Развитие методов фрагментации молекулярных ионов в масс-спектрометрии

Исследование макромолекул является одним из важнейших направлений современной науки [1−3]. Особый интерес представляет изучение белковых макромолекул или белков, играющих ключевую роль в жизнедеятельности человека. Исследования белков методами масс-спектрометрии получили интенсивное развитие в результате ряда открытий 1980;х годов в области мягкой ионизации крупных молекулэлектроспрей ионизации (или, что более соответствует сущности механизма образования ионов, «экстракции ионов при атмосферном давлении») [4,5] и лазерной десорбции/ионизации [6]. Возможность получения ионов макромолекул в газовой фазе ускорила развитие техники масс-спектрометрии. Были значительно улучшены аналитические возможности масс-спектрометров, что позволило дополнить фундаментальные исследования прикладными. Успехи аналитического приборостроения, ионной физики, химической физики, физической электроники и информатики открыли новые пути развития современной медицины, биологии, экологии и других наук.

Однако, для выяснения функциональных особенностей белков и их роли в жизнедеятельности организма человека информации только о молекулярном весе, определяемом масс-спектрометрией, недостаточно.

Необходимы сведения о структуре макромолекул, включая положение и типы пост-трансляционных модификаций [7−9]. Особое значение в последние годы приобрели методы структурного анализа макромолекул с использованием тандемной, или многоступенчатой во времени или пространстве, масс-спектрометрии [10−15]. Основанные на фрагментации макромолекулярных ионов (МИ), они позволяют получать важную фундаментальную и прикладную информацию. В совокупности с информацией о молекулярном весе МИ полная, или частичная, информация о первичной структуре МИ позволяет определение неизвестных белков используя компьютерный поиск в базах данных белков [3]. Освоены и используются три типа основных реакций, приводящих к фрагментации МИ [16]:

— столкновительная на атомах газа, остаточного или напускаемого в вакуумный объем, а также на поверхностях мишеней [17−20];

— взаимодействие с электронами низких (1−10 эВ) и средних (10−100 эВ) энергий [21−24];

— взаимодействие с фотонами ИК и УФ диапазонов [25−27].

Тандемная масс-спектрометрия на основе столкновительной фрагментации получила наибольшее распространение во время-пролетной масс-спектрометрии (ВП МС, [11,12]). Основными факторами явились простота и распространенность данного типа масс-анализаторов в сочетании с возможностью анализа МИ в широком диапазоне масс. В рамках данной работы эти качества ВП МС были использованы для развития метода столкновительной фрагментации МИ на поверхности твердого тела в вакууме. Однако, применение тандемной масс-спектрометрии для анализа белковых макромолекул с массами более 10 кДа потребовало использования масс-анализаторов с высокой разрешающей способностью. В настоящее время наиболее высокие характеристики измерений (разрешение по массам, точность определения масс, чувствительность и т. д.) обеспечивает масс-спектрометр на ионном циклотронном резонансе с преобразованием Фурье (МС ИЦР ПФ, [28−30]). Уникальность МС ИЦР ПФ для тандемной масс-спектрометрии состоит в возможности проведения и исследования газофазных реакций взаимодействия МИ с электронами и фотонами. В целях развития методов структурного анализа МИ используемый в данной работе МС ИЦР ПФ был модифицирован для обеспечения требуемых режимов ионно-электронных и ионно-фотонных взаимодействий в соответствии с целями и задачами работы.

Методы фрагментации МИ с использованием лазерного излучения и столкновений с атомами газов широко применяются в МС ИЦР ПФ для изучения структур белковых макромолекул, однако им свойственны фундаментальные ограничения, типичные для методов медленного нагрева [18]. Происходит селективная фрагментация, теряется информация о положении лабильных групп (пост-трансляционных модификаций) в структуре МИ. Недостаточно изучены реакции фрагментации при столкновениях МИ с атомами газа в радиочастотных полях, что сдерживает применение столкновительной фрагментации в МС ИЦР ПФ [31].

