Механизмы регенерации спинного мозга крыс при трансплантации обкладочных нейроэпителиальных клеток в биополимерном коллагеновом матриксе

Огромные масштабы травматизма позволяют рассматривать его в числе наиболее актуальных медико-социальных проблем. По данным Всемирной Организации Здравоохранения, ежегодно в странах Евросоюза, Азии и Северной Америки травмы занимают третье место среди причин смерти, после сердечно — сосудистых и онкологических заболеваний, и лидируют I среди причин ухода из жизни в молодом возрасте. Повреждения позвоночника и спинного мозга составляют около 4% в общей структуре всех травм [49]. Между тем, эта патология кроме высокой летальности, I которая по различным данным колеблется от 16 до 64% пострадавших, сопровождается практически полной, глубокой инвалидизацией больных, что влечёт тяжелые социально-экономические последствия. Только в Российской I.

Федерации ежегодно по этой причине более 8000 человек становятся i инвалидами в наиболее трудоспособном возрасте (18 — 45 лет) [45]. Естественно, число травмированных намного больше, чем количество получивших инвалидность. I.

В оценке реабилитационного потенциала пациентов-инвалидов с позвоночно-спинномозговой травмой (ПСМТ) до настоящего времени преобладают весьма пессимистические взгляды. Причина скепсиса связанна с традиционными представлениями (Ramon у Cajal S., 1928) об ограниченных возможностях нервной ткани к регенерации [152]. Именно по этой причине клиницистами и нейробиологами неоднократно предпринимались попытки стимулировать процессы регенерации нервной ткани с помощью имплантации в зону перерыва спинного мозга различных экзогенных материалов — фрагментов дегенерирующего периферического нерва, участков вегетативных и спинальных ганглиев, выращенных в искусственных условиях нервных и глиальных клеток [18, 27, 40, 184]. Но, несмотря на значительные успехи в экспериментальной нейротранспланталогии, проблема успешного восполнения функциональных дефектов нервной ткани до конца XX века считалась практически не 1 решаемой. Основные трудности здесь были связаны с несоответствием темпов и характера формирующейся на месте повреждения рубцовой ткани, а также невозможностью терапевтического влияния на активность эндогенной системы роста и функционального восстановления поврежденных нервных волокон [34, 148, 149]. Главные достижения в этой области связаны с появлением современных биополимерных материалов, создающих оптимальные условия для выживания и дифференцировки различных линий стволовых клеток в культуре, а также для реализации их I нейрорепаративного потенциала зоне трансплантации [9, 116]. I.

Современная идеология экспериментальной и клинической нейротрансплантологии базируется на двух основных подходах, использующих в заместительных целях либо биокомпозитные материалы (формирующие своеобразный тканевой протез, обеспечивающие быструю консолидацию разобщенных участков нервной ткани и создающие оптимальную среду для облегчения роста аксонов), либо трансплантацию различных клеточных линий выполняющих нейротрофическую, а возможно, и пластическую роль в очаге повреждения [68]. Совершенствование и широкое клиническое внедрение этих методов нуждается в детальном исследовании фундаментальных механизмов развития патологических и компенсаторно-восстановительных процессов, а также — в поиске новых источников клеток для трансплантации и наиболее оптимальном пути их использования.

Обкладочные нейроэпительнльные клетки (ОНК) в настоящее время рассматриваются как наиболее перспективный объект клеточной терапии посттравматических и демиелинизирующих заболеваний центральной нервной системы [53, 59, 120, 121, 151, 123, 138]. Это связано с простотой их получения, иммунологической безопасностью при аутотрансплантации и предположительно низкой способностью к онкогенной трансформации. В условиях культивирования, при создании соответствующей пространственной информации, они оказываются весьма жизнеспособными, активно пролиферируют и способны дифференцироваться в направлении нейронов и глиальных клеток, а при совместном культивировании с нервными клетками — участвуют в миелинизации их аксонов. Несмотря на доказанную эффективность трансплантации ОНК при различных неврологических заболеваниях и экспериментальных повреждениях нервной системы, многие механизмы их участия в процессах регенерации остаются невыясненными. До настоящего времени не решен вопрос о функциональной интеграции ОНК с тканями реципиента, их способности реконструировать трехмерную архитектуру нервной ткани, управлять процессами направленного роста поврежденных аксонов и обеспечивать их успешную миелинизацию. Нуждается в дальнейшем совершенствовании технология их выращивания, направленной дифференцировки и трансплантации в составе тканевых нейропротезов.

