Трансплантация культур клеток

Проблема трансплантации желез внутренней секреции с целью лечения эндокринной недостаточности, вставшая перед медицинской наукой и практикой в начале ХХ в., е утратила своей актуальности, так как потеря функции этих органов хотя и не всегда опасна для жизни, но вызывает ряд серьезных нарушений.

Применение методов заместительной терапии ограничено узким спектром биологических эффектов, что приводит лишь к частичной компенсации недостаточности, а также развитием рефрактерности к вводимым извне гормонам, побочных реакций, необходимостью систематического введения, невозможностью постоянно осуществлять регуляцию метаболизма в соответствии с биологическими потребностями организма в каждый конкретный период времени. Особенностью трансплантации эндокринных структур является возможность их пересадки в виде целого органа, его фрагмента и даже отдельных клеток, что открывает пути для легкодоступной в хирургическом отношении, свободной трансплантации.

Преимущества клеточной трансплантации Трансплантация органа на сосудистых связях представляет собой, как правило, сложное хирургическое вмешательство и требует применения активной иммуносупрессивной терапии. Пересадка же культуры клеток — обычно несложная хирургическая процедура, упрощенная во многих случаях до обычной инъекции. При этом перед трансплантацией возможно проведение предварительной обработки ткани с целью снижения иммуногенности донорского материала, что позволяет не использовать иммуносупрессию или значительно снизить ее интенсивность. В настоящее время особую ценность приобрела клеточная трансплантация с применением других иммуноизолирующих методов. С помощью техники микроили макроинкапсуляции можно изолировать пересаживаемые клетки от иммунной системы реципиента. Это обусловлено стремлением исследователей исключить иммуносупрессию и, таким образом, снизить риск иммуносупрессивной терапии, а также получить возможность компенсировать нехватку человеческих аллотранс-плантатов щитовидной и других эндокринных желез, используя ксенотрансплантаты.

В настоящее время существует три основных иммуноизолирующих метода: сосудистые перфузионные и диффузионные методы, макрои микроинкапсуляции. Все они основаны на одном и том же принципе: эндо-криноциты, трансплантированные в биосовместимой и нетоксичной в отношении иммобилизованной в селективно проницаемой мембране культуры клеток, эффективно изолированы от иммунной системы хозяина (лимфоциты, антитела, цитокины и др.), в то время как низкомолекулярные субстанции (нутриенты, электролиты, кислород и биоактивные продукты секреции) проходят через мембрану.

Основные иммуноизолирующие подходы Сосудистые перфузионные методы основаны на том, что полупроницаемой мембране придается форма трубки, которая с помощью стандартных хирургических методик «подключается» к системной гемоциркуляции как артерио-венозный шунт. Сама трубка, в которой находятся культуры клеток, суспензированные в агарозном или альгинатном гидрогеле, изготавливается из полупроницаемого материала акрила. Это позволяет клеткам постоянно находиться в суспензированном состоянии, быть максимально приближенными к оптимальной оксигенации и получать более адекватное питание.

Суть метода макроинкапсуляции в том, что культура клеток помещается в полупроницаемую мембрану, которой придаются различные геометрические конфигурации: сферы, конволюты, трубки, коробки разного объема. Полупроницаемые мембраны изготавливают из производных полиуретана, полиамида и других полимерных материалов. Питание культур клеток основано на диффузии нутриентов и кислорода из крови или интерстициальной жидкости в зависимости от места трансплантации.

Метод микроинкапсуляции заключается в использовании альгинат-полилизиновых микрокапсул с помещенными в них культурами клеток. Однако он имеет ограниченное применение в связи с последующим развитием макрофагальной активации, выделением цитокинов, развитием перикапсулярного воспаления, фиброза и цитокин-индуцированной деструкции клеток.

На 2-й кафедре хирургических болезней БГМУ был разработан контейнер, изготовленный на основе производных полиамида и представляющий собой полупроницаемую мембрану с размерами пор 1—2 мкм в диаметре, имеющий длину 12—15 мм и ширину 4—5 мм, что создает условия для достаточной диффузии между кровью и полостью капсулы, а также исключает возможность развития лимфоцитарной и макрофагальной реакции на культуру клеток. Еще одним потенциальным преимуществом клеточной трансплантации является возможность криоконсервирования донорских клеток и создания банка клеток, которые могут быть использованы в любое время, что особенно важно при возникновении потребности в массовых пересадках.