Метод фрагментации МИ при взаимодействии с низкоэнергетичными электронами, или электронный диссоциативный захват (ЭДЗ) характеризуется большим временем реакции и низкой воспроизводимостью [32]. Отсутствие данных о значениях потенциалов ионизации препятствует совершенствованию метода. Обозначенные проблемы метода ЭДЗ связаны, возможно, с недостаточным качеством потока низкоэнергетичных электронов, высоким разбросом электронов по энергиям, низкой плотностью потока электронов, малым перекрытием ионного и электронного облаков в ионной ловушке МС ИЦР ПФ. На основе аналитических расчетов сделан вывод о том, что для развития методов фрагментации на основе ЭДЗ в масс-спектрометрии целесообразно усовершенствовать систему инжекции электронов, повысить качество потока инжектируемых электронов, выявить возможности комбинирования различных методов фрагментации, использования их в единой конфигурации, а также осуществить поиск новых типов реакций фрагментации МИ.

Известны исследования фрагментирующих взаимодействий МИ с поверхностью твердого тела (как вакуумно чистой, так и покрытой слоями молекул [20]), но имеющихся данных недостаточно для прикладного использования реакций фрагментации данного типа. Это обуславливается тем, что фундаментальные физические процессы взаимодействия МИ с поверхностью твердого тела сложны и многообразны (например, [33, 34] и др.). Реализация различных сценариев преобразования состояния частиц на поверхности позволяет осуществить десорбцию, ионизацию, нейтрализацию, фрагментацию и, возможно, другие виды реакций. Современный арсенал возможных методов десорбции и ионизации на поверхности включает термодесорбцию [35], переходы в сильном электрическом поле [36−38], лазерные [39−41], бомбардировку быстрыми и медленными частицами [42], ионизацию на нагретых поверхностях [43−45], электродинамическое возбуждение [46, 47]. Перечисленные примеры поверхностных реакций основаны на диссипации подводимой энергии в ансамбле адсорбированных частиц, находящихся в прекурсорной или латеральной стадии. Поверхности металлических образцов имеют распределенную сеть дефектов, концентрация которых достигает 107−101° см" 2, размер шероховатостей в среднем составляет 0.1 мкм [48]. Эффективность взаимодействия электронов проводимости с поверхностью пропорциональна «коэффициенту дефектности», который характеризуется степенью заполнения поверхности локальными дефектами, в том числе адсорбированными частицами [49]. Совместное действие горячих электронов (передача энергии активирующего электрического импульса в электронную подсистему) и возбужденных фононов (акустической волны) должно выражаться в возрастании интенсивности процессов преобразования состояния ионов на поверхности [50].

Основные факторы формирования потока десорбируемых ионов [46, 47]:

• роль горячих электронов: а) образование отрицательных ионов (электронный захват на поверхности, в т. ч. диссоциативный) — б) десорбция нейтраловв) туннельная нейтрализация десорбируемых положительных ионов;

• роль акустической волны: г) ударно-волновой механизм десорбциид) неупругие ионизационные столкновения атомов (ионов) подложки с адсорбатом.

Электродинамическое активирование поверхности представляется перспективным способом фрагментации молекулярных ионов, взаимодействующих с горячими электронами и акустическими фононами.

Проведенный анализ литературных данных позволяет заключить, что, несмотря на широкое применение, эффективность известных методов фрагментации МИ недостаточна для решения многих современных задач. В связи с ростом сложности изучаемых объектов, требованием уменьшения количества анализируемого материала, увеличения содержания примесей в исследуемых пробах, требуется дальнейшее развитие методов тандемной масс-спектрометрии: увеличение темпов реакции, повышение чувствительности и воспроизводимости методов. В физической электронике XX века накоплен значительный опыт изучения процессов ионно-элекгронных, ионно-фотонных, и ионно-молекулярных взаимодействий относящихся, однако, преимущественно к атомам и небольшим молекулам [51]. Современные исследования макромолекул находятся в начальной стадии, имеющихся данных недостаточно. Сказанное выше обуславливает важность и актуальность исследований, направленных на разработку или усовершенствование методов, позволяющих повысить информативность исследований строения и свойств макромолекул.

