Поверхностные сериновые протеазы SCPB и CSPA в качестве кандидатов для создания вакцин против Streptococcus Agalactiae

Актуальность работы.

Патогенные стрептококки относятся к наиболее распространенным возбудителям бактериальных инфекций человека. В последние десятилетия заболевания, вызываемые стрептококками серогруппы В (СГВ) или Streptococcus agalactiae, в большинстве стран мира рассматриваются в качестве важной социально-экономической и медицинской проблемы. Известно, что СГВ является естественным обитателем прямой кишки человека, способного вызывать инфекции уро-генитальной системы у женщин. Наряду с этим, СГВ может вызывать различные патологии беременности, в том числе выкидыши, внутриутробное поражение плода, преждевременные роды. СГВ могут вызывать серьезные инфекции у новорожденных, такие как сепсис, пневмония и менингит. Особо опасны инфекции, вызываемые СГВ у детей не старше десяти дней, протекающие в форме молниеносного сепсиса и приводящие к смертности в высоком проценте случаев.

Заболевания, вызываемые СГВ, как правило, лечат антибиотиками [Страчунский JI.C. 2002, Поляк М. С. 2003]. Препаратами выбора при лечении СГВ инфекций являются антибиотики бета-лактамного ряда (бензилпенициллин, ампициллин [Семина H.A. 2004], ампициллин в комбинации с сульбактамом [Бурбелло А.Т. 2003]) — макролиды (эритромицин, кларитромицин, рокситромицин, азитромицин) и ванкомицин [Зуева Л.П. 2004].

В целях профилактики инфекций, вызванных СГВ, используют такие антибиотики, как бензатин бензилпенициллин, эритромицин и ампициллин с сульбактамом [Бурбелло А.Т. 2003].

Антибиотики, широко применяемые для профилактики и лечения, нередко оказываются неэффективными в силу увеличения числа антибиотикоустойчивых штаммов. Другим недостатком антибиотикотерапии является возникновение побочных эффектов для здоровья людей. К ним относятся аллергические реакции, негативное воздействие на центральную нервную и сердечно-сосудистую системы, и на некоторые внутренние органы^ человека. Кроме того, применение антибиотиков может приводить к нарушению микробиоценоза организма, что приводит к дисбиозам и, как следствие, к уменьшению устойчивости организма к другим инфекционным агентам, в первую очередь микоплазмам, хламидиям и грибам рода Candida.

В этой связи очевидна необходимость поиска новых средств и способов профилактики, в том числе специфической профилактики инфекций, вызываемых СГВ, посредством создания вакцинных препаратов.

В настоящее время большое число лабораторий мира работает над созданием вакцины против СГВ. Основными аргументами в пользу целесообразности создания такой вакцины, помимо низкой эффективности антибиотиков или невозможности их применения для профилактики, является возможность четкого выделения основных контингентов лиц, подлежащих вакцинации. В первую очередь — это носительницы СГВ с осложненной первой беременностью, планирующие рождение второго ребенка, а также здоровые женщины — будущие матери, нуждающиеся в профилактике СГВ инфекций. Потенциально объектами для иммунизации могут рассматриваться лица пожилого возраста, учитывая высокий уровень СГВ заболеваний в этой возрастной группе.

Одним из новых направлений при создании вакцин является использование в качестве её компонентов рекомбинантных полипептидов, полученных на основе поверхностных белковых факторов патогенности СГВ. Выбор рекомбинантного полипептида или оптимальной комбинации полипептидов при создании вакцины должен определяться рядом условий, в число которых входят распространенность, консервативность, иммуногенность и протективность исходных поверхностных белков СГВ, на основе которых конструируются рекомбинантные полипептиды.

Среди поверхностных белковых факторов патогенности СГВ перспективными кандидатами для создания вакцины рассматриваются и сериновые протеазы. Последние способствуют выживанию СГВ в организме хозяина, так как они участвуют в расщеплении белков в качестве источников энергии или с целью подавления иммунных реакций организма. Важной особенностью некоторых сериновых протеаз является их способность расщеплять хемоаттрактанты. Так, например, С5а пептидаза, или 8срВ, специфически расщепляет С5а компонент комплемента человека, мобилизующий полиморфноядерные лейкоцитыа протеаза СэрА гидролизует ряд хемокинов СХС семейства, а именно ОКО-а1рЬа, ОШЭ-Ье1а, С1Ю^атта, пептид, активирующий нейтрофилы (ХАР-2), и гранулоцитарный хемотаксический белок 2 (ОСР-2). С5а компонент комплемента и перечисленные хемокины обладают свойствами анафилотоксинов и стимулируют привлечение в очаг инфекции полиморфноядерных лейкоцитов и макрофагов, поэтому их инактивация способствует подавлению факторов врожденного иммунитета. Указанные свойства сериновых протеаз ЯсрВ и Сэр, А указывают на их физиологическую значимость для СГВ.