Разработкой и изучением свойств пригодных для трансплантации биополимерных матриксов занимаются в настоящее время ведущие лаборатории мира. Предложены нейроматриксы «NeuroGel» (IMITE, Швейцария) — «RMx» (Total ReCord, США) и др. Используемый в настоящем исследовании биополимерный деградируемый нейроматрикс «СфероГель-Э» — полностью Российская разработка. В ходе его предварительных испытаний I было показано, что матрикс способствует более быстрому формированию нейропротезирующей ткани между пересечёнными концами спинного мозга I и препятствует образованию глиомезодермального рубца, ограничивающего регенерацию аксонов спинномозговых трактов [9, 40]. Однако недостаточно I изученными остаются механизмы, лежащие в основе его консолидирующей роли, а также возможность использования матрикса в качестве трансплантационной среды для ОНК, способной обеспечивать их выживание и направленную дифференцировку.

Цель настоящей работы: Установить особенности и механизмы восстановления поврежденного спинного мозга крыс при замещении тканевого дефекта биополимерным матриксом с культурой обкладочных нейроэпительнальных клеток.

Задачи исследования:

1. Дать иммуноцитохимическую характеристику культуры обонятельных нейроэпителиальных клеток, используемых для трансплантации.

2. Оценить характер морфологических изменений тканей спинного мозга в раннем и позднем периоде травмы при нейротрансплантации.

3. Изучить особенности регенерации нервных волокон в тканях спинного мозга экспериментальных животных.

4. Выявить особенности экспрессии и иммуноцитохимического распределения маркеров аксонального роста в спинном мозге экспериментальных животных на этапах реабилитации.

5. Охарактеризовать динамику восстановления двигательных функций спинного мозга при травме и заместительной клеточной терапии.

выводы.

1. Биополимерный гетерогенный коллагеновый матрикс представляет собой среду, оптимальную для выживания и дифференцировки обкладочных нейроэпителиальных клеток в нейрональном и нейроглиальном направлениях. При культивировании на матриксе ОНК формируют три морфологически неоднородных популяции и экспрессируют маркеры, характерные для незрелой нервной ткани (виментин, нестин), дифференцированных глиальных (ОБАР, белок 8100 и Р75) и нервных клеток (тубулин).

2. Применение коллагенового матрикса при монотерапии, а также в комплексе с полимерной спинномозговой оболочкой (группы «гель» и «гель+оболочка») способствует консолидации посттравматического дефекта в более ранние сроки. Преобладание в составе протезирующей ткани соединительнотканных элементов препятствует образованию глиальной демаркационной линии, формированию сирингомиелических кист, модулирует течение воспалительных процессов и создает благоприятные условия для роста кровеносных сосудов.

3. Замещение дефекта спинного мозга биополимерным гетерогенным коллагеновым матриксом с культурой обкладочных нейроэпителиальных клеток (группа «гель+клетки») стимулирует процессы регенерации и ремиелинизации нервных проводников в области травмы и способствует сохранению структуры проводникового аппарата каудальных сегментов спинного мозга.

4. Высокая иммуноцитохимическая активность маркеров аксоногенеза (ОАР-43 и № 200) в тканях рубца у животных группы «гель+клетки» свидетельствует о реализации нейротрофического эффекта обкладочных нейроэпителиальных клеток в зоне трансплантации.

5. Восстановление утраченных при травме спинного мозга неврологических функций наиболее эффективно происходит у животных группы «гель+клетки» и проявляется улучшением локомоторной активности вплоть до появления способности к самостоятельному передвижению.

Заключение

.

В настоящей работе мы предприняли попытку изучить особенности и механизмы восстановления поврежденного спинного мозга крыс при замещении тканевого дефекта композицией из биополимерного нейроматрикса и культуры обкладочных нейроэпительнальных клеток. Анализируя полученные результаты, мы считаем необходимым обсудить следующие затронутые в нашей работе проблемы:

1. Адекватность используемого оперативного вмешательства для исследования механизмов восстановительного процесса в тканях спинного I мозга при нейротрансплантации;

2. Выбор и преимущества биодеградируемого гетерогенного нейроматрикса «Сферогель-Э» перед другими наполнителями;

3. Роль и механизмы реализации нейрорепаративного эффекта обкладочных нейроэпителиальных клеток;

4. Визуальные проявления динамики восстановительного процесса у животных, перенесших тяжелую спинальную травму.

В своих экспериментах мы использовали модель травмы, создающую ситуацию полного анатомического перерыва спинного мозга, путем I иссечения его фрагмента толщиной 2−3 мм. Мы считаем, что подобный подход имеет ряд преимуществ. Во-первых, данные, полученные на I моделях с полной экстирпацией фрагмента спинного мозга, представляют большую научно-практическую ценность, поскольку, в создаваемых экспериментальных условиях полностью исключается возможность произвольного, частичного самовосстановления и компенсации некоторых неврологических функций, что нередко наблюдается при неполном анатомическом перерыве спинного мозга [29]. В последнем случае морфо-функциональная регенерация происходит за счет тканей мозговых оболочек, волокон задних корешков и спинальных первично-чувствительных ганглиев, а также нейронов, глиоцитов и волокон противоположной к месту травмы стороны [18]. Сохранная структура спинномозгового канала, изолирующая ликвор от токсического влияния на нервную ткань, может также обеспечивать лучшее выживание и более успешное функциональное восстановление у животных с частичным повреждением спинного мозга [24]. В этой связи использованная в наших экспериментах торакальная сегментэктомия исключает интерпретацию любого из полученных результатов как закономерного (и ожидаемого) в случае частичного повреждения. Именно указанные обстоятельства, при использовании моделей с частичным повреждением спинного мозга, послужили поводом для безосновательного скепсиса некоторых нейробиологов и клиницистов в отношении возможностей клеточной трансплантологии [185].

