Состояние системы цитокинов и специфического иммунного ответа у детей и подростков с туберкулезом органов дыхания в Приморском крае

Актуальность исследования;

Современная ситуация по туберкулезу характеризуется высоким уровнем заболеваемости, которая наряду с социальными факторами, обусловлена формированием полирезистентных штаммов микобактерий туберкулеза, заметным увеличением числа больных с иммунодефицитами различной природы, неблагоприятной экологической обстановкой [4, 22, 84,174, 246].

В Приморском крае показатели заболеваемости туберкулезом, как взрослых, так и детей и подростков превышают республиканские в 1,5 — 2 раза [29, 32].

Наряду с высокой заболеваемостью, меняется и клиническое течение туберкулезной инфекции. Туберкулез органов дыхания у детей и подростков характеризуется клиническим полиморфизмом от малых форм с бессимптомным развитием болезни до обширных, распространенных поражений [85, 97, 105,127,179].

В развитии туберкулеза, с одной стороны, играет роль массивность инвазии, а с другой, резкое снижение сопротивляемости макроорганизма. При этом центральным звеном приобретенной резистентности к туберкулезу является специфический клеточный иммунитет. Его недостаточность во многом определяет особенности клинического течения, характер и исход заболевания. Развитие иммунной недостаточности может быть обусловлено токсическим действием специфической микрофлоры на иммунокомпетентные клетки и иммунодепрессивным действием химиотерапевтических средств, дискутируется роль генетических факторов [1,13, 66,110].

Процесс взаимодействия макрофагов с микобактериями туберкулеза сложен и до конца не изучен. С одной стороны, туберкулезная инфекция приводит к подавлению микробицидной активности макрофагов, а с другой стороны, макрофаги способны контролировать микобактериальную инфекцию под влиянием адекватной продукции цитокинов. Однако чрезмерно высокие уровни синтеза последних способствуют возникновению иммунопатологических процессов, а сниженная продукция — нарушает механизмы проти-воинфекционной защиты [99, 128, 164, 208, 270]. Сведения об иммунной системе, межклеточных взаимодействиях в организме, накопленные за последние десятилетия, позволяют отнести туберкулез к интерлейкинзависимым иммунодефицитам с выраженными изменениями в цитокиновой сети [68], и по-новому подойти к рассмотрению патогенеза туберкулеза.

Представленные в литературе исследования цитокиновой регуляции механизмов развития туберкулезной инфекции у детей немногочисленны [9, 139, 198]. На территории Приморского края исследования системы цитоки-нов у детей и подростков с туберкулезом органов дыхания не проводились.

В настоящее время имеется насущная необходимость изучения патогенеза туберкулеза как в преморбидном периоде, так и при его прогрессирующем течении [166]. Дальнейшее изучение цитокиновой регуляции развития туберкулезной инфекции будет способствовать пониманию современного патоморфоза туберкулеза, повышения уровня заболеваемости и терапевтических неудач, а также поиску новых критериев диагностики и эффективности проведения противотуберкулезной и иммунотропной терапии у детей.

Цель исследования:

Охарактеризовать спектр изменений в системе цитокинов и специфическом иммунном ответе у детей и подростков с разными формами туберкулеза органов дыхания.

Задачи исследования:

1. Уточнить особенности клинического течения и диагностики туберкулеза органов дыхания у детей и подростков в Приморском крае.

2. Оценить результаты общедоступных клинико — лабораторных анализов (реакция лейкоцитолиза и изменение скорости оседания эритроцитов в присутствии туберкулина, выявление циркулирующих иммунных комплексов) и определить корреляционные взаимосвязи с цитокиновым статусом у тубинфицированных и больных туберкулезом органов дыхания детей и подростков. б .' ,.

3. Изучить цитокиновый профиль и особенности цитокиновой регуляции (IL-la, IL-8, IFNy, TNFa, IL-10) при различных вариантах развития туберкулезной инфекции у детей и подростков.

4. Исследовать конденсат выдыхаемого, воздуха на содержание стабильных метаболитов оксида азота и бронхоальвеолярную жидкость на содержание IL-8 у больных туберкулезом органов дыхания детей и подростков.

5. Оценить влияние стандартной противотуберкулезной терапии на уровень продукции IL-Гсц IL-8, IFNy, TNFa й IL-10.

Научная новизна исследований:

В результатевыполненных исследований впервые изучены особенности цитокиновой регуляции иммунитета у тубинфицированных и больных туберкулезом органов дыхания детей и подростков, на основе комплексной оценки содержания цитокинов IL-la, IL-8, IFNy, TNFa и IL-10 в сыворотке крови обследуемых. Установлена гетерогенность продукции цитокинов при различных вариантах течения туберкулезной инфекции у детей и подростков.

Получены дополнительные доказательства превалированиям Thl — иммунных реакций при туберкулезе у детей и подростковПоказано^ что каждый вариант развития и многообразие проявлений туберкулезной-инфекции определяется характером иммунного ответа и своей системой функционирования цитокиновой сети, с наличием нескольких уровней продукции цитокинов, обусловленных степенью функциональной активности клеток — продуцентов цитокинов. Развитие первичных форм туберкулеза характеризовалось достоверным ростом системного уровня IL-la, IL-8, IFNy, TNFa, IL-10. При вторичных формах туберкулеза наблюдался дисбаланс цитокиновой сети с гиперпродукцией TNFa и наличием дефицита IL-la, IL-8, IFNy, IL-10. Отличительной особенностью цитокиновош статуса инфицирования МБТ от туберкулеза являлась гиперпродукция IL-8 при нормальном соотношении оп-позитных цитокинов (IFNy/IL-10). Впервые проведено исследование конденсата выдыхаемого воздуха на содержание стабильных метаболитов, оксида азота у детей и подростков с туберкулезом органов дыхания. Выявлены закономерности соотношения показателей нитрит-аниона и суммарного количества стабильных метаболитов оксида азота.