В силу изложенного, получение иммуногенных и протективных рекомбинантных полипептидов на основе С5а пептидазы и протеазы С эр, А позволит использовать их в качестве компонентов при создании вакцинного препарата против СГВ.

Все вышесказанное определило цели и задачи настоящего исследования.

Цель исследования — получение рекомбинантных полипептидов на основе сериновых протеаз 5. agalactiae С5а пептидазы и протеазы СэрА для вакцинной профилактики заболеваний, вызываемых стрептококками группы В.

Для этого планировалось выполнить следующие задачи:

1. Анализ вторичной структуры С5а пептидазы и протеазы CspA для выявления потенциально иммуногенных участков данных белков.

2. Изучение распространенности и консервативности гена cspA, кодирующего протеазу CspA, в штаммах СГВ.

3. Получение очищенных препаратов рекомбинантных полипептидов на основе С5а пептидазы и протеазы CspA.

4. Изучение иммуногенности рекомбинантных полипептидов и протективные свойств антител, полученных к рекомбинантным полипептидам, в опытах in vivo и in vitro.

5. Изучение вклада различных частей С5а пептидазы и протеазы CspA в индукцию гуморального иммунного ответа в организме человека.

6. Исследование токсичности рекомбинантных полипептидов в опытах in vivo.

Научная новизна работы.

1. Впервые продемонстрирована распространенность гена cspA, кодирующего сериновую протеазу CspA среди штаммов СГВ различных серотипов. Доказана консервативность участков гена cspA, кодирующих N-терминальную и С-терминальную части протеазы CspA.

2. Просеквенированные фрагменты гена cspA десяти штаммов СГВ различных серотипов депонированы в банк данных GenBank NCBI и им присвоены следующие номера: HQ849568, HQ849569, HQ849570, HQ849571, HQ849572, HQ849573, HQ849574, HQ849575, HQ849576 и HQ849577.

3. Впервые изучен вклад различных участков С5а пептидазы и протеазы CspA в формирование протективного иммунитета к стрептококку группы В и показано, что наличие во вторичной структуре полипептида а-спиральных структур способствует г повышению иммуногенности и протективности.

4. Впервые проклонированы определенные фрагменты генов, кодирующие различные участки на С5а пептидазе и протеазе CspA, и получены соответствующие им рекомбинантные полипептиды Pbla, РЬЗа, Pb4a, Csp2 и Csp3.

5. Впервые продемонстрировано, что полипептиды малых размеров (73 85 аминокислотных остатков) на основе С5а пептидазы и. протеазы CspA способны индуцировать синтез специфических антител с протективными свойствами не только против S. agalactiae, но и против S. pyogenes.

Теоретическая значимость работы.

Продемонстрирована распространенность гена cspA, кодирующего поверхностную сериновую протеазу CspA, как в референс-штаммах, так и в клинических изолятах СГВ различных серотипов. Доказана консервативность фрагментов гена cspA, кодирующих N-терминальную и С-терминальную части протеазы CspA, в штаммах СГВ различных серотипов. Изучен вклад различных частей С5а пептидазы и протеазы CspA в формировании гуморального иммунного ответа к СГВ. Показано, что индукция синтеза специфических и протективных антител зависит от процентного содержания а-спиральных структур в молекуле белка.

Практическая значимость работы.

Созданы штаммы-продуценты Е. coli рекомбинантных полипептидов на основе С5а пептидазы (Pbla, РЬЗа и РЬ4а) и протеазы CspA (Csp2 и Csp3). Доказано, что высокоочищенные рекомбинантные полипептиды Pbla, РЬЗа и Csp3 обладают иммуногенностыо и способностью формировать образование протективных антител к.