Во-вторых, именно сегментэктомия по своим патогенетически механизмам, комплексу осложнений и прогнозу наиболее близка к тяжелой ПСМТ сопровождающейся полным перерывом спинного мозга у человека [24, 31, 51]. Подобная травма клинически очень демонстративна, поскольку тяжесть вегетативных и соматических расстройств в этом случае определяется уровнем повреждения спинного мозга. Кроме того, экспериментальная травма спинного мозга с полным анатомическим перерывом является идеальной моделью, в той или иной степени имитирующей практически любую неврологическую катастрофу: инсульт, миелопатию, острое воспалительное или демиелинизирующее заболевание. Эта общность обусловлена стереотипным каскадом реализации общепатологических алгоритмов (ишемия, некроз, апоптоз, воспаление, демиелинизация, перекисное окисление липидов, нейромедиаторная токсичность), которые в итоге определяют объем неврологического ущерба при любой патологии нервной системы [1, 51, 58]. Изучение процессов регенерации нервной ткани на уровне спинного мозга позволяет сравнивать функцию передних и задних конечностей у экспериментального животного, что при использовании стандартизованных международных шкал (ВВВ, ASIA) позволяет объективно оценить полученные результаты.

Использованная в нашей работе ситуация полного анатомического перерыва спинного мозга характеризовалась исключительной тяжестью течения и наличием большого числа осложнений. Прооперированные животные получали глюкокортикостероиды (дексаметазон), растворы глюкозы, антихолинэстеразные — препараты (прозерин), антибиотики I фторхиналонового ряда, содержались в условиях полностью исключающих, сколько либо значительное колебание температур, однако даже в этих условиях смертность достигала 30%. В итоге, не у одного из выживших животных контрольной группы не произошло самопроизвольного восстановления утраченных вследствие травмы неврологических функций.

Следует отметить, что отсутствие самопроизвольного восстановления утраченных двигательных и тазовых функций встречается ещё в работах Рамона Кахаля, в итоге прекратившего эксперименты с полной перерезкой спинного мозга, осознав сложность борьбы с огромным числом неподдающихся учету осложнений [152]. Аналогичные результаты были получены в работах многих российских [18, 32, 40, 44] и зарубежных [149,.

185] исследователей. Американский нейрохирург Л. Фримен (1955) прооперировал на протяжении ряда лет более двух тысяч крыс, и в его исследованиях описываются только единичные случаи некоторого I улучшение двигательных функций [184]. Вайс Янг, анализируя все I экспериментальные модели спинальной травмы, вообще исключает любую возможность произвольного восстановления двигательных функций после сегментэктоми по методу Уорли [185]. Вместе с тем, указывая на ничтожную вероятность самовосстановления, традиционно говорится о необходимости хорошей предоперационной подготовки, бережного отношения к тканям во время операции и качественного послеоперационного ухода с адекватной I состоянию животного фармакотерапией, что и было в точности выдержано в нашем эксперименте.

Безусловно, облегчение боли, нейропротективная, сосудистая и симптоматическая фармакотерапия являются обязательными условиями коррекции неврологического дефицита при спинальной травме [42]. Однако главным лимитирующим фактором на пути к клинически ценному I восстановлению неврологических функций у спинальных больных является посттравматический рубец и «пустые» пространства, формирующиеся в локусах обширного некроза нервной ткани, которые необходимо преодолеть растущим аксонам для установления утраченных связей [27]. В этой связи глио-мезодермальному рубцу, заполняющему дефект нервной ткани, всегда отводилась основная лимитирующая роль в процессах аксоногенеза. С I другой стороны, при отсутствии консолидирующей ткани рубца между краниальным и каудальным отрезками спинного мозга, они подвергаются ретракции, а пустые пространства заполняются ликвором с образованием сирингомиелитических кист, что делает восстановление нервных связей попросту невозможным [18]. Поэтому одной из наиболее важных задач тканевой инженерии при травмах спинного мозга является получение возможности управления скоростью и качеством образующейся ткани, замещающего нейрональный дефект. Предпринятые к настоящему времени попытки решения этого вопроса фармакологическими' и микрохирургическими методами к решению проблемы не привели. I.