Основными целями диссертации явились:

• развитие ЭДЗ метода фрагментации МИ путем улучшения параметров инжектируемого электронного пучка: увеличение частоты фрагментирующих ионно-электронных взаимодействий, улучшение воспроизводимости;

• определение потенциалов ионизации МИ при повышении степени ионизации МИ электронным ударом;

• создание метода и выявление возможностей комбинированного фрагментирующего воздействия электронов низких энергий и фотонов ИК диапазона на МИ в газовой фазе и на поверхности твердого тела в вакууме;

• развитие метода корпускулярной и поверхностной столкновительной фрагментации МИ: выявление особенностей фрагментации при различных параметрах возбуждения МИ.

8 соответствии с указанными целями определены основные задачи:

• обоснование требований к устройствам инжекции электронов и фотонов и их реализация для повышения эффективности фрагментации МИ в масс-спектрометре на ионном циклотронном резонансе с преобразованием Фурье (МС ИЦР ПФ) и время-пролетном масс-спектрометре (ВП МС);

• получение с помощью усовершенствованных устройств инжекции в МС ИЦР ПФ основных экспериментальных характеристик процессов взаимодействия МИ с потоком электронов низкой энергии;

• измерение потенциалов ионизации некоторых МИ при повышении степени ионизации МИ с помощью усовершенствованных устройств инжекции электронов в МС ИЦР ПФ;

• выявление характеристик взаимодействия электронов и фотонов с нейтральными и заряженными молекулами в газовой фазе и на поверхности в вакууме;

• проведение теоретического (на основе компьютерного моделирования) и экспериментального анализа столкновительной фрагментации МИ в радиочастотной гексапольной ловушке в электроспрей ионном источнике МС ИЦР ПФ;

Научная новизна полученных и представленных в диссертации результатов работы. В ней впервые:

1. Получена ускоренная, устойчиво воспроизводимая фрагментация МИ при захвате электронов низких энергий в МС ИЦР ПФ. Впервые достигнуто снижение времени фрагментации на несколько порядков, до.

1 мс, использованы жидкостная хроматография и капиллярный электрофорез в режиме реального времени в тандемной МС ИЦР ПФ [А1-АЗ].

2. Выявлена линейная зависимость значений энергий ионизации ИЭ протонированных полипептидов от заряда z (z=1.5) в диапазоне масс (1.0 — 3.5) кДа вида H3(z)=[9.8+1.1z±0.5] (эВ) [А4].

3. Совмещены быстрая электронная и фотонная фрагментации МИ в МС ИЦР ПФ. Показано, что комбинированные фрагментационные масс-спектры содержат новую информацию о структуре МИ, в том числе о пост-трансляционных модификациях. При комбинированном действии электронов и фотонов выявлены не изученные ранее процессы, с помощью которых осуществлен структурный анализ МИ [А5-А7].

4. Теоретически и экспериментально выявлено, что эффективная столкновительная фрагментация МИ на атомах газа в радиочастотной гексапольной ловушке достигается в режиме увеличенного объемного заряда ионов и радиальной стратификации, в котором ионы с большими значениями отношений масса/заряд испытывают существенное действие поля пространственного заряда [А8].

5. Выявлена импульсная активированная фрагментация МИ на поверхности металлических и полупроводниковых образцов в ВП МС при комбинированном воздействии низкоэнергетичных электронов и лазерного излучения [А9-А14].

Достоверность полученных результатов обеспечена использованием широкого набора различных экспериментальных установок и приборов, тщательной отработкой комплекса различных методик исследования, многократной проверкой получаемых данных, соответствием данным, имеющимся в научно-технической литературе.

Научная значимость диссертационной работы состоит в том, что в ней получили развитие физические представления, относящиеся к энергетическим возбуждениям и структурным преобразованиям МИ при взаимодействии с электронами, фотонами и нейтральными частицами. Развиты новые методические решения, которые существенно расширили возможности исследований фрагментации МИ.