Впервые в Приморском крае исследован уровень содержания IL-8 в бронхоальвеолярном лаваже у детей и подростков, больных туберкулезом органов дыхания. Обнаружена взаимосвязь между увеличением содержания стабильных метаболитов оксида азота в конденсате выдыхаемого воздуха и изменением уровня цитокинов в сыворотки крови, IL-8 в бронхоальвеолярном лаваже у детей, больных туберкулезом органов дыхания.

Положения выносимые на защиту:

1. Различные варианты течения туберкулезной инфекции у детей и подростков характеризуются гетерогенностью продукции цитокинов. Развитие туберкулеза у детей и подростков связано с первичным дефектом запуска ци-токинового каскада в ответ на микобактерию туберкулеза, на фоне превалирования Thl иммунных реакций.

2. Имеются существенные различия иммуногенеза между первичными и вторичными формами туберкулеза у детей и подростков. В основе иммунного ответа на микобактерию туберкулеза, при превалировании поражения лимфоидной ткани лежит активация иммунного ответа с гиперпродукцией всех цитокинов, а при поражении легочной ткани — угнетение иммунного ответа вследствие дисбаланса цитокиновой сети.

3. При туберкулезе, гуморальный иммунный ответ может взаимодействовать с клеточным ответом в синергизме, конкуренции или выступать как замещающий механизм на фоне незавершенных клеточных защитных реакций.

Практическая ценность работы:

1. Определение уровней содержания IL-la, IL-8, IFNy, TNFa и IL-10, а также коэффициент IFNy/IL-10 позволяют выявить вариант развития иммунологического дисбаланса, расширить оценку эффективности проведения стандартной противотуберкулезной терапии.

2. Установлены дополнительные дифференциально — диагностические критерии при первичных и вторичных формах туберкулеза органов дыхания, которые помогают оценить риск, развитие, течение, тяжесть, прогноз заболевания;

3. Изучение цитокинового статуса позволило теоретически обосновать необходимость и рациональность включения в комплекс стандартной противотуберкулезной терапии вторичных форм туберкулеза иммунотропных препаратов.

4- Дана характеристика биохимических маркеров воспаления (стабильные метаболиты оксида азота) в КВВ. Выявлена прямая корреляционная зависимость содержания стабильных метаболитов оксида азота в конденсате выдыхаемого воздуха, IL-8 в сыворотке крови и БАЛЖ с развитием туберкулеза органов дыхания, что дало возможность рекомендовать проводить исследование N0 в КВВ в качестве диагностического критерия активности туберкулеза.

5. Оценка результатов, реакции лейкоцитолиза, скорости оседания эритроцитов в присутствии туберкулина и уровня ЦИК, в комплексе с другими методами диагностики могут быть использованы, для дифференциальной диагностики и оценки степени активности туберкулезного процесса. Материалы диссертации легли в основу методических рекомендаций «Клинико — иммунологические аспекты диагностики туберкулеза», утвержденных ВГМУ иДЗАПК, (Владивосток, 2005), внедренных в практическое здравоохранение Приморского края: и учебный процесс ВГМУ, АГМА.

Апробация материалов работы;

Результаты работы были представлены на научно — практических конференциях и симпозиумах регионального, российского и международного уровня: Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Дни иммунологии в Санкт — Петербурге» (Санкт-Петербург, 2002), Научно-практической конференции «Актуальные проблемы инфекционной патологии на Дальнем Востоке России» (Хабаровск, 2002), 1Гнаучно — практической конференции Дальнего Востока «Генодиагностика в практической медицине Дальнего Востока» (Владивосток, 2002), XII Национальном конгрессе по болезням органов дыхания (Москва, 2002), Международной научно — практической конференции «Цитокины, воспаление, иммунитет» (Санкт-Петербург, 2003).

Публикации Результаты исследований изложены в 10 публикациях, в том числе глава «Система цитокинов и туберкулезная инфекция» в монографии «Система цитокинов и болезни органов дыхания».

Объем и структура диссертации Диссертация изложена на 195 листах машинописного текста, состоит из 5 глав, содержит введение, обзор литературы, описание материалов, методов исследования, результаты исследования, выводы, практические рекомендации для внедрения в медицинскую науку и практику, список использованной литературы, содержащий 272 источника (из них 182 отечественных и 90 зарубежных автора). Диссертация иллюстрирована 77 таблицами и 29 рисунками.

165 ВЫВОДЫ.

1. У 38% детей с первичными формами и 34,1% случаев вторичных форм туберкулеза клиническое течение заболевания характеризуется малосим-птомностью на фоне множества разнонаправленных факторов развития туберкулеза. Степень и характер иммунных нарушений, выявленных у больных, отражают развитие инфекционного процесса: При первичных формах туберкулеза превалирует поражение лимфоидной системы с активацией иммунного ответа, при вторичных формах процесс локализуется, в легких с угнетением иммунного ответа.

2. Особенностью, цитокинового статуса у детей и подростков с тубинфици-рованностью и активным туберкулезом органов дыхания является, гетерогенность продукции цитокинов с распределением на низкие, высокие и средние показатели. Несмотря на неоднородность цитокинового ответа, развитие туберкулеза органов дыхания характеризуется превалированием Thl типа иммунного ответа, направленного на защиту от микобактерии туберкулеза.