Применение имплантируемых и системно действующих нейрональных I модуляторов, нейротрендов и микропроцессорных стимуляторов («ЗотоАэг Бапек», «Соёшап») для избирательного воздействия на зону травмы имели определённый успех, но также не оправдали в полной мере возлагаемых надежд [9]. В конце 80-х годов XX века для получения наделённой особыми свойствами «ткани — моста», замещающей посттравматический дефект спинного мозга, было предложено использовать биополимерные материалы, что позволило братьям Ваканти впервые, в 1999 году впервые осуществить реконструкция полного анатомического перерыва спинного мозга [181]. Тип используемого материала при создании подобной конструкции и по сей день является одним из самых дискутабельных вопросов тканевой инженерии [9]. «Идеальный» материал еще не > открыт, однако на сегодняшний день.

I '.

89 большинством современных нейробиоинженерных корпораций: Total ReCord (США) — IMITE (Швейцария) предложены и запатентованы собственные биополимерные среды предоставляющие возможность получения качественной ткани, восполняющей нейрональный дефект.

Биополимерный нейроматрикс «Сферогель—Э» — это полностью Российская разработка. Производство и хранение нейроматрикса не связанно с такими фантастическими затратами, как у американского или швейцарского аналогов. Об эффективности использования Сферогеля в нашем эксперименте наглядно свидетельствуют результаты, полученные у крыс групп «гель» и «гель+оболочка», где сращение отрезков спинного мозга протекало весьма успешно и в более ранние сроки. Консолидирующая ткань «моста — нейропротеза» у этих животных формировалась быстрее и отличалась хорошей васкуляризацией. Регенерирующие нервные волокна были здесь более многочисленными, их миелинизация происходила значительно быстрее, волокна прорастали пучками, а не поодиночке, как у контрольных животныхпри этом область пустот также была выражена значительно меньше, чем в контрольной группе. По нашему мнению, скорейшей и полноценной в морфологическом и функциональном смысле I консолидации посттравматического дефекта у этих крыс, является три I группы факторов:

Во-первых, для успешной регенерации нервных проводников и восстановления утраченных неврологических функций важно, чтобы ткань, протезирующая спинальный диастаз, обладала определёнными свойствами. Филогенетически образование рубцовой ткани является логическим завершением всего хода любой травматической или воспалительной реакции, поэтому биологический смысл её появления заключается в скорейшем закрытии очага повреждения и изоляции его от агрессивного влияния факторов внешней среды. В силу необходимости, помимо мезенхимального (фибробластного) компонента, в образовании рубца участвуют клеточные элементы той ткани, в которой эта реакция протекает, в данном случае глиальные элементы, преимущественно, астроциты [28, 54, 109]. Очевидно, что управление качеством образования протезирующей посттравматический дефект «ткани — моста» осуществимо только при создании соответствующего баланса цитоархитектоники этих двух компонентов, при этом в идеале ¡-такая ткань должна быть получена в исключительно сжатые сроки, что позволит избежать травматических перестроек и ретракции спинномозговых фрагментов. В нашем эксперименте при гистологическом исследовании спинного мозга выявлялись существенные различия в тканевом составе и сроках формирования рубца у животных из разных групп. У крыс всех экспериментальных групп рубцовая ткань начинала формироваться в более ранние сроки (конец 2 недели), тогда как у контрольных животных в эти 1 сроки полость дефекта СМ еще была занята фибриновыми массами. Спинномозговой рубец у животных контрольной группы был отчетливо сформирован лишь к 10 неделе эксперимента. Зона тканевого дефекта в этом случае была заполнена глио-мезодермальной тканью, имеющей четкую демаркационную границу с прилежащими участками мозга.

Таким образом, терапия препаратом Сферогель позволяет сформировать рубцовую ткань, создающую «мост» между ростральным и каудальным фрагментами спинного мозга, в более ранние сроки.

Во-вторых, в нейроматриксе содержится набор нейротрофичёских агентов (фактор роста сосудов, фактор роста нервов, фактор миграции фибробластов), действие которых создает в области трансплантации I идеальные условия для прорастания сосудов и регенерации нервных проводников. В нашем эксперименте у животных группы «гель+клетки» к 10 неделе рубец был полностью сформирован тканью, где, наряду с развитой астроцитарной глией, присутствовали также элементы соединительной ткани — фибробласты, пучки соединительнотканных волокон и многочисленные новообразованные микрососуды. Это свидетельствует о более раннем начале ангиогенеза и, следовательно, лучшей оксигенации рубца. Отличительной особенностью данного способа реконструкции нервной ткани является обилие нервных волокон, сопровождающих прослойки ткани в области сформированного рубца.