СГВ. Рекомбинантные полипептиды РЬЗа и Csp3 рассматриваются как перспективные компоненты вакцины против СГВ.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Ген cspA, кодирующий протеазу CspA, присутствует во всех референс-штаммах и клинических изолятах СГВстепень гомологии фрагментов гена cspA (csp2 и csp3) в различных штаммах — 98−400%.

2. Проклонированы фрагменты гена С5а пептидазы и протеазы CspA, которые кодируют рекомбинантные полипептиды РЫа, РЬЗа, РЬ4а, Csp2 и Csp3.

3. Участки С5а пептидазы на N-терминальном конце с 96 по 169 аминокислотный остаток и в центральной области с 496 по 570 аминокислотный остаток, а также участок с 1247 по 1332 аминокислотный остаток на С-терминальном конце протеазы CspA, содержат детерминанты, отвечающие за индукцию специфических антител, эффективно опсонизирующих СГВ.

4 т Рекомбинантные полипептиды РЬЗа и Csp3, содержащие высокий процент a-спиральных структур, обладают высокой иммуногенностью, а антитела, полученные к ним, проявляют протективную и опсонизирующую активность in vitro и in vivo.

5. Рекомбинантные полипептиды РЬЗа и Csp3 на основе С5а пептидазы и протеазы CspA, соответственно, могут быть рекомендованы для дальнейшего использования при создании вакцин против СГВ.

Апробация работы.

По теме диссертации опубликовано 16 научных работ, в том числе один патент и четыре статьи в изданиях, рекомендованных ВАК России. Материалы исследований доложены автором и обсуждены на многих отечественных и международных научных конференциях и симпозиумах (на Научно-практической конференции молодых ученых и специалистов «Актуальные вопросы клинической и экспериментальной медицины», г. Санкт-Петербург, Россия, 2007; 11-ой Международной школе-конференции молодых ученых «Биология — наука XXI века», г. Пущино, Россия, 2007; «XVII международном симпозиуме по стрептококкам и стрептококковым заболеваниям им. Ленсфильд», г. Порто Хели, Греция, 2008; 3-м Конгрессе европейских микробиологов, г. Гетерборг, Швеция, 2009; III Международном молодежном медицинском Конгрессе «Санкт-Петербургские научные чтения-2009», г. Санкт-Петербург, Россия, 2009; 20-ом Европейском конгрессе по клинической микробиологии и инфекционным заболеваниям «20л ЕССМГО», г. Вена, Австрия, 2010; на конференции молодых ученых «Проблемы биомедицинской науки третьего тысячелетия», г. Санкт-Петербург, Россия, 2010).

Структура и объем диссертации

.

Диссертационная работа изложена на 153 страницах и включает: введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты собственных исследований и их обсуждение, общее заключение, выводы, список литературы. Работа проиллюстрирована 28 рисунками и 16 таблицами.

Список литературы

включает 179 источников, из них 12 отечественных и 167 зарубежных.

выводы.

1. Ген сврА, кодирующий сериновую протеазу Сэр А, присутствует во всех исследованных штаммах СГВфрагменты сзр2 и сярЗ, кодирующие N и С-терминальные участки СэрА. имеют высокую степень гомологии (98−100%) среди СГВ различных серотипов.

2. Получены, выделены и очищены рекомбинантные полипептиды РЫа, РЬЗа и РЬ4а на основе С5а пептидазы и СБр2, СэрЗ на основе протеазы СярА, и созданы штаммы-продуценты этих полипептидов.

3. На модели лабораторных животных продемонстрировано, что рекомбинантные полипептиды РЫа, РЬЗа и СэрЗ содержат антигенные детерминанты, ответственные за индукцию специфических антител, опсонизирующих СГВ и СГАрекомбинантный полипептид Сир2 не индуцирует антител, опсонизирующих СГВ.

4. Установлено, что участки С5а пептидазы и сериновой протеазы Сэр, А с большим содержанием а-спиральных структур (РЬЗа и СэрЗ, соответственно) являются наиболее выраженными индукторами гуморального иммунного ответа.

5. Продемонстрировано, что в ' организме человека в ходе формирования гуморального иммунного ответа на СГВ инфекцию индуцируются специфические антитела ко всем исследованным пептидам на основе молекул С5а пептидазы и протеазы СэрА.