Практическая ценность диссертационной работы состоит в том, что ее результаты позволили получить более широкую и подробную научную информацию о структуре исследованных МИ. В дальнейшем они нашли непосредственное применение в масс-спекгрометрии макромолекул для проведения структурного анализа отдельных частиц и их смесей [52−58]. Указанные результаты используются также в учебных курсах и в научных исследованиях в СПбГПУ.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Ускоренная, устойчиво воспроизводимая фрагментация МИ реализуется при инжекции оптимизированного потока электронов низких энергий в МС ИЦР ПФ. При этом время фрагментации снижается на несколько порядков, вплоть до -1 мс, что обеспечивает использование в тандемной МС ИЦР ПФ жидкостной хроматографии и капиллярного электрофореза в режиме реального времени.

2. Зависимость значений энергий К высоких степеней ионизации протонированных полипептидов от заряда z (z=1.5) в диапазоне масс (1.0 — 3.5) кДа вида K (z)=[9.8+1.1 z±0.5] (эВ) имеет линейный характер.

3. Масс-спектры, полученные в режиме совмещения быстрой электронной и фотонной фрагментации МИ в МС ИЦР ПФ, содержат новую информацию о структуре МИ, в том числе о пост-трансляционных модификациях. При комбинированном действии электронов и фотонов возникают специфические процессы фрагментации, с помощью которых осуществляется структурный анализ МИ.

4. Кинетическая энергия МИ, участвующих в столкновительной фрагментации на атомах газа в радиочастотной гексапольной ловушке, существенно возрастает в режиме увеличенного объемного заряда ионов и радиальной стратификации, в котором ионы с большими значениями отношений масса/заряд испытывают существенное действие поля пространственного заряда.

5. Импульсная активированная поверхностная фрагментация МИ осуществляется при инжекции электронов в тонкие металлические и полупроводниковые образцы в ВП МС.

Апробация работы.

Материалы диссертации прошли апробацию в виде лекций и докладов на более чем 10 научных конференциях в России и за рубежом, в том числе: 6ая научно-техническая конференция «Фундаментальные исследования в технических университетах», СПб, СПбГПУ, Июнь 2003; 49ая, 50ая и 51ая ASMS конференции по масс-спектрометрии, СШАКанада, 2001 — 2003 гг.- Европейская конференция по физике, Страсбург, Франция, Июнь 2001; 15ая Конференция по активации и диссоциации ионов, Санибел, США, Январь 2003; Конференции «Десорбция» 2000 (Франция) и 2002 (США) — Конференция по масс-спектрометрии в медицине, биологии и экологии, Москва, Апрель 2002; 15ая международная конференция по взаимодействиям ионов с поверхностью, Звенигород, Август 2001.

Публикации.

Основные материалы диссертации опубликованы в 14 работах, в том числе 3 статьи в журналах (Известия АН — серия физическая, Journal of Mass Spectrometry, European Journal of Mass Spectrometry), 11 публикаций в трудах конференций. Основные публикации по теме диссертации приведены в списке литературы.

Исследования, представленные в диссертации, выполнены в СПбГТУ-СПбГПУ в период приблизительно с 1999 года по настоящее время. Кроме того, циклы измерений проведены в Ангстрем Лаборатории (Университет Уппсала, Швеция).

Структура диссертации.

Диссертация состоит из введения, четырех глав, заключения, списков основных публикаций (14 наименований) и цитируемой литературы (129 наименований). Общий объем диссертации — 198 страниц, включая 53 рисунка и таблицы.

Выводы и заключение.

Результаты, полученные в данной диссертации, в целом обеспечили развитие основных методов фрагментации макромолекулярных ионов (МИ) в масс-спектрометрии и имеют значительные перспективы научно-технического развития.