Предпосылки к такого рода морфологическому эффекту наблюдались уже на раннем этапе эксперимента. Так, у всех животных с имплантируемым гелем уже через 1−2 недели после операции, обращала на себя внимание иная архитектоника пролиферирующих астроцитов, которые выстраиваются в виде длинных клеточных тяжей, направленных параллельно длиннику спинного мозга как внутри рубца, так и в пограничной зоне. В то же время астроцитарная реакция в контрольных образцах, протекала, 1 преимущественно, в поперечном направлении что, очевидно, служило препятствием для развития соединительнотканных элементов и дальнейшего I роста нервных волокон. — у.

В целом, как демонстрируют наши гистологические препараты, использование «Сферогеля» совместно с ОНК или без них, позволяет достаточно быстро сформировать более качественную протезирующую ткань между каудальным и краниальным отрезками спинного мозга, что не только позволяет избежать их ретракции, образования глиальной демаркационной линии, но и создает более благоприятные условия для регенерации аксонов.

Наконец, биополимерная структура Сферогеля, выполняя опорную и зашитую функции в отношении регенерирующих нервных проводников, позволяет избежать их «спраутинга», делая возможным их направленный рост и достижение пункта назначения. Именно поэтому целенаправленная двигательная активность у животных в группах «Гель» и «Гель+оболочка» -в среднем 10 баллов по шкале «ВВВ» — существенно превосходила подобные показатели контрольной группы, где наивысшая оценка по той же шкале не превышала 5 баллов. Важно подчеркнуть, что близкие результаты были получены С. Уорли при использовании аналогичного по структуре нейроматрикса «ЫеигоОе!» [141]. В его исследованиях также было достигнуто восстановление структурной целостности спинного мозга после торакальной сегментэктомии без формирования грубого морфологического дефекта. Уорли убежден, что через определённое время имплантируемый биополимер замещается собственньши клеточными элементами и нервными j, волокнами [141]. Эту точку разделяет Джерри Райзман, получивший еще более убедительные результаты при реконструкции области травмы с помощью гидрогелевого биополимера и культуры ОНК [148, 149, 150]. I.

Кроме того, полная реконструкция области повреждения спинного мозга к i концу второго месяца эксперимента при использовании данной технологии достигнута в работах Y. Li [120, 121, 122]. Об успешности завершенности процессов аксоногенеза при использовании ОНК свидетельствуют также работы L. Ramer, (2004) показавшего наличие отчетливых синаптофизинj позитивных гранул на телах и проксимальных дендритах мотонейронов люмбального сегмента спинного мозга [151]. I.

Безусловно, современные биополимеры ещё далеки от совершенства.

Ведутся интенсивные работы по созданию на основе «Сферогеля-Э» | нейроматрикса принципиально нового типа. По мнению чешского исследователя Евы Жуковой, одним из способов совершенствования стратегии лечения полных перерывов спинного мозга с помощью биополимерного геля является добавление в его состав клеток, которые: 1) потенциально способны к встраиванию в структуру поврежденной ткани и 2) способны секретировать в течение длительного времени необходимый набор трофических и нейромодуляторных факторов [68]. В идеале такой нейроматрикс должен быть снабжен определенным набором «векторов» факторов дифференцировки j и нейротрофического действия, 1 обеспечивающих направленное деление и развитие стволовых (или малодифференцированных) клеток. Он должен также оказывать модулирующее влияние на эндогенные нейральные стволовые клетки, которые, как известно, располагаются «по берегам» центрального канала спинного мозга, но обладают I очень ограниченным репаративным потенциалом [50]. Их пролиферативного ресурса хватает для компенсации нейрональных потерь, возникающих при небольших повреждениях ЦНС преходящие нарушения мозгового кровообращения (транзиторные ишемические атаки, гипертонические кризы), сотрясения и ушибы головного и спинного мозга легкой и средней степени тяжести. Однако при обширных повреждениях ЦНС, к числу которых относится ПСМТ, их пролиферативные возможности оказываются недостаточными для компенсации неврологического дефицита и образования новых, функционально активных синаптических связей.

Известно, что главным препятствием для активной клеточной пролиферации, дифференцировки и направленного роста новообразованных нервных волокон является группа факторов-репеллентов (белок пс^о, сульфатированные гликозоаминопротеогликаны), источником которых становятся фрагменты размозженной нервной ткани и компоненты межклеточного матрикса [136, 142]. В этом разрезе одним из путей совершенствования биополимерных нейрокомпозитов считается использование компонентов, не только ингибирующих апоптоз и избыточную астроцитарно-микроглиальную реакцию, но и факторов, нейтрализующих эффекты репеллентов. Возможный механизм реализации такого действия связан с созданием особого типа нанокапсул с детерминированным сроком динамического высвобождения заключенных в них нейроактивных веществ. Гипотетически подобная структура способна выполнять в поврежденной нервной ткани тройственную роль — тканевого нейропротеза, вектора дифференцировки и нейропротективного агента.