6. Два рекомбинантных полипептида на основе С5а пептидазы и протеазы СэрА, обладающие выраженной а-спирализованностью и обеспечивающие выработку протективных антител (РЬЗа и СэрЗ, соответственно) могут быть рекомендованы в качестве компонентов вакцин против СГВ.

БЛАГОДАРНОСТИ.

Научному руководителю проф., д.м.н. Суворову А.Н.

Сотрудникам отдела молекулярной микробиологии НИИЭМ СЗО РАМН: д.м.н., акад. РАМН Тотоляну A.A. д.б.н. Дмитриеву A.B. д.б.н. Гупаловой Т. В. к.б.н. Королевой И. В. к.м.н. Грабовской К. Б. к.б.н. Леонтьевой Г. Ф.

Руководителю лаборатории общей иммунологии отдела иммунологии проф., д.м.н. Назарову П.Г.

ОБЩЕЕ ЗАКЛЮЧЕНИЕ.

Более 35 лет инфекции, вызываемые стрептококками группы В, остаются одними из наиболее опасных для новорожденных и их матерей. Известно, что СГВ экспрессирует разнообразные поверхностные белки, участвующие в развитии инфекционного процесса в организме хозяина. Инфекционный процесс представляет собой комплексное воздействие на организм хозяина ряда факторов патогенности микроорганизма: адгезинов, инвазинов, других агрессивных факторов. Пусковым механизмом развития инфекционного процесса является процесс адгезии микроорганизма к эпителиальным клеткам хозяина. В процессе адгезии СГВ участвуют следующие поверхностные белки: фибриноген связывающие белки (FbsA, FbsB), ламинин связывающий белок (Lmb), поверхностный иммуногенный белок (Sip), липопротеин ScaAB, лейцин богатый белок (LrrG), белок BibA, белок spBl, белки SspBl и SspB2, глутамин синтетаза (GS) и пили. Следующим этапом развития инфекционного процесса является процесс инвазии. Многие из перечисленных выше белков-адгезинов также участвуют в процессе инвазии — FbsA, FbsB, Lmb. Кроме того, в процессе инвазии принимают участие такие факторы патогенности СГВ как белки Alp семейства (а-антиген, белки Rib, R, А1р2, R28 (А1рЗ) и ß—антиген (белок Вас). В процессе пенетрации и уклонения от защитных факторов иммунной системы хозяина участвуют такие поверхностные факторы патогенности как адгезии BibA, инвазии ß—антиген, C5av пептидаза и протеаза CspA. Белок BibA обладает способностью специфически связывать С4 связывающий белок человека, который относится к классическому пути активации комплемента, а ß—антиген обладает способностью связывать IgA и фактор Н комплемента, который относится к альтернативному пути активации комплемента. С5а пептидаза и протеаза CspA обладают ферментативной активностью и способны расщеплять хемоаттрактанты организма хозяина [Santi I. 2007, Jerlstrom P.G. 1991, Takahashi S 1999, Bryan J. D 2009]. Таким образом, перечисленные выше поверхностные белковые факторы 1.

124 патогенности стрептококковой клетки, взаимодействуют с организмом на разных стадиях течения инфекционного процесса.

Одним из подходов к профилактике инфекций, вызываемых стрептококками группы В, является создание специфических вакцин, а именно, создание генно-инженерных вакцин на основе поверхностных структур СГВ. Конструирование вакцин против СГВ началось с создания препаратов на основе полисахарида капсулы [Baker С. 2003, Davies H 2001]. Вакцинные препараты на основе капсульного полисахарида хорошо переносились беременными женщинами, а специфические антитела против полисахарида длительно циркулировали в крови беременных женщин [Baker С J 1976]. Однако основными недостатками таких вакцин является большое серологическое разнообразие СГВ в мире, слабая* иммуногенность полисахаридов капсулы и тот факт, что полисахариды относятся к Т-независимым антигенам, что сказывается на отсутствии иммунологической памяти после иммунизации. Перечисленные недостатки удалось частично устранить в конъюгированных белково-полисахаридных вакцинах против СГВ [Kasper DL 1996, Paoletti LC 2001, Yang HH 2008, Мерингова ЛФ 2007, Madoff LC 1994, Yang HH 2007]. Ковалентное связывание полисахарида с белком носителем позволило увеличить иммуногенность ипротективность препаратов, но остальные недостатки препаратов на основе полисахаридов капсул сохранялись. Этим вызвано появление альтернативного подхода конструирования вакцин против СГВ — создание вакцин на основе поверхностных белковых факторов патогенности стрептококка. Как уже было описано в литературном обзоре, в настоящее время ведутся разработки вакцин на основе С5а пептидазы, белка Вас, антигена а, белков Sip, ScaAB, LrrG, PI-1, PI-2 и Sap [Cheng QB.