3. Первичные формы туберкулезахарактеризуется гиперпродукцией цитокинов IL-la, IL-8, IFNy, TNFa, IL-10: При вторичных формах туберкулеза отмечен дисбаланс цитокиновой сети с гиперпродукцией TNFa и дефицитом IL-8, IFNy, IL-10 на фоне незначительных сдвигов в сторону увеличения IL-la. Отличительной особенностью инфицирования МБТ от туберкулеза является гиперпродукция: IL-8 при нормальном соотношении оппозитных цитокинов (IFNy/IL-10).

4. У детей с туберкулезом органов дыхания в конденсате выдыхаемого воздуха увеличивается содержание стабильных метаболитов оксида азота на фоне локальной гиперсекреции IL-8, что является признаком активности туберкулеза.

5. У 25% детей с первичным и 40% больных с вторичным туберкулезом одновременно зарегистрированы положительные результаты ЦИК, S-СОЭ, PJIJI, что свидетельствует о значительной активации у них гуморального звена иммунитета. Выявлена прямая корреляционная связь средней силы между уровнем S-СОЭ, и IL-8, IL-10, а также обратная зависимость между содержанием IL-la, IFNy и высоким уровнем лейкоцитолиза.

6. В группе детей с распространенными, осложненными формами первичного туберкулеза на фоне противотуберкулезной терапии возрастание уровня IL-8, IFNy, IL-10 свидетельствует о сохранении воспалительного процесса и недостаточном объеме терапии. При вторичных формах туберкулеза в процессе проведения стандартного противотуберкулезного лечения отмечено усиление дефицита продукции IL-la, IL-8, IFNy, IL-10 и снижение синтеза TNFa, коэффициента IFNy/IL-10.

РЕКОМЕНДАЦИИ ДЛЯ ВНЕДРЕНИЯ В МЕДИЦИНСКУЮ НАУКУ И ПРАКТИКУ.

1. Традиционные методы обследования (туберкулинодиагностика, рентгенологическое обследование) у детей и подростков не в полной мере позволяют провести раннюю диагностику первичных форм туберкулеза органов дыхания. В 82,6% случаев заболевание выявляется в стадиях кальцификации лимфоузлов, с туморозными и хронически текущими формами. Ретроспективный анализ установил начало заболевания у 57,5% детей во время виража туберкулиновых проб. Включение в алгоритм обследования детей с отягощенными медико-социальными факторами (семейный туберкулезный контакт) во время виража туберкулиновых проб определение системного уровня IL-8, IFNy, IL-10 с расчетом коэффициента IFNy/IL-Ю позволяет уточнить степень иммунных нарушений у детей из группы риска по туберкулезу и выработать тактику их лечения и наблюдения.

2. Нарушение цитокиновой регуляции иммунного ответа при туберкулезе предопределяет возможность использования в качестве критериев оценки варианта и степени развития иммунных нарушений, эффективности лечения определение уровня IL-la, IL-8, IFNy, TNFa и IL-10. Наиболее информативен и не зависит от гетерогенности продукции цитокинов расчет индекса IFNy/IL-10.

3. Увеличение содержания метаболитов оксида азота в конденсате выдыхаемого воздуха у 100% детей, больных активным туберкулезом, дает возможность рекомендовать использование этого маркера в качестве дополнительного диагностического критерия в оценке активности туберкулеза, особенно при ограниченных процессах, с субпороговым уровнем клинической симптоматики.

4. На фоне противотуберкулезной терапии при вторичных формах туберкулеза происходит усугубление недостаточности в системе цитокинов, что обуславливает необходимость включения иммунотропных препаратов в схемы стандартов лечения детей с вторичными формами туберкулеза.

5. Применение общедоступных методов иммунодиагностики (ЦИК, PJIJI, S-СОЭ) в комплексе с другими методами диагностики оправданно и позволяет установить активность туберкулезного процесса, выявить недостаточность клеточных механизмов противотуберкулезного иммунитета, в динамике оценить эффективность лечения.

6. Рекомендовать внедрение методических рекомендаций «Клинико — иммунологические аспекты диагностики туберкулеза» в клиническую практику врачей фтизиатров, пульмонологов, аллергологов-иммунологов, клиницистов других специальностей.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В Приморском крае на фоне стабильно высокой заболеваемости туберкулезом органов дыхания среди детей и подростков характерно позднее выявление заболевания (по обращению при вторичных формах туберкулеза, выявление первичных форм туберкулеза с явлениями кальцинации).

Туберкулез характеризуется значительным клиническим полиморфизмом от ограниченных, малосимптомных форм, до обширных распространенных поражений с выраженной клинической симптоматикой. У 38% детей с первичными формами и 34,1% случаев вторичных форм туберкулеза регистрируется иннаперцептное течение заболевания.

Выявление виража туберкулиновых проб в течение 3-х лет до установления диагноза у 57,7% детей с первичными формами туберкулеза и 54,8% с вторичными формами туберкулеза позволяет предполагать начало болезни именно в момент первичного инфицирования.

Наличие множества разнонаправленных факторов развития туберкулеза, не позволяют с полной достоверностью поставить или опровергнуть диагноз туберкулез (в том числе, контакт с родственниками, больными туберкулезом, отсутствие или некачественно проведенная иммунизация БЦЖ, гипе-рергическая чувствительность к туберкулину). Полученные результаты указывают на трудности в проведении дифференциальной диагностики между инфекционной и поствакцинальной аллергией к туберкулину.

Проведение специфической иммунопрофилактики является фактором, который изменяет иммунный ответ на микобактерию туберкулеза, помогает иммунной системе ограничить и/или самостоятельно (без лекарственной терапии) обратить туберкулезный процесс, что обуславливает высокий удельный вес малых, ограниченных форм, туберкулеза в стадии обратного развития. В то же время вакцинация БЦЖ не предотвращает развитие инфицирования МБТ и туберкулеза.