Одним из ключевых компонентов реализации нейротрофической стратегии нейроматриксов служит включение в их состав некоторых клеточных компонентов. В нашем эксперименте используются обкладочные нейроэпителиальные клетки, что продиктовано огромным вниманием к ним как наиболее подходящему трансплантационному материалу для лечения неврологической патологии [70, 109, 120, 121, 123, 144, 148, 151]. В литературе нет точных данных о том, кто впервые описал ОНК. Первые шаги по изучению клеточной биологии структур обонятельного нейроэпителия предприняты Y. Nagahara еще в 1940 году, и именно с этого момента стали звучать предложения использовать ОНК-содержащие трансплантаты для лечения неврологической патологии [134]. В полной мере эта задача впервые была реализована в работах F.J.Roisen, (2001) а позднее X. Zhang, (2004), сумевших выделить культуру ОНК с высокой степенью чистоты [53, 55]. Именно вопрос чистоты клеточного материала, полученного из слизистой оболочки верхней носовой раковины является в настоящее время наиболее принципиальным, поскольку определяет понимание механизмов репарационного действия трансплантата. Поскольку ведущей причиной развития тяжелого неврологического дефицита у спинальных больных является утрата нервными проводниками миелиновой оболочки, то способность инициировать рост и ремиелинизацию повреждённых аксонов является одним из главных требований к трансплантируемой культуре. В естественных условиях ОНК не миелинизируют аксоны, однако, они приобретают такую способность, будучи трансплантированы в зону травмы. Предпринимались попытки объяснить подобные наблюдения низкой чистотой культур ОНК, которые могли быть «загрязнены» Швановскими клетками [61, 153, 180]. По его мнению, J. Boyd (2005) для идентификации ОНК традиционно используются антитела к белку — рецептору Р75 наличие которого также свойственно Швановским клеткам [70]. «В целях установления истины» Boyd J.G. предложил в обязательном порядке тестировавать культуру планируемую для трансплантации на содержание кальпоина, позволяющего отличить ОНК от Швановских клеток. Эти выводы весьма дискутабельны, поскольку имеются весьма достоверные данные (С. Ibanez, 2007), что кальпонин локализуется в фибронектин-позитивных фибробластах, также получаемых из пунктата обонятельного эпителия и оболочечных клеток обонятельной луковицы [74]. Таким образом, кальпонин не может служить для различия между ОНК и Швановскими клетками [75]. Вместе с тем очевидно прямое генетическое сродство ОНК к Швановским клеткам, равно как и к другим глиоцитам. Эта проявляется как в единой регуляции их активности через систему нейрогелинов, так и в единстве ряда белков цитоскилета [8]. По мнению R. Thompson, (2000) специфическим маркером Швановских является HNK-1 белок-рецептор [82]. Кроме того, ОНК на протяжении всего клеточного цикла экспрессируют нестин и виментин [31]. По мнению A. Vincent, (2005) именно этой способностью ОНК наиболее радикально отличаются как от Шванновских клеток, так и от фибробластов [102].

В наших экспериментах, клетки, культивируемые на Сферогеле, формировали монослой, в котором большая часть клеток (>90%) окрашивалась антителами к нестину. Кроме того, часть клеток уже очевидно получивших программу развития и «движущаяся» в направлении нейронов окрашивались антителами к (3-тубулину. Часть клеток интенсивно окрашивалась антителами к GFAP и Р75. Мы не производили типирование этого материала с использованием маркера Швановских клеток HNK-1. Однако клетки этого ряда активно окрашивались антителами к нестину и виментину, что позволяет достоверно утверждать, что это ОНК получившие программу развития, и «движущиеся» в глиальном направлении.

В нашем эксперименте при культивировании ОНК образовывали три различные морфологические формы — биполярную, мультиполярную и форму, называемую некоторыми авторами «яичница—глазунья». До настоящего времени нет четких представлений о том, являются ли эти три морфологические группы клеток терминально дифференцированными типами ОНК или они способны превращаться друг в друга по мере необходимости. Не исключено, что количественное соотношение этих клеток в месте трансплантации диктуется условиями пространственного микроокружения и определяет, в конечном итоге, более эффективную нейрорегенерацию по сравнению со Шванновскими трансплантатами. Так, в экспериментах Y. Li, (1998) доказаны существенные различия репаративного действия ОНК и ШК, проявляемые как в скорости миграции к месту травмы, так и способе миелинизации. Шванновские клетки оставались в месте трансплантации, а ОНК мигрировали вдоль белого вещества спинного мозга, первоначально увлекая аксоны за собой, а затем оставались на месте, пропуская растущие аксоны вперед. В другом эксперименте (Ramon С. A., et al., 1998) использовался трансплантат из Шванновских клеток в сочетании с ОНК, которые мигрировали, увлекая аксоны в дистальный отрезок спинного мозга, в результате чего аксоны регенерировали на длинные расстояния (до 1,5−2,5 см) и восстанавливали двигательные и чувствительные функции. В этом эксперименте меченные ОНК также обнаруживались в белом и сером веществе спинного мозга на 1,5 см от зоны трансплантации, в то время как смещение промаркированных ШК не превышало 800мкм.