1. С помощью разработанного устройства инжекции электронов существенно повышен темп реакции фрагментации макромолекулярных ионов при захвате электронов низких энергий в МС ИЦР ПФ. Достигнутое снижение времени фрагментации на несколько порядков, до 1 мс, близкое к предельному теоретическому значению при значении сечения фрагментации ~10'12 см2, обеспечивает использование разделения смесей с помощью жидкостной хроматографии или капиллярного электрофореза в режиме реального времени в тандемной МС ИЦР ПФ. Получены данные о характеристиках взаимодействия МИ различных типов и начальных состояний с электронами низких энергий: зависимости от энергии электронов, времени облучения электронами, распределения продольных и поперечных скоростей электронов. Выявлены условия эффективной фрагментации МИ, проведены контрольные эксперименты по определению первичной структуры пептидов и белков в диапазоне масс (1 — 29) кДа. Разработаны и апробированы методы структурного анализа ионов пептидов и фрагментов белков, получаемых при разделении биологических смесей и продуктов гидролиза белков с помощью жидкостной хроматографии и капиллярного электрофореза.

2. Получена эмпирическая зависимость значений энергий ионизации ИЭ протонированных полипептидов от зарядового состояния z (z=1.5) в диапазоне масс (1.0 — 3.5) кДа вида H3(z)=[9.8+1.1z±0.5] (эВ). Этот результат может быть использован при разработке методов генерации многозарядных ионов в ионных источниках с лазерной десорбцией/ионизацией, а также в экспериментах по пост-ионизации.

3. Электронная и фотонная фрагментации МИ совмещены в газовой фазе, а также на поверхности твердого тела в вакууме. В МС ИЦР ПФ совмещенная фрагментация дала дополнительную информацию о структуре молекул, в том числе о пост-трансляционных модификациях. Расширены возможности структурного анализа МИ с помощью новых типов реакций, возникающих при комбинированном действии электронов и фотонов. Показано принципиальное преимущество использования комбинированного действия электронов и фотонов для изучения структурной динамики МИ в газовой фазе при повышенном темпе реакции. Импульсная активированная фрагментация МИ на поверхности металлических и полупроводниковых образцов в ВП МС достигнута в режиме инжекции импульсного электронного потока длительностью (10 — 100) не.

4. Эффективная столкновительная фрагментация МИ в газовой фазе в радиочастотной гексапольной ловушке в МС ИЦР ПФ получена в режиме увеличенного объемного заряда ионов и радиальной стратификации, в котором ионы с большими значениями отношений масса/заряд испытывают более сильное действие поля пространственного заряда. Построены эмпирические зависимости средней кинетической энергии иона в гексаполе: Ксредн = z • [-10^ + (6,7 ± 0,3)-Ю10 • Q + (1,4± 1,0)• Ю-3 • Я], (z — зарядовое состояние МИ, Q — суммарный пространственный заряд ионов (в Кл), Я — средняя длина свободного пробега (в мм)) и энергии Ki ионов, вовлеченных в процесс фрагментации в гексаполе: К{ = 0,025-z, эВ для типичных условий эксперимента.

Развитые в данной работе методы фрагментации МИ при взаимодействии с электронами, фотонами и атомами позволяют осуществлять более эффективный структурный анализ макромолекул в масс-спектрометрии. Разработанные технические средства нашли применения в масс-спектрометрии макромолекул, а также при анализе сложных смесей макромолекул. Полученные результаты представляются полезными для развития физических представлений в смежных областях науки, например, биотехнологии, медицине, технологии масс-спектрометров и ионных источников.

Основные публикации по теме диссертации.

А1. Фотиади А. Э., Цыбин Ю. О. / Исследование макромолекул методом диссоциативного взаимодействия с медленными электронами и ИК фотонами в магнитном поле // Сб. Тезисов докладов 7й Всероссийской конференции «Фундаментальные исследования в технических университетах», Санкт-Петербург, СПбГПУ, 2003. С. 131.

А2. Tsybin Y.O., Palmblad М., Hakansson P. / Large Emitting Area Electron Gun for Electron Capture Dissociation in Fourier Transform Ion Cyclotron Resonance Mass Spectrometry. // Proceedings of the 49th ASMS Conference on Mass Spectrometry and Allied Topics, Chicago, IL, USA, June 1−5, 2001.