Надо отметить, что у 73,9% и 73,2% детей с первичными и вторичными формами туберкулеза выявляются заболевания, сопутствующие туберкулезу, которые могут быть как проявлением туберкулезной инфекции и особой иммунологической реактивностью организма, так и факторами, поддерживаю, щими эту реактивность и сам туберкулез, и являться одним из условий способствующим формированию хронической туберкулезной интоксикации и развитию вторичного иммунодефицита. .

На современном этапе понимания функционирования иммунной системы одну из важных составляющих в реализации иммунного ответа на различные патогенны, играют медиаторы межклеточных коммуникаций — цито-кины. Значение цитокинов давно вышло за рамки иммунологии, поскольку они играют важную роль в регуляции разнообразных функций организма, особенно при развитии различных патологических состояний. Воспаление и иммунный ответ сопряжены с индукцией и секрецией сразу многих цитокинов, их универсальность, кооперативные эффекты на различные клетки, участвующие в реализации противоинфекционного иммунитета, позволяют в настоящее время рассматривать эти медиаторы как систему иммунных взаимодействий — цитокиновую сеть. Изучение цитокиновой сети в разрезе развития туберкулеза позволяет уточнить причины многообразия проявлений этой инфекции и выработать дальнейшие пути ее диагностики и лечения [160,161,182].

Исследование системного уровня IL-la, IL-8, TNFa, IFNy и IL-10 у детей и подростков с туберкулезной инфекцией проводилось через вычисление частоты выявления групп показателей с разным уровнем содержания цитокинов в крови, средних показателей с достоверностью различия между ними, динамики их изменения по отношению к здоровым детям, а также выявление корреляционных взаимосвязей через непараметрический критерий — коэффициент Spearmen.

В результате исследования цитокинового статуса в сыворотке крови были уточнены особенности иммунного ответа при различных проявлениях туберкулезной инфекции. Анализ содержания IL-la, IL-8, TNFa, IFNy и IL-10 в сыворотке крови позволил утверждать о наличии нескольких уровней продукции цитокинов при различных патогенетических формах туберкулезной инфекции.

Дети и подростки по показателям IL-la, IL-8, IFNy, IL-10 распределились на три группы со сниженным, нормальным и высоким уровнем продукции цитокина, по TNFa на группу с нормальным и высоким синтезом. При этом в группах с различным уровнем содержания цитокинов можно было выделить еще более сложную систему группировки показателей, что, возможно, связано с циркадностью и цикличностью синтеза цитокинов при туберкулезе. Предполагается, что изменение частоты выявления показателей с разным содержанием цитокинов в сыворотке крови при различных формах и клинико — рентгенологической картине туберкулеза обусловлено степенью функциональной активности клеток продуцентов цитокинов и регуляторных взаимодействий между ними [164,170].

Согласно патогенеза развития туберкулезной инфекции у детей и подростков имеется три основных клинических варианта развития туберкулезной инфекции — тубинфицированность, первичные формы туберкулеза органов дыхания с преобладанием поражения лимфоидной системы, вторичные формы туберкулеза с преобладанием поражения легочной паренхимы [181].

Нам удалось проследить ряд кооперативных эффектов взаимовлияния цитокинов друг на друга в зависимости от варианта развития туберкулезной инфекции. В конечном итоге мы пришили к заключению, что каждый вариант развития туберкулезной инфекции определяется своей системой функционирования цитокиновой сети, в которой есть как общие, сходные эффекты взаимовлияния цитокинов друг на друга, так и различия, определяющие развитие той или иной формы туберкулеза органов дыхания, либо особого функционального состояния — тубинфицированности (рис.28).

Тубинфицированность t ILla.

04 N^ ^/+0,0004.

0,04 *TNFa|.

Первичные формы туберкулеза («туберкулез внутригрудных лимфоузлов).

0,01 * *+0,01 IFNyt*.

Вторичные формы туберкулеза (инфильтративный, очаговый туберкулез легких) t IL-la +0,0031 0,03+.

0,04^rIL8 I*.

IFNy I.— '" .

Обозначения:

1. однонаправленное влияние, прямая корреляционная взаимосвязь ->

2. взаимовлияние друг на друга, с преобладанием, либо равным соотношением влияния друг на друга -> -*—>

3. обратная сигнальная взаимосвязь .

4. кооперативный эффект вместе с другим цитокином •.

5. II — динамика изменения цитокинов.

6. * - достоверность.

7. +0,03 — степень и направление влияния Рис. 28 Взаимосвязь уровней содержания IL-la, IL-8, TNFa, EFNy и IL-10 в сыворотке крови у тубинфицированных и больных первичными и вторичными формами туберкулеза органов дыхания детей и подростков В результате исследования IL-la у детей и подростков с различными проявлениями туберкулезной инфекции выявлена взаимосвязь между увеличением содержания IL-la в сыворотке крови со всеми другими цитокинами, что косвенно указывает на универсальность действия данного цитокина, как первичного фактора стимулирующего запуск цитокинового каскада при туберкулезном воспалении. Зарегистрировано нарастание уровня этого цитокина как у тубинфицированных, так и больных туберкулезом органов дыхания детей и подростков. Наиболее выраженный рост содержания цитокина отмечен при первичных формах, наименьший — при вторичном туберкулезе. Возможно, уровень продукции IL-la и его влияние на синтез ряда цитокинов определяет развитие и форму туберкулеза. При тубинфицированности нарастание продукции цитокина одновременно влияет на синтез IFNy и IL-10, и опосредованно через TNFa и IFNy, стимулирует выработку IL-8. Снижение уровня IL-8, может являться сигналом для увеличения продукции IL-la, так как оба цитокина обладают стимулирующим влиянием на клеточные механизмыестественного иммунитета. Так, при первичных формах туберкулеза отмечается прямая взаимосвязь между нарастанием содержания IL-la и IL-8 в сыворотке крови. При этом более высокому уровню IL-la соответствует менее высокое содержание IL-8 в сыворотке крови.