2001, Cheng QB'2002, Santillan D. 2008, Suvorov 2004, Yang 2007, Yang H. 2008, Martin D.

2002, Rioux S. 2001, Vorobieva, Meringova 2005, Seepersaud 2005, Maisey 2007, Rosini 2006, Santi 2008, Gourlay LJ 2009]. Критериями выбора определенного поверхностного белка в качестве компонента вакцины против СГВ являются его распространенность среди штаммов вида, консервативность, иммуногенность, протективность и безопасность. В связи с этим не все из перечисленных выше белков являются оптимальными кандидатами. Так антиген, а слабо иммуногенен и, следовательно, его необходимо сочетать с более иммуногенными белками, белок Вас присутствует только у 25−40% штаммов СГВ. Последнее означает, что моновакцина на его основе будет эффективна только против штаммов СГВ, которые экспрессируют данный белок.

Наиболее перспективным кандидатом в качестве компонента вакцины является С5а пептидаза. Известно, что ген, кодирующий С5а пептидазу, присутствует во всех штаммах СГВ и является консервативным [Takahashi S. 1999, Chmourigina I.I. 1996]. Следовательно, вакцина, созданная на основе С5а пептидазы, будет иметь широкий спектр действия против всех штаммов СГВ. Изучение различных свойств С5а пептидазы ведутся с 1991 года, т. е. с момента ее обнаружения у СГВ [Bohnsack, 1991]. С тех пор проводились исследования иммуногенных и протективных свойств рекомбинантных полипептидов соответствующих полноразмерной С5а пептидазе [Cheng 2002, Cleary РР 2004; Park HS 2005, Xue G 2010]. В перечисленных исследованиях была доказана иммуногенность С5а пептидазы и протективность антител противС5а пептидазы. Однако недостатками рекомбинантного полипептида, соответствующего полноразмерной С5а пептидазе в качестве компонента вакцины, являются наличие протеазной активности в отношении С5а фракции комплемента, а также большая молекулярная масса полипептида, затрудняющая его использование в составе поликомпонентной вакцины.

Отметим, что при конструировании рекомбинантных вакцин против СГВ на основе t поверхностных белков патогена ни один из перечисленных выше исследователей не учитывал особенности первичной и вторичной структур полноразмерной молекулы белка. В настоящее время появляются работы по созданию компонентов вакцины против СГА с учетом вторичной структуры выбранного компонента. Австралийские коллеги в работе по созданию вакцины против СГА показали, что только при наличии а-спиралей во вторичной структуре рекомбинантного полипептида на основе M белка СГА его эпитоп проявлял как иммуногенные, так и протективные свойства [Georgousakis ММ 2009]. Другая группа австралийских исследователей, также работающая над созданием вакцины против СГА, получила пять синтетических пептидов, обладающих иммуногенными свойствами, только в случае если они образовывали а-спиральные структуры [Wei Zhong 2009]. Еще одна группа ученых получила вакцинный эпитоп против СГА, размером в 55 аминокислотных остатков и содержащий 33% а-спиральных структур, способный индуцировать клеточный и гуморальный иммунные ответы [Guilherme L 2010]. Таким образом, современные вакцинные разработки направлены на конструирование полипептидов с учетом не только их первичной, но и вторичной структуры.