A3. Tsybin Y.O. Hakansson P. / Ion Physics of Macromolecules: Structural Characterization by Mass Spectrometry // Proceedings of the European Conference in physics, Strasbourg, France, June 2001. P. 80−81.

A4. Budnik B.A., Tsybin Y.O., Hakansson P., Zubarev R.A. / Ionization energies of singly and multiply protonated polypeptides obtained by tandem ionization in Fourier transform mass spectrometers // Journal of Mass Spectrometry. 37. 2002. P. 1141−1144.

A5. Цыбин О. Ю., Цыбин Ю. О., Кравец H.M., Григорьев А. В. / Моделирование движения ионов в ловушке масс-спектрометра на циклотронном резонансе // Сб. Тезисов докладов 7й Всероссийской конференции «Фундаментальные исследования в технических университетах», Санкт-Петербург, СПбГПУ, 2003. С. 123.

А6. Tsybin Y.O., Witt М., Weiss G., Baykut G., Hakansson P. / Development and Application of Combined Infrared Multiphoton and Electron Capture Dissociation with a Hollow Electron Beam in Fourier Transform Ion Cyclotron Resonance Mass Spectrometry // Proceedings of the 51st ASMS Conference on Mass Spectrometry and Allied Topics, Montreal, Canada, June 8−12, 2003.

A7. Tsybin Y.O., Witt M., Hakansson P., Baykut G. / Ion Activation and Dissociation by Combined Low-Energy Electron and Infrared Laser Irradiation // Proceedings of the 15th Sanibel Conference on Ion Activation and Dissociation, Sanibel Island, FL, USA, January 2003.

A8. McDonnell L.A., Giannakopulos A.E., Tsybin Y.O., Hakansson P., Derrick P.J. / A theoretical investigation of the kinetic energy of ions trapped in a radio-frequency hexapole ion trap. // European Journal of Mass Spectrometry. 8. 2002. P. 181−189.

A9. Цыбин О. Ю., Цыбин Ю. О, Кравец Н. М., Саргаева Н. П. / Физические основы электродинамической поверхностной генерации ионов // Сб. Тезисов докладов 7й Всероссийской конференции «Фундаментальные исследования в технических университетах», Санкт-Петербург, СПбГПУ, 2003. С. 125.

АЮ. Цыбин О. Ю., Цыбин Ю. О., Хаканссон П. / Ионная десорбция при инжекции электронов в тонкую металлическую пластину // Материалы международной школы-семинара «Масс-спектрометрия в химической физике, биофизике и экологии», Звенигород, 25−26 апреля 2002 года, С. 149.

А11. Цыбин О. Ю., Цыбин Ю. О., Кравец Н. М. / Десорбция ионов при воздействии импульсов поверхностного тока на металлические и полупроводниковые образцы в вакууме // Известия AM, Серия физическая, 66. 2002. С.1203−1206.

А12. Цыбин Ю. О., Кравец Н. М., Цыбин Ю. О. / Исследование десорбции ионов при воздействии импульсов тока сквозь металлические и полупроводниковые фольги в вакууме // Материалы пятнадцатой международной конференции «Взаимодействие ионов с поверхностью» — ВИП- 2001, Москва, 2001, Т. 1, С.520−522.

А13. Tsybin O.Y., Tsybin Y.O., Santacruz С., Sargaeva N., Hakansson P. / Desorption/ionization by backside electron beam injection into metal or semiconductor targets with and without front side laser irradiation //.

Proceedings of the 51st ASMS Conference on Mass Spectrometry and Allied Topics, Montreal, Canada, June 8−12, 2003. A14. Цыбин Ю. О. Цыбин О.Ю. / Физические процессы транспортировки электронов и ионов при электромагнитном возбуждении поверхности металлов и полупроводников // Тезисы докладов 2-й Республиканской конференции по Физической Электронике. Ташкент, 3−5 ноября 1999 года, С. 125.