Несмотря на стимулирующий характер влияния IL-la на синтез IL-10 при всех вариантах развития туберкулезной инфекции, обнаружено обратно антагонистическое влияние IL-10 на продукцию IL-la. Это косвенно подтверждается выявлением корреляционных взаимосвязей между IL-la и реакцией лейкоцитолиза, которая является маркером активации гуморального иммунитета и Th2 типа, дифференцировку и активацию которых осуществляет IL-10. При увеличении уровня лейкоцитолиза достоверно снижается уровень IL-la в сыворотке крови.

Если при первичных формах туберкулеза и тубинфицированности нами были прослежены взаимосвязи IL-la с различными цитокинами, то при вторичных формах туберкулеза на фоне неадекватно низкого увеличения уровня.

IL-la, большинство этих связей выявить не удалось, за исключением IL-10. Этот факт косвенно указывает на первичный дефект запуска цитокинового каскада при развитии вторичных форм туберкулеза, который проявляется снижением продукции оппозитных цитокинов IFNy и IL-10, изменение уровня которых позволяет предполагать угнетение как клеточного, так и гуморального звена иммунитета.

В процессе проведения фазы интенсивной противотуберкулезной терапии при первичных и вторичных формах туберкулеза зафиксирована различная динамика изменения уровня IL-la. При первичных распространенных формах туберкулеза отмечается дальнейшее нарастание системного уровня этого интерлейкина, а при ограниченных первичных и вторичных формах наоборот его снижение. Это позволяет предполагать, что при адекватном запуске цитокинового каскада прогноз развития первичных форм туберкулеза будет благоприятным, напротив более тяжелое течение болезни будет связано с неконтролируемой цитокинемией, так как при всех распространенных формах первичного туберкулеза, несмотря на проведение противотуберкулезной терапии, продолжается нарастание продукции всех цитокинов. Лечение вторичных форм туберкулеза с использованием стандартных схем, несмотря, на положительную динамику процесса, будет усугублять иммунодефицит, как следствие первичных дефектов стимуляции цитокинового каскада.

Особое место в развитии туберкулезной инфекции занимает TNFa. Этот цитокин участвует не только в защитных реакциях, процессах запуска воспаления, но и в процессах деструкции и репарации сопутствующих этому воспалению [150].

Увеличение системного уровня TNFa зарегистрировано нами, как у тубинфицированных, так и больных туберкулезом органов дыхания детей и подростков. Нам не удалось проследить прямых взаимосвязей между содержанием TNFa и IL-la, IL-8, IFNy, IL-10. Но, тем не менее, выявлено взаимное влияние TNFa с другими цитокинами. Так отмечен синергизмом действия TNFa и IFNy на продукцию IL-8 и взаимовлияние IL-la и TNFa друг на друга.

Как известно наряду с IL-1, TNFa выступает регулятором запуска ци-токинового каскада [17, 100]. Значительная гиперпродукция цитокина выявлена при вторичных формах туберкулеза, на фоне угнетения IFNy и невысокого уровня продукции IL-la. При первичных формах туберкулеза и тубинфицированности частота выявления высокореагирующих значений и уровень TNFa были практически одинаковыми. Но, при тубинфицированности увеличение содержания TNFa, IL-la, IFNy в сыворотке крови менее выражено, чем при первичных формах туберкулеза. Таким образом, гиперпродукция TNFa может супрессировать выработку IL-la, IFNy. Запуск цитокинового каскада через TNFa будет являться неблагоприятным вариантом развития иммунного ответа на микобактерию туберкулеза, и приводит к развитию более тяжелых форм заболевания. Цитокином, который выступает антагонистом TNFa, является IL-10. IL-10 проявляет наибольший антагонизм по отношению к TNFa при тубинфицированности, таким образом предотвращает развитие туберкулеза, и выступает как истинный противовоспалительный цитокин.

Исследование системного уровня TNFa по окончании фазы интенсивной терапии первичных форм туберкулеза выявило сохранение высокого уровня выработки TNFa. Наоборот, при вторичных формах отмечена полная нормализация уровня цитокина.

Изучение системного уровня IL-8 позволило констатировать важную роль IL-8 в развитии туберкулеза. Зарегистрировано нарастание содержание IL-8 в сыворотке крови при тубинфицированности и первичных формах туберкулеза. Напротив, при вторичных формах туберкулеза — его снижение. Нам удалось выявить взаимосвязь IL-8 с двумя другими цитокинами — IFNy, TNFa. Обнаружено одновременное, равное по степени увеличение IL-8 и IFNy как при первичных формах, так и при тубинфицированности и одновременное их снижение при вторичных формах туберкулеза. Наиболее высокий уровень IL-8 был зафиксирован при тубинфицированности. Полученные результаты позволяют нам подтвердить литературные данные о повышении продукции этого цитокина на начальных этапах развития туберкулеза вследствие стимулирующего влияния на его синтез IFNy и TNFa, как результат индукции МБТ. Причем можно видеть пример синергизма действия IFNy + TNFa — усиление продукции IL-8 при их одновременном участии. Так как, при первичных формах туберкулеза происходит отмена их одновременного влияния на уровень IL-8 за счет снижения уровня TNFa, что проявляется ослаблением взаимосвязи между содержанием IFNy и IL-8 в сыворотке кровии менее выраженным увеличением уровня IL-8 на фоне гиперпродукции IFNy (по сравнению с тубинфицированностью). Несомненно, прослеживается влияние IL-8 на продукцию IFNy, вероятно через активацию нейтрофилов, что способствует, при сохранении функциональной активности клеток, дальнейшему росту уровня IFNy. При вторичных формах туберкулеза угнетение продукции как IFNy, так и IL-8, вероятно, связано со снижением функциональной активности клеток-продуцентов этих цитокинов.

