Экспериментальное обоснование комплексного метода адаптивной иммунотерапии злокачественных новообразований

Актуальность работы. Проблема лечения онкологических заболеваний по сей день остается актуальной для современной медицины. Традиционные методы лечения (хирургический, химио и лучевая терапия) исчерпали свои возможности и в последние годы их эффективность не увеличивается. Поэтому последние десятилетия наблюдается новый всплеск повышенного интереса к иммунотерапии злокачественных опухолей, что, по-видимому, связано со значительными успехами в области иммунологии, онкологии и молекулярной биологии, которые более глубоко раскрыли современные представления об иммунопатогенезе опухолей, механизмах канцерогенеза и регуляции опухолевого роста и подтвердили перспективность развития достаточно нового направления в терапии опухолей — биотерапии. В основе применения метода биотерапии лежит использование естественных для организма веществ или активация естественных механизмов иммунной защиты, то есть этот вид терапии является наиболее патогенетичным по сравнению с существующими традиционными способами лечения злокачественных новообразований.

Однако до настоящего времени в нашей стране получили развитие только отдельные направления этого перспективного метода. Несмотря на то, что биотерапия включает очень разные по характеру методы и подходы, одно из ведущих мест занимают методы, воздействующие на естественный противоопухолевый иммунитет с целью его активации.

В настоящее время существуют два основных направления в иммунотерапии злокачественных новообразований: первое основано на активации неспецифического звена иммунитета посредством цитотоксических лимфоцитов (ЦТЛ), натуральных киллеров (НК), активность которых может быть существенно увеличена под воздействием ИЛ-2 и интерферона, и JIAK-клеток, генерированных in vitro из лимфоцитов крови, селезенки, печени или опухолевого экссудата в присутствии ИЛ-2- второе направление-активация специфического противоопухолевого звена посредством создания лечебных и профилактических вакцин на основе дендритных клеток (ДК).

Одними из наиболее ярких представителей эффекторов неспецифического иммунитета являются ЛАК клетки. Механизм их действия состоит из прямого цитотоксического поражения аутологичных опухолевых клеток, а также их способности синтезировать и высвобождать биологические активные вещества, таких как цитокины, оказывающие регуляторное действие на другие эффекторы иммунной системы. Целесообразность применения цитокинов для иммунотерапии обусловлена эффектами, оказываемыми ими на функции клеточного иммунитета. Так ИЛ-2 усиливает цитотоксическую активность НК, расширяет спектр их цитотоксического действия, индуцирует дифференцировку цитотоксических клеток с широким спектром действия — ЛАК клеток. ЛАК в сочетании с ИЛ-2 уже достаточно продолжительное время используются в иммунотерапии злокачественных новообразований. В клинических исследованиях начальный опыт применения ИЛ2/ЛАК — терапии связан с диссеминированными формами рака (меланома, рак почки, колоректальный рак, лимфома и т. д.). В настоящее время спектр локализаций злокачественных новообразований, при которых эффективна ИЛ-2/ЛАК терапия, значительно расширен. Кроме того, на данном этапе развития биотерапии рака для монотерапии или для совместного применения с ЛАК клетками клинически и экспериментально обосновано применение низких иммуностимулирующих доз цитокинов (до 1 млн. ME), не вызывающих миелодепрессию, иммуносупрессию и других побочных эффектов.

Внедрение ИЛ-2/ЛАК — иммунотерапии в клиническую практику расширяет спектр возможностей противоопухолевого лечения. Помимо того, этот вид терапии имеет преимущества по сравнению с традиционными методами: отсутствие токсичности, хорошая переносимость лечения, возможность применения совместно с другими традиционными методами лечения, а также в случаях лекарственной резистентности, стимуляция местного противоопухолевого клеточного иммунитета, приводящая к лизису опухоли, а также улучшение качества и продолжительности жизни пациентов. По данным современной зарубежной литературы, метод ИЛ2/ЛАК — терапии является универсальным, поскольку возможно его применение практически при любых нозологических формах злокачественных новообразований (меланома, рак легкого, рак яичников, рак желудка и т. д.).