Другим принципиальным отличием ОНК от ШК является способность образовывать комплексы с астроглией, изменяющие морфологию и динамику глиальной реакции в месте формирования рубца [151]. В то время как образующиеся в месте травмы комплексы Шванновских и астроглиальных клеток способствуют уплотнению рубца и стимулируют высвобождение про-воспалительных и анти-ростовых факторов, то комплексы ОНК с астроцитарной глией, напротив, усиливают пропускную способность глио-мезодермального рубца. Так, по мнению Джерри Райзмана (2003) в местах соприкосновения клеточных поверхностей ОНК и астроцитов, последние изменяют свою конфигурацию таким образом, чтобы их активные поверхности, были обращены в сторону мозговых оболочек [148, 149], что порождает эффект, названный Y. Li (1998) «открыванием дверей в нервную систему» [120, 121, 122]. Он проявляется в способности глиального рубца путем образования особых «каналов» пропустить мигрирующие ОНК влекущие за собой аксоны.

Полученные в настоящей работе результаты дополняют известные факты о «поведении» обкладочных нейроглиальных элементов обонятельного эпителия в культуре и при трансплантации. В условиях культивирования они образуют нейросферы, а при высвобождении из них и образовании монослоя способны дифференцироваться в клетки с морфологическими и биохимическими характеристиками нейронов и глиоцитов. Около 38% культивированных в нашей работе клеток экспрессировали ОБ АР — структурный белок, наиболее типичный для астроцитарной глии. Учитывая, что комплексы астроцитов с ОНК обладают особыми свойствами, индуцирующими направленный рост аксонов [121], мы считаем, что образование клеток, морфологически и биохимически похожих на астроциты, может служить фактором, благоприятствующим их репаративной активности в условиях дальнейшей нейротрансплантации.

Остальные клетки экспрессировали маркеры, наиболее типичные для олигодендроглиоцитов и клеток, подобных Шванновским — Р75, 8100, ОБ АР. Эти свойства позволяют предполагать их прямое или опосредованное участие в образовании миелиновой оболочки на регенерирующих аксонах. На это указывают результаты проведенного нами морфологического и иммуноцитохимического анализа срезов спинного мозга животных из группы «гель+клетки» а также оценка динамики восстановления двигательной функции у экспериментальных животных этой группы.

Действительно, число морфологически сохранных нервных волокон, имеющих миелиновую оболочку, доминировало у животных группы «гель+клетки», где они группировались в пучки, сопровождающие кровеносные сосуды. На срезах каудального отдела спинного мозга (Ь4) у животных группы «гель» и «гель+оболочка» явления дегенерации аксонов были менее выражены, особенно в тех областях, которые принадлежат нисходящим трактам — вентромедиальные сегменты задних канатиков и дорсо-латеральные зоны боковых. Указанные данные позволяют сделать вывод об активной реиннервации ткани рубца и каудальных сегментов спинного мозга, особенно выраженной у животных третьей экспериментальной группы. Похожие результаты были получены в эксперименте с использованием Сферогеля и культуры эмбриональных нервных клеток из головного мозга крыс [40]. .Г.МсВопаЫ (2000) используя биополимерный нейроматрикс с культурой полипотентных клеточных элементов, также получил полное восстановление двигательной активности в задних конечностях в у экспериментальных крыс [173]. Успех своих изысканий, как и большинство других исследователей, эти авторы связывают с активной секрецией нейротрофических компонентов помещенными в нейроматрис клетками [70, 109, 120, 121, 123, 144].

Зафиксированная в нашей работе компенсация неврологического дефицита у крыс группы «гель+клетки», а также более успешная миелинизация аксонов, входящих в состав нисходящих спинальных трактов, вероятно, связанна с выделением ОНК ряда нейротрофических агентов (фактора роста нервов МвБ, нейротрофического мозгового фактора ВОКБ, различных классов нейротрофинов (КГГ ¾/5), глиального нейротрофического фактора вОМ7), промотирующая роль которых в отношении новообразования аксонов является неоднократно доказанной [78]. В совокупности они составляют основу многонаправленного нейротрофического действия трансплантата, применение которого в клинике и эксперименте в настоящее время связывается с индукцией и эффективной поддержкой направленного роста аксонов [70, 109, 120, 123].