В нашем исследовании не удалось выявить прямых взаимосвязей между системным уровнем IL-8 и остротой туберкулезного процесса, как при первичных, так и при вторичных формах. Наблюдался однонаправленный характер изменения цитокина. Но, тем не менее, отмечена опосредованная взаимосвязь динамики изменения цитокина с распространенностью поражения при первичных формах туберкулеза. В процессе лечения регистрируется снижение содержания IL-8 в сыворотке крови при ограниченных формах туберкулеза и сохранение его высокого уровня при распространенных, осложненных процессах. Надо отметить, что изменение содержания IL-8 было однонаправлено связано с изменением уровня IFNy. Анализ полученных нами данных позволяет предполагать, что высокий уровень синтеза IL-8 способствует предотвращению, а в случае развития первичного туберкулеза ограничению поражения и возможно локализации процесса именно в лимфатических узлах, а не в легочной ткани. Полученные результаты не согласуются с мнением исследователей указывающих, что высокий уровень IL-8 однозначно коррелирует с неблагоприятным прогнозом заболевания. Мы считаем, что высокий уровень IL-8 способствует предотвращению, ограничению туберкулезного воспаления: Этот вывод подтверждается результатами одновременного изучения содержания IL-8 в бронхоальвеолярном лаваже и стабильных метаболитов оксида азота в конденсате выдыхаемого воздуха. При котором было зарегистрировано одновременное увеличение уровня IL-8 в сыворотке крови и БАЛЖ, на фоне достоверного увеличения концентрации стабильных метаболитов оксида азота в КВВ. Это свидетельствует о взаимосвязи между показателями локального и системного уровня синтезаТЬ-8 с уровнем содержания стабильных метаболитов оксида азота в КВВ и указывает нанесомненный факт стимулирующего влияния IL-8 на увеличение бактерицидности клеток, через их активацию с усилением метаболизма оксида азота.

Учитывая, что при различных вариантах туберкулезной инфекции IFNy и IL-10 являются: основными оппозитными медиаторами хронического иммунного воспаления, каким является туберкулез, их взаимовлияние между собой и с другими цитокинами должно рассматриваться не с. позиции буквальной активации или угнетения продукции этих цитокинов, а соотношения изменения их синтеза. У детей и подростков с разными вариантами течения туберкулеза регистрируется однонаправленная динамика изменения системного уровня IL-10 и IFNy. Так зафиксирована тенденция к увеличению выработки их у тубинфицированных и дальнейшее нарастание системного уровня при первичных формах туберкулеза. Напротив, при вторичных формах туберкулеза отмечена тенденция одновременного снижения IL-10 и IFNy. Но при этом степень изменения уровня каждого цитокина различна, в связи с чем, изменяется соотношение их при различных проявлениях туберкулезной инфекции. У тубинфицированных детей уровень повышения оппозитных цитокинов в сыворотки крови был одинаков, а соотношении IFNy/IL-10 сохранилось на уровне здоровых детей. При различных формах туберкулеза, независимо от направления изменения уровня содержания цитокинов, продукция IFNy преобладала над синтезом IL-10, с увеличением коэффициента IFNy/IL-10. Это позволило нам предполагать, что при туберкулезе имеет место преобладание иммунного ответа по Th-1 типу. При тубинфицированности и первичных формах туберкулеза — стимуляция иммунного ответа как по Thl, так и Th2 типу. Но если при тубинфицированности регуляторные взаимоотношения между разными звеньями иммунитета не нарушены, то при развитии первичных форм туберкулеза отмечается преобладание Thl над Th2. При вторичных формах туберкулеза наблюдаются иные механизмы функционального дисбаланса, а именно угнетение как клеточного, так и гуморального звеньев иммунитета, но с сохранением. контроля Thl клеток в реализации иммунного ответа. Как уже упоминалось, угнетение синтеза IFNy и других цитокинов при вторичных формах туберкулеза связано с изначальными дефектами в запуске цитокинового каскада. При этом снижение продукции IFNy влечет за собой уменьшение синтеза IL-8, и по механизму обратной связи увеличение TNFa.

В результате изучения системного уровня IFNy и IL-10 отчетливых различий по содержанию их в сыворотке крови между процессами с распространенным, осложненным и ограниченным, неосложненным характером поражения органов дыхания не установлено. Тем не менее, нам удалось выявить, что объем поражения, и развитие осложненного течения зависели от соотношения, и особенно динамики изменения IFNy и IL-10. Развитие значительных клинико — рентгенологических изменений было связано с функциональной недостаточностью по отношению к IFNy противовоспалительного цитокина IL-10. Так при распространенных и ограниченных формах первичного туберкулеза увеличение IFNy было практически равным. При вторичном туберкулезе дефицит IFNy нарастал более значительно при ограниченных, чем при распространенных формах процесса. Напротив, нарастание IL.