Изложенный выше метод иммунотерапии с использованием JIAK и ИЛ-2 направлен на стимуляцию неспецифического клеточного противоопухолевого иммунитета. JIAK, подобно НКклеткам, способны лизировать опухолевые клетки антиген-независимым образом и поэтому не требуют сложного этапа антигенной презентации с участием антигенпрезентрующих клеток. В месте с тем, при этом варианте иммунотерапии ЦТЛ, составляющие значительную часть лимфоидной популяции и отвечающие за специфический иммунитет, практически не реализуют своих возможностей. Для активации специфического противоопухолевого иммунитета в последнее время созданы методы получения аутовакцин на основе дендритных клеток (ДК). ДК являются особой популяцией клеток, которая обладает высокой способностью презентировать наивным Т-лимфоцитам специфические опухолевые антигены и делать их иммунными по отношению к клеткам опухоли. Кроме того, ДК способны активировать НК и Ти Вклетки памяти. ДК генерируются из периферических стволовых клеток, CD34+ предшественников костного мозга, моноцитов/макрофагов периферической крови посредством культивирования с различными цитокиновыми коктейлями. В основном для получения многочисленной популяции ДК, пригодной для клинического применения, используют колониостимулирующие факторы и ИЛ-4, хотя возможны и другие сочетания цитокинов. ДК инкубируются с опухолевыми антигенами (лизат опухолевых клеток), вводятся в организм пациента-опухоленосителя и активируют in vivo специфический противоопухолевый иммунитет. Процедура предварительного поглощения и процессинга антигена ДК, производимая ех vivo, позволяет повысить степень распознавание опухолевых клеток, характеризующихся низкой иммуногенностью, Т-лимфоцитами. Клинические испытания аутовакцин на основе ДК проводятся у больных с распространенными формами злокачественных новообразований, традиционно считающихся чувствительными к иммунотерапии (меланома, рак почки и колоректальный рак). Вместе с тем эта вакцинотерапия может быть использована и при других нозологических формах рака, например, показана ее клиническая эффективность и при раке яичников. Очевидно, что наиболее оптимально применение аутовакцин после проведения радикальной операции и стандартной химиотерпии, т. е. после максимальной циторедукции опухолевой массы. Кроме того, хирургическое вмешательство позволяет получить необходимое количество опухолевой ткани, антигены которой впоследствии будут презентированы ДК.

Наиболее перспективным направлением в развитии биотерапии опухолей следует считать сочетание методов активации специфического и неспецифического иммунитета. Иммунотерапия ЛАК — клетками (в сочетании с малыми (иммуностимулирующими) дозами цитокинов) и аутовакцинами на основе ДК должна проводиться после максимальной циторедукции с целью профилактики рецидивов заболевания и лечения резидуальной болезни. При распространенных формах злокачественных новообразований использование иммунотерапии целесообразно в тех случаях, когда возможно осуществить локальное введение активированных эффекторов иммунитета и цитокинов с целью создания действующей концентрации в области опухолевого роста. Широкое внедрение комбинированного метода ИЛ-2/ЛАК — и вакцинонотерапии в клиническую практику требует проведения экспериментальных исследований, направленных на изучение эффектов межклеточного взаимодействия вводимых эффекторов иммунитета, а таюке проведения стандартизации параметров используемых ЛАК и ДК. Кроме того, необходимо освоение достаточно сложной методики генерации активированных клеток и ДК, требующих достаточного лабораторного оснащения.

Цель и задачи исследования

.

Цель: экспериментально обосновать применение комплексного метода адоптивной иммунотерапии злокачественных новообразований, основанного на совместном применении J1AK и вакцин на основе ДК.

Для достижения данной цели были поставлены следующие задачи:

1. Разработать методику генерации JIAK из различных источников (МНК периферической крови, селезенки, опухолевого экссудата, печени) с использованием разных активаторов.

2. Изучить особенности морфологии, иммунофенотипа и функциональной активности JIAK мышей и человека на разных сроках их культивирования.

3. Исследовать морфологические, фенотипические и функциональные характеристики НКТклеток печени.

4. Оценить возможность генерации ЛАК из НКТ печени и изучить их морфофункциональные параметры.

4. Оптимизировать методики вьщеления и культивирования ДК мышей и человека из различных источников с использованием активаторов разного типа.

5. Провести сравнительную характеристику морфофункциональных и иммунофенотипических особенностей ДК различной степени зрелости.

6. Изучить эффективность противоопухолевого действия ЛАК и ДК при их совместном применении в опытах in vitro.

7. Провести экспериментальное обоснование комбинированного применения ДК и ЛАК в опытах на мышах с привитой опухолью СаО-1.

8. Разработать параметры стандартизации ЛАК и ДК человека для клинического применения в области иммунотерапии злокачественных новообразований.

Научная новизна.

В результате проведенной работы:

— впервые проведен детальный анализ морфофункциональных и иммунофенотипических характеристик ЛАК клеток, полученных из различных источников (МНК периферической крови, селезенки, опухолевого экссудата, печени) посредством использования разных активаторов (ИЛ-2, ФГА, МП-2);

— впервые исследованы морфологические, функциональные и фенотипические особенности НКТклеток печени, а также возможность генерации из них ЛАК с последующим изучением их характеристик;

— впервые проведено сравнительное исследование эффективности комбинированного противоопухолевого действия ДК и ЛАК.

Получены новые данные:

— относительно иммунофенотипических особенностей ДК мышей и человека на различных этапах из созревания и дифференцировки;

— об особенностях цитологического профиля ЛАК и ДК;

— о цитотоксической и НК — активности ЛАК клеток различного происхождения на разных этапах их культивирования при исследовании 4-х соотношений клеток-мишеней/эффекторов (1:0,5- 1:1- 1:2- 1:5).

Уточнены данные:

— относительно оптимальных сроков культивирования ДК мышей и человека для получения популяции зрелых ДК, используемых в целях иммунотерапии и иммунопрофилактики злокачественных новообразований;

— относительно сроков генерации ЛАК, используемых для проведения адоптивной иммунотерапии злокачественных новообразований.