Вопрос о судьбе ОНК, инкорпорированных в Сферогель и трансплантированных экспериментальным животным, остается открытым. Иммуногистохимический анализ зоны рубца у животных группы «гель+клетки» показал, что новообразованная нейропротезирующая ткань содержит клетки, активно экспрессирующие вАР-43 (основной маркер аксоногенеза) и нейрофиламент-200 (белок промежуточных нейрофиламентов). В то же время в образцах контрольной группы встречаются только единичные ОАР-43- и ]ГР200-позитивные клетки и волокна. Возможность дифференцировки ОНК в направлении нейронов и глиальных элементов широко описана в литературе [144, 171, 183]. Пока трудно сделать вывод о том, принадлежит ли часть иммунопозитивных волокон трансплантированными ОНК или окрашивающиеся на наших препаратах аксоны проходят в составе регенерирующих нервных трактов.

Поэтому полученные в нашей работе данные позволяют говорить в первую очередь о стимулирующем (трофическом) механизме регенераторной активности ОНК, который обеспечивает не только более успешную реваскуляризацию рубцовой ткани, модулирует активность воспалительных процессов, но и стимулирует продукцию различных классов нейротрофических факторов существенно ускоряющих аксоногенез.

Вместе с тем наличие миелиновой оболочки на новообразованных нервных волокна не исключает возможность реализации заместительной (миелин-образующей) функции ОНК, трансплантированных в зону дефекта нервной ткани. Вопрос о механизмах этого действия ОНК нуждается в проведении дополнительных исследований. Известно, что в условиях культивирования, при контактном взаимодействии и нервными волокнами, этим клетки способны формировать типичную миелиновую оболочку на их поверхности [120, 121]. Однако данное свойство ОНК пока не нашло прямого подтверждения в условиях их трансплантации в структуры мозга, в связи с чем в литературе продолжается обширная дискуссия, начатая У. №§-аЬага еще в 1940 году, когда была проведена первая операция по трансплантации ОНК в поврежденный мозг [134]. Большинство авторов считают, что образование миелиновой оболочки на прорастающих через мозговой рубец аксонов — функция исключительно Швановских клеток, активно мигрирующих в очаг повреждения под влиянием нейротрофических факторов, секретируемых ОНК [123]. Другие [145, 151] обосновывают миелин-продуцирующую роль сохранившихся или мигрировавших в область повреждения олигодендроцитов, в то время как третьи [119] настаивают на прямом участии в образовании миелина ОНК, имплантированных в зону тканевого дефекта и получивших здесь соответствующую программу развития. Эти факты находят клиническое подтверждение при успешном использовании трансплантации ОНК больным с диффузными демиелинизирующими заболеваниями [144].

В связи с обсуждением заместительной функции ОНК в зоне трансплантации интересным и многообещающим, на наш взгляд, является вопрос о возможности трансформации этих клеток в нервные элементы, их приживления в зоне пересадки и дальнейшей судьбе. Известно, что при соответствующих условиях и сроках культивирования ОНК могут формировать синаптические специализации и отвечать на раздражения как функционально зрелые нейроны [73, 93]. В нашем эксперименте около 5% культивированных на Сферогеле клеток, наряду с короткими выростами цитоплазмы (вероятно дендриты) имели длинный, единичный, аксоноподобный отросток. Это позволяет предполагать их возможную дифференцировку в нейрональном направлении. Мы не исключаем поэтому, что, будучи имплантированными, в область тканевого дефекта спинного мозга, они, отчасти, выполняют структурную роль, включаясь в функционирование новообразованных синаптических цепей. Для доказательства этого предположения необходимо проведение соответствующих иммуноцитохимических и электрофизиологических исследований.

Наряду с морфологическими изменениями, свидетельствующими о более эффективном течении нейрорепаративного процесса у экспериментальных животных, анализ их поведенческой активности, соматического статуса, и локомоторных функций также подтверждает эффективность используемого трансплантационного материала. Функциональное восстановление, наиболее выраженное у животных группы «гель+клетки», проявлялось преимущественно изменениями в двигательной сфере. Здесь наиболее отчетливо и в более ранние сроки выявлялись изменения тонуса задних конечностей, появление реакции отталкивания на тактильные раздражители и появление способности преодолевать экспериментальное препятствие на пути к кормушке с использованием задних лап, что позволяло, используя стандартизованную международную шкалу «ВВВ» оценить достигнутые результаты в 11 баллов. Экстраполируя полученные данные на шкалу тяжести спинальной травмы «ASIA», можно ожидать улучшения соответствующего критерию «В» и «С», что в свою очередь позволяет прогнозировать появление способности к самостоятельному передвижению больных и самообслуживанию.

Указанные технологии еще далеки от совершенства. Тем не менее, настоящее время стало очевидно, что использование данной технологии в достаточно большом количестве случаев позволяет существенно улучшить реабилитационные возможности спинальных больных, поскольку предлагаемые методы базируются на фундаментальных общебиологических механизмах регенерации.