10 при распространенных первичных формах туберкулеза было менее выражено, чем при ограниченных процессах, а при вторичном распространенном туберкулезе снижение уровня этого интерлейкина более выраженное. Но динамику процесса определял не IL-10, a IFNy. Так при первичных распространенных процессах на фоне лечения выявляется тенденция роста системного уровня IFNy. В результате проводимой противотуберкулезной терапии отмечена тенденция к снижению уровня IFNy и IL10 в сыворотке крови, как при первичных, так и при вторичных формах туберкулеза. Но если при первичных формах туберкулеза, несмотря на снижение гиперпродукции цитокинов, их уровень оставался высоким, то при вторичных формах у всех больных был констатирован дефицит IFNy и в 90% случаев низкие значения IL-10. При этом динамика снижения IFNy преобладала над динамикой IL-10, что в конечном итоге приводило к понижению соотношения этих оппозитных цитокинов, ниже коэффициента здоровых детей, особенно при вторичных формах туберкулеза.

В процессе лечения, при регрессии первичного туберкулезного процесса, возможно, имеет место снижение гиперпродукции IFNy и IL-10 и их антагонистического влияния друг на друга. При вторичных формах туберкулеза на фоне лечения происходит дальнейшее усиление иммунодефицита и истощение Thl клеточных механизмов противоинфекционной защиты.

В результате изучения цитокинового статуса мы пришили к заключению: • Несомненно, нарушение или первичный дефект продукции IL-1 в ответ на микобактерию туберкулеза будет определять пути регулирования всего иммунного воспаления, которым является туберкулез.

• • IL-8 — провоспалительный цитокин при развитии туберкулеза способствует предотвращению, ограничению туберкулезного воспаления. Обнаружение высокого содержания IL-8 в сыворотке крови у детей из туберкулезных очагов с гиперергической чувствительностью будет указывать на высокий риск развития туберкулеза.

• 11¹⁰ способствует ограничению туберкулезного воспаления и возможно наряду с IL-la определяет место поражения туберкулезом органов дыхания — лимфоидная или легочная ткань:

• Несомненно, IFNy выступает как основной регуляторный медиатор туберкулезного воспаления, определяя преобладание клеточных механизмов (Thl) иммунного ответа, над гуморальными (Th2). Нарушение продукции этого цитокина может способствовать развитию как неконтролируемой цито-кинемии, так и угнетению регуляторных функций всей цитокиновой сети. При туберкулезе преобладает Thl иммунный ответ.

• Немаловажную роль играет соотношение IFNy/IL-Ю, как маркер, указывающий на взаимодействие Thl и Th2 иммунных реакций. При высоком уровне IFNy/IL-Ю, возможен риск и развитие туберкулеза. Чем выше уровень IFNy/IL-Ю, тем больше выраженность, распространенность, острота туберкулеза. Низкий уровень соотношения оппозитных цитокинов указывает на развитие иммунодефицита.

• Имеются существенные различия иммуногенеза между первичными и вторичными формами туберкулеза у детей и подростков. В основе иммунного ответа на микобактерию туберкулеза, при превалировании поражения лимфоидной ткани, лежит активация иммунного ответа с гиперпродукцией всех цитокинов, а при поражении легочной ткани — угнетение иммунного ответа вследствие дисбаланса цитокиновой сети.

• Нами найдено три варианта цитокинового статуса. При тубинфицирован-ности достоверно нарастает уровень IL-8 и TNFa с тенденцией к одновременному увеличению оппозитных цитокинов IFNy и IL-10 и отсутствием изменения коэффициента IFNy/IL-Ю. У больных туберкулезом достоверно повышается уровень ILla на фоне снижения секреции 11⁸ по сравнению с тубинфициро-ванностыо. Нарушается соотношение IFNy и IL-10, за счет преимущественного повышения IFNy. При первичных формах туберкулеза достоверно увеличиваются все изученные нами цитокины (IL-la, IL-8, TNFa, IFNy и IL-10), особенно IL-la, IFNy и IL-10. При вторичных формах туберкулеза на фоне гиперпродукции TNFa и тенденции к увеличению IL-la происходит угнетение синтеза IL-8, IFNy, IL-10.

• IL-8 и IL-10 определяют объем, IFNy регрессию, IL-la и TNFa локализацию туберкулеза органов дыхания.

• Результатом противотуберкулезной терапии при вторичных формах туберкулеза являлось усугубление тотальной недостаточности всей цитокиновой сети (ILla, IL-8, IFNy, IL-10), через достоверное снижение синтеза TNFaj что обуславливает необходимость включения иммунотропных препаратов в схемы лечения. Однако в группе детей с распространенными, осложненными формами первичного туберкулеза на фоне терапии" возрастает уровень IL-8, IFNy, IL-10, что, вероятно, свидетельствует о сохранении воспалительного процесса и недостаточном объеме стандартной противотуберкулезной терапии.

Один? из: основных вопросов изучаемых на данном этапе изучения туберкулеза различными исследователями — это взаимодействие между собой клеточного и гуморального звеньев иммунного ответа на микобактерию туберкулеза. В результате одновременного изучения цитокинового статуса и реакций, определяющих суммарную активность гуморальных механизмов иммунитета (иммунокомплексные, цитотоксические механизмы, гиперчувствительность по 1 — 3 типу реагирования) — ЦИК, S-СОЭ, PJIJI позволило выявить у детей и подростков активацию гуморального звена иммунитета и запуск иммунокомплексных и цитотоксических механизмов противоинфекци-онной защиты при различных формах туберкулеза, независимо от объема и тяжести процесса (рис.29).

IL-la], / IL-8T.

РЛЛТ S-СОЭТ TNFa |.

IFNy| IL-10f.