Научно-практическая значимость.

Научная значимость настоящей работы заключается:

1. В изучении механизмов активации мононуклеарных клеток периферической крови, селезенки, опухолевого экссудата и печени.

2. В изучении механизмов взаимодействия активированных клеток с ДК различной степени зрелости и дифференцировки.

3. В выявлении закономерностей, причин и сроков активации моноцитов/макрофагов периферической крови, селезенки, экссудата, печени.

4. В создании концепции о взаимосвязи и взаимодействии специфических и неспецифических факторов иммунитета в противоопухолевой защите организма.

Практическая значимость работы заключается:

1. В экспериментальном обосновании целесообразности комбинированного применения ЛАК и ДК для целей биотерапии рака.

2. В предложении основных морфофункциональные и иммунофенотипических параметров ЛАК и ДК человека, которые могут быть использованы для стандартизации методов иммунотерапии и иммунопрофилактики злокачественных новообразований.

3. В обосновании использования для оценки противоопухолевой активности мышиных ЛАК НК — чувствительную клеточную линию эритробластного лейкоза человека К-562.

4. В выявлении новых активаторов, используемых для получения.

ЛАК.

Положения, выносимые на защиту:

1. ЛАК могут быть получены из различных источников с использованием активаторов разной природы и обладают характерными особенностями морфологии, иммунофенотипа и функциональной активности.

2. Из пораженной опухолевым процессом печени может быть выделена особая субпопуляция лимфоцитов — НКТклетки, экспрессирующая на своей поверхности маркеры Т и НК клеток. Из НКТклеток могут быть получены ЛАК, которые по своей противоопухолевой активности превосходят ЛАК, генерированные из МНК крови.

3. Зрелые ДК обладают антигенпрезентирующей активностью и способны инициировать специфический противоопухолевый ответ.

4. Совместное использование вакцин на основе ДК и ЛАК характеризуется эффектом синергизма и позволяет повысить эффективность противоопухолевой терапии.

Публикации.

По теме диссертации опубликовано 13 работ, в том числе 5 статей в центральной печати и 8 тезисов в материалах международных конференций и съездов.

1. Обзор литературы.

5. Выводы.

1) Разработана методика получения ЛАК из различных источников (МНК периферической крови, селезенки, опухолевого экссудата, печени) с использованием разных активаторов (ИЛ-2, ФГА, МП-2).

2) ЛАК обладают рядом морфологических особенностей (наличие лимфоидных элементов различной степени зрелости, крупных активированных лимфоцитов типа пролимфоцитов и иммунобластов). Фенотипически ЛАК представляют собой клетки с повышенной экспрессией активационных антигенов CD38 и HLA-DR и молекулы адгезии CD58 и снижением экспрессии дифференцировочных антигенов (CD3, CD4 CD8). НК — активность ЛАК находится в диапазоне от 31,7±8,4% до 100% (при соотношении клеток-мишеней и эффекторов 1:5). ЛАК обладают способностью к продукции основных регуляторных цитокинов (ИЛ-8, ФНО-а, ИЛ-ip).

3) НКТ-клетки выделяются из параметастатических участков печени, обладают высокой спонтанной НК — активностью — гибель 90% опухолевых клеток — и могут быть охарактеризованы как активированные лимфоциты типа иммунобластов. Они экспрессируют на своей поверхности маркеры Т лимфоцитов, маркер НК — клеток CD16 (15−34%) и молекулы адгезии CD57, CD58 (порядка 4050%). Из НКТ клеток посредством ИЛ-2 могут быть генерированы ЛАК с более высоким уровнем экспрессии активационных антигенов CD38 и HLA-DR и цитотоксической активности, чем ЛАК, полученные из МНПК.

4) Оптимизированы методики выделения и культивирования ДК мышей и человека из различных источников (костный мозг, селезенка, МНК периферической крови) с использованием активаторов разного типа (ИЛ-4, ГМ-КСФ, ФНО-а, ЛПС различного происхождения).

5) Особенностями субпопуляции незрелых ДК являются большие размеры клеток, многочисленные вуалевидные отростки, эксцентрично расположенное ядро и вакуолизация цитоплазмы наряду со сниженной способностью к спонтанной продукции цитокинов (ИЛ-8, ИЛ-ip и ФНО-а) и незначительным уровнем экспрессии молекул адгезии, костимуляции и антигенного представления.

6) Особенностью зрелых ДК является их способность к спонтанной продукции основных регуляторных цитокинов (ИЛ-8, ИЛ-1Р и ФНО-а) и высокие уровни экспрессии рецепторов антигенного представления, костимуляции и адгезии.

7) В опытах in vitro и in vivo показана противоопухолевая активность ДК — вакцин и ЛАК. Наиболее эффективным является их комбинированное применение.

8) Предложены параметры стандартизации ЛАК и ДК для клинического применения.

Практические рекомендации.

Согласно полученным экспериментальным данным комбинированное применение вакцин на основе ДК и ЛАК может быть рекомендовано для применения в онкологической практике с целью иммунотерапии и иммунопрофилактики злокачественных новообразований.