Выбор места пересадки культуры клеток Методы пересадки у разных авторов отличаются, как правило, лишь местом введения культур клеток щитовидной железы: в прямую мышцу живота, в паренхиму печени и в воротную вену, под капсулу почки и селезенки, в большой сальник, внутрибрюшинно, ретробульбарно, под фасцию недоминирующего предплечья и т. д.

Остается не до конца решенной задача о наиболее «привилегированной», иммунологически выгодной зоне трансплантации. Исследованиями белорусских ученых был выявлен ряд новых, ранее не изученных закономерностей трансплантации и теоретически, а затем и экспериментально установлена такая зона — сосудистое русло. Было показано, что в просвете сосудов и сердца имеются особые условия, позволяющие чужеродной ткани длительно сохранять свою жизнеспособность без применения иммуносупрессивной терапии.

Основные источники донорского материала и методики получения культуры клеток щитовидной железы Источником получения культуры ТЦ считается неонатальная и фетальная ткань человека. Однако, несмотря на явные преимущества, получение культуры клеток плодов и новорожденных человека имеет и существенные недостатки: дефицит аллогенного материала, что не позволяет создать достаточный банк культуры клеток, религиозные проблемы и негативная реакция общества, трудоемкий протокол обследования доноров на широкий спектр тяжелых, а порой и смертельных инфекций. Особый интерес представляют исследования, в которых показано, что предварительное культивирование ткани ЩЖ может значительно продлевать ее выживание в организме аллогенного и ксеногенного хозяина при последующей трансплантации. Это связано, с элиминацией так называемых «лейкоцитов-пассажиров» — клеток-костимуляторов иммунного ответа, которые играют большую роль в развитии осложнений. Существует также мнение, что культивирование улучшает выживаемость не за счет уменьшения числа антигенпрезентирующих клеток, а за счет снижения экспрессии антигенов первого класса главного комплекса гистосовместимости.

Таким образом, на современном уровне развития клинической трансплантологии только использование эндокринной ткани после предварительной иммуноальтерации способно обеспечить длительное функционирование пересаженных клеток в условиях аллогенной биологической системы без применения иммуносупрессии. Использование в качестве донорского материала плодных тканей, в качестве метода иммуноальтерации — культивирования, а в качестве иммуноизоляции — методов макрои микроинкапсуляции позволяет обоснованно надеяться на достижение длительного метаболического эффекта.

В лаборатории культур тканей НИИ трансплантологии и искусственных органов Минздрава РФ была разработана методика получения флотирующих культур из ЩЖ плодов человека и животных. Использовали ЩЖ трупов плодов человека 4—5-месячного срока внутриутробного развития, плодов свиньи 2, 5-месячного срока и плодов крупного рогатого скота 3—4-месячного срока внутриутробного развития. После предварительной подготовки ЩЖ измельчали, подвергали обработке коллалитином, в качестве ростовой среды использовали 15% сыворотку крупного рогатого скота.

Культуры клеток ЩЖ, полученные с помощью описанного метода, были успешно пересажены больным первичным ГТ. Взвесь культуры вводили под местной анестезией в прямую мышцу живота. В результате алло-трансплантации культур ТЦ у реципиентов, которых не удавалось компенсировать в достаточной мере с помощью медикаментозной терапии, в посттрансплантационном периоде наступило значительное улучшение субъективного и объективного статуса. Отчетливый лечебный эффект пересадки отмечался на протяжении 9—12 мес.

В Харьковском институте проблем криобиологии и криомедицины разработан свой вариант ксенотрансплантации с использованием органной культуры эндокринных желез новорожденных поросят. Органную культуру для пересадки получали следующим образом. Выделенный в стерильных условиях эндокринный материал в течение 5 сут культивировали при температуре 37 °C в среде, содержащей эмбриональную телячью сыворотку и антибиотики широкого спектра действия. Стерильные образцы подвергали криоконсервации на программном замораживателе. По мере надобности ксенокультуру размораживали, меняли консервирующий раствор на физиологический и проводили подсадку органной культуры в подкожную клетчатку брюшной стенки. При этом одноразовая доза вводимой культуры при средней и тяжелой формах ГТ подбиралась из расчета одна ЩЖ на 2—2,5 кг массы реципиента. Через две недели после трансплантации определяли уровень тироидных гормонов в крови, после чего в зависимости от состояния пациента подбиралась схема снижения дозы заместительных гормональных препаратов. Приведенные данные, а также результаты опытов по ксенотрансплантации культур из ЩЖ в пульпу селезенки и под капсулу почки крыс свидетельствуют о возможности использования таких культур для клинической трансплантации при лечении ГТ.