Рис. 29 Взаимосвязь между реакциями лейкоцитолиза, оседания: эритроцитов в присутствии туберкулина и динамикой изменения содержания цитокинов в сыворотке крови У 73% детей с первичными формами туберкулеза и 80% с вторичными формами выявлялись положительные результаты ЦИК, S-СОЭ, PJIJI. При этом у 25% детей с первичным и 40% больных вторичным туберкулезом обнаружены одновременно положительные результаты ЦИК, S-СОЭ, PJ1JI, которые указывают на значительную активизацию гуморального звена иммунитета. Наиболее выраженное увеличение ЦИК, S-СОЭ, PJ1J1 зафиксировано при вторичных (легочных) формах туберкулеза. Полученные результаты позволили нам предположить, что высокое содержание иммунных комплексов является не только маркером блокирования механизмов клеточного иммунитета, которые вступают в конкурентные отношения с механизмами гуморального иммунитета, но и маркером активации гуморальной защитной реакции, которая временно берет на себя функции угнетенного клеточного иммунитета. Необходимо особо отметить, что при туберкулезе преобладал цитотоксический тип гиперчувствительности, который являлся определяющим в развертывании реакции S-СОЭ и PJIJI, вследствие нарушения продукции IL-1 и развития цито-кинового дисбаланса, который приводил к активации гуморальных механизмов, по второму, цитотоксическому типу гиперчувствительности. Увеличение образования иммунных комплексов, является исходом активации гуморальных механизмов противотуберкулезного иммунитета. В результате повышения образования иммунных комплексов отмечается усиление продукции макрофагами IL-10. В свою очередь, гиперпродукция IL-10 может приводить к стимуляции CD8+ Т-клеток, которые оказывают цитотоксический эффект на клетки с незавершенным фагоцитозом и высокой антигенной нагрузкой. В дальнейшем в случае продолжающегося усиления функционального дисбаланса IFNy/IL-Ю на фоне высокой антигенной нагрузки, отмечается отмена ингибирующего действия IL-10 на продукцию IL-8 на фоне угнетения продукции TNFa. В свою очередь IL-8 активирует функции нейтрофилов. Стимулированные CD8+ Т-клетки увеличивают синтез IFNy, который снижен у CD4+ Т-клеток, вследствие чего уровень цитокина в сыворотке крови продолжает расти, но все же отстает от гиперпродукции IL-10.

Уменьшение антигенной нагрузки предполагает отмену данного пути противотуберкулезной защиты. Но возможно, при наличии функциональной недостаточности фагоцитов имеет место чередование гуморальных и клеточных механизмов защиты организма от патогенна.

Уменьшение частоты выявления высокого лейкоцитолиза, скорости оседания эритроцитов в присутствии туберкулина и циркулирующих иммунных комплексов у больных туберкулезом, на фоне их лечения, позволяет оценить эффективность проводимого лечения. Сохранение высоких показателей прогнозирует торпидность течения туберкулеза и связано с развитием неадекватного иммунного ответа на фоне высокой антигенной нагрузки. Выявление положительных реакций у тубинфицированных детей, особенно на фоне гиперергической чувствительности к туберкулину свидетельствует о высоком риске развития туберкулеза. На основании полученных результатов можно сделать вывод, что иммунокомплексные процессы и цитотоксические реакции могут сопутствовать любой клинической форме и не определять тяжесть и течение туберкулезного процесса. Выявленные взаимосвязи и тенденции позволяют предполагать разные пути активации и развития гуморальных реакций на микобактерию туберкулеза. Гуморальный иммунный ответ может взаимодействовать с клеточным ответом в синергизме, конкуренции или выступать как замещающий механизм на фоне незавершенных клеточных защитных реакций. Особенности регуляции на начальных этапах активации цитокинового каскада клеточных механизмов противотуберкулезной, защитной реакции иммунной системы, и ее нарушение определяют реализацию гуморальных механизмов иммунной защиты, которые могут являться как маркерами, так и факторами развития туберкулеза во внутригрудных лимфоузлах или паренхиме легких, а также определять тяжесть и течение туберкулеза.

Изучение суммарного количества метаболитов оксида азота позволило выявить достоверное увеличение их в КВВ у 100% детей больных, туберкулезом органов дыхания, что указывало на гиперпродукцию NO при развитии туберкулеза. Учитывая, что активация клеток, в том числе макрофагов и ней-трофилов всегда сопровождается усилением синтеза N0, увеличение суммарного количества стабильных метаболитов оксида азота в КВВ указывает, на активность туберкулезного процесса. Наряду с этим регистрировалась идентичная динамика роста уровня нитрат-аниона (NO-2). Но в то же время увеличение концентрации нитрит-аниона в КВВ у больных туберкулезом, превышающую границу доверительного интервала показателей здоровых детей, зафиксировано в 75,4% случаев, что позволило нам предполагать дисбаланс в клиренсе эндогенного оксида азота. Одновременное определение нитрит-аниона и суммарного количества стабильных метаболитов оксида азота позволяет судить о степени функциональной активности клеток, вырабатывающих оксид азота.

Установлено достоверное увеличение, по сравнению со здоровыми детьми, у больных туберкулезом содержания IL-8 как сыворотке крови, так и в БАЛЖ. При этом увеличение уровня содержания IL-8 в БАЛЖ носит более выраженный характер, чем в сыворотке крови. В БАЛЖ цитокин выявлялся в 100% случаев, а в сыворотке крови у 90,2% детей. Одновременное выявление локальной гиперпродукции оксида азота, IL-8 и увеличение системного уровня этого цитокина у больных туберкулезом, позволяет сделать вывод о несомненной взаимосвязи этих показателей между собой. Динамика увеличения IL-8 в сыворотке крови и дыхательных путях у больных туберкулезом идентична.

Определение метаболитов оксида азота и IL-8 в КВВ и БАЛЖ у детей, больных туберкулезом органов дыхания перспективный, достаточно информативный метод определения активности туберкулезного процесса и состояния противоинфекционной защиты.