В представленной) диссертационной работе впервые при конструировании s рекомбинантных полипептидов на основе С5а пептидазы учитывались особенности их первичной и вторичной структур. Были получены три рекомбинантных полипептида, соответствующие трем участкам С5а пептидазы, а именно, аминокислотным остаткам с 96 по 169 (РЫа), с 496 по 570 (РЬЗа) и с 1247 по 1332 (РЬ4а). Эти участки содержали различный процент а-спиральных структур. Так, наибольшее содержание а-спиральных структур имело место в рекомбинантном полипептиде РЬЗа (41%), а наименьшее — в рекомбинантном полипептиде РЬ4а (19%). В ходе экспериментов по иммунизации лабораторных животных было продемонстрировано, что самым иммуногенным являлся полипептид РЬЗа, а полипептид РЬ4а оказался не иммуногенным. Результаты тестирования сывороток от женщин-носительниц СГВ показали наличие специфических антител в высоком титре ко всем полипептидам, кроме РЬ4а. Эти результаты свидетельствуют о том, что среди специфических антител, синтезированных ко всей стрептококковой клетке, обнаруживались антитела к полипептидам РЫа и РЬЗа. Полученные данные могут служить косвенным доказательством иммуногенности рекомбинантных полипептидов РЫа и РЬЗа. Таким образом, из трех рекомбинантных полипептидов на основе С5а пептидазы с одинаковой молекулярной массой, полипептид с наименьшим содержанием альфа-спиралей (РЬ4а) оказался не иммуногенным.

В представленном исследовании впервые в качестве перспективного кандидата в компоненты вакцины против СГВ рассмотрена и другая сериновая протеаза — CspA. Протеаза CspA была обнаружена у СГВ в 2003 году [Harris ТО 2003]. С тех пор на сайте информационного ресурса PubMed появилось только две работы, направленные на изучение свойств данной протеазы [Bryan J. D 2009, Shelver D 2008]. Обе работы посвящены исследованию ферментативных свойств CspA и связаны с определением ее вклада в патогенность СГВ. Было продемонстрировано, что протеазный домен CspA гомологичен протеазному домену С5а пептидазы на 45%, и для развития патологического процесса, вызываемого СГВ, протеаза CspA более значима, чем С5а пептидаза [Harris ТО 2003, Shelver D 2008]. Изучение иммуногенных свойств полноразмерной протеазы CspA, а тем более, иммуногенных свойств отдельных участков ее молекулы, не проводились. С целью получения доказательств о целесообразности конструирования рекомбинантных полипептидов на основе протеазы CspA в настоящей работе впервые было проведено исследование распространенности гена cspA, кодирующего протеазу CspA. Анализ коллекции, состоящей их 10 референс-штаммов и 75 клинических изолятов СГВ различных серотипов из России, Европы, США и Китая, подтвердил наличие в их хромосомной ДНК гена cspA. Анализ нуклеотидных последовательностей участков гена cspA (csp2 и csp3) 13 штаммов СГВ различных серотипов доказал их высокую консервативность (98−100%). Таким образом, проведенные исследования доказали распространенность и консервативность гена cspA среди штаммов СГВ различных серотипов. Проведенные исследования подтвердили целесообразность дальнейшего получения рекомбинантного полипептида Csp2, соответствующего участку протеазы CspA с аминокислотного остатка 139 по 506, и рекомбинантного полипептида Csp3, соответствующего аминокислотным остаткам протеазы CspA с 1247 по 1332. Данные участки на молекуле CspA были выбраны с учетом особенностей ее первичной и вторичной структуры, как и в случае с участками на молекуле С5а пептидазы. Были получены два рекомбинантных полипептида с различной молекулярной массой и разным содержанием a-спиральных структур. Так, полипептид Csp3 по молекулярной массе был в 3,5 раза меньше полипептида Csp2 и содержал в 4 раза больше a-спиральных структур чем полипептид Csp2. В ходе экспериментов по иммунизации лабораторных животных была продемонстрирована одинаковая иммуногенность полипептидов Csp2 и Csp3. Известно, что иммуногенность белка возрастает с увеличением его молекулярной массы. Таким образом, одинаковая иммуногенность Csp3 с Csp2 может быть связана с его а-спиралыюй структурой. Так, Csp3 содержит 69% a-спиралей при молекулярной массе 12 кДа, a Csp2 с молекулярной массой 42 кДа содержит 17% a-спиралей. Результаты тестирования сывороток от женщин-носительниц СГВ показали наличие специфических антител в высоком титре к обоим полипептидам. Эти результаты свидетельствуют о том, что среди специфических антител, синтезированных ко всей стрептококковой 1 клетке, обнаруживались антитела к полипептидам Csp2 и Csp3. Полученные данные также могут служить косвенным доказательством иммуногенности рекомбинантных полипептидов Csp2 и Csp3.

