровне 4,5−4,7 относительных единиц. Значительно большее разнообразие для данного показателя было обнаружено в растениях, находящихся условиях углекислого газа. К 3 часу экспозиции уровень транскриптов гена fum1 увеличился относительно контрольной точки (0 часов экспрозиции) в 1,47 раза, после чего в последующие часы наблюдалось резкое снижение величины исследуемого показателя. К 24 часам инкубации в среде углекислого газа значение относительной транскрипции гена fum1 составляло 0,3 относительные единицы. Аналогичная ситуация наблюдается при инкубации растений в условиях азота. Интенсивность транскрипции гена fum1 в первые 3 часа увеличилась на 1,48 раза, но в последующем так же, уровень относительной транскрипции снижался до значения 1,1 отн. ед.

Полученные результаты по влиянию углкислого газа и азота на уровень транскрипции гена fum2 фумаратгидратазы в листьях кукурузы свидетельствуют, что в нормальных условиях не происходит изменения в концентрации транскриптов данного гена. Углекислый газ и азот вызывает изменения в работе генетического аппарата клетки, приводящих к уменьшению количества мРНК fum2 в клетках растений. Значительно выраженный эффект наблюдается в условиях азота, что проявляется в резком снижении скорости транскрипции гена fum2 уже к 3 часу эксперимента. Уровень относительный транкрипции для исследуемого гена на 3 час инкубации составил 9,1 отн. ед., что в 1,91 раза меньше контроля. Аналогичный эффект на экспрессию гена fum2 вызывает действие углекислого газа, однако скорость изменения данного показателя значительно медленнее.

Полученные результаты по изучение влияния газового состава среды на уровень транскрипции генов фумаразы в листьях кукурузы свидетельствуют, что углекислый газ и азот вызывает уменьшение количества мРНК генов fum1 и fum2. Полученные данные по скорости транскрипции генов фумаратгидратазы коррелируют с изменением ее активности в условиях гипоксии. Вероятно, полученные данные могут свидетельствовать, что регуляция скорости функционирования фумаратгидратазы в условиях гипоксии регулируется за счет изменения скорости транскрипции ее генов fum1 и fum2.