Таким образом, в представленной диссертационной работе показано влияние а-спиральных структур на иммуногенность рекомбинантных полипептидов. Более того, впервые изучены иммуногенные свойства различных участков С5а пептидазы и протеазы CspA.

Следующим этапом настоящего исследования стало изучение опсонизирующей активности и протективности антител к рекомбинантным полипептидам Pbla, РЬЗа, Csp2 и Csp3 в опытах in vitro и in vivo. Так как рекомбинантный полипептид РЬ4а оказался не иммуногенным, то дальнейшие исследования с ним не проводились. В ходе опсонофагоцитарного теста была доказана опсонизирующая активность антител к рекомбинантным полипептидам Pbla, РЬЗа и Csp3. Антитела к рекомбинантному полипептиду Csp2 не проявили опсонизирующей активности. Изучение протективных свойств антител к рекомбинантным полипептидам РЫа, РЬЗа, Csp2 и Csp3 проводили на мышиной модели генерализованной инфекции. Результаты проведенного эксперимента свидетельствуют о протективных свойствах антител к рекомбинантным полипептидам Pbla, РЬЗа и Csp3. Антитела к рекомбинантному полипептиду Csp2 не проявили протективной активности. Результаты опыта in vivo полностью коррелируют с результатами опсонофагоцитарного теста и доказывают протективную активность анти-Pbla, антиРЬЗа и анти-СэрЗ. Таким образом, среди антител, синтезируемых ко всем полипептидам, только антитела к рекомбинантному полипептиду Csp2, содержащему наименьшее количество а-спиралей (17%), не оказались протективными. Полученные данные свидетельствуют о влиянии a-спиральных структур полипептида на протективные свойства синтезируемых антител.

В результате проведенного исследования были получены рекомбинантные полипептиды на основе сериновых протеаз ScpB и CspA. Исследованы отдельные участки полноразмерных сериновых протеаз. Продемонстрирована широкая распространенность гена cspA, кодирующего протеазу CspA и высокая консервативность фрагментов гена cspA. Показана иммуногенность отдельных фрагментов сериновых протеаз, соответствующих рекомбинантным полипептидам. Pbla, РЬЗа, Csp2 и Csp3, а введение-рекомбинантных полипептидов, РЫа, РЬЗа и Csp3'стимулировало синтез протективных антител, что было продемонстрировано в опытах in vitro и in vivo. Показано, что введение рекомбинантных полипептидов РЬЗа, Csp2 и Csp3 обеспечивает синтез длительно циркулирующих специфических антител. На лабораторных мышах продемонстрирована безопасность и отсутствие токсичности рекомбинантных полипептидов РЬЗа и Csp3. Рекомбинантные полипептиды РЬЗа и Csp3 предложены в качестве перспективных компонентов различного типа вакцин против СГВ.

Практическая значимость настоящего исследования состоит в получении трех иммуногенных рекомбинантных полипептидов РЫа, РЬЗа и Csp3, индуцирующих синтез специфических антител с протективной активностью. Преимуществом полученных полипептидов перед полноразмерными С5а пептидазой и протеазой CspA является отсутствие у них протеазной активности, так как они были сконструированы таким образом, чтобы в их структуре не содержался каталитический центр, характерный для полноразмерных сериновых протеаз. Более того, малые размеры этих полипептидов (7385 аминокислотных остатков) открывают дополнительные перспективы их использования в составе мультивалентной вакцины против СГВ.

Так, на основе рекомбинантных полипептидов РЬЗа и Csp3 может быть создан вакцинный препарат, включающий смесь этих полипептидов. В литературе недавно появились данные о применении смеси полноразмерных рекомбинантных полипептидов Sip и ScpB в качестве интраназальной мультикомпонентной вакцины против СГВ [Xue G 2010]. Напомним, что это решение не является оптимальным, поскольку полноразмерный белок ScpB обладает ферментативной активностью в отношении С5а фракции комплемента, а свойства белка Sip плохо изучены.

Другим возможным применением полученных результатов является получение гибридного полипептида, кодируемого фрагментами рЪЗа и csp3. В результате «сшивания» фрагментов рЬЗа и csp3, клонирования их в экспрессионный вектор с последующей трансформацией в штамм Е. coli, предполагается получение штамма-продуцента гибридного полипептида, состоящего из полипептидов РЬЗа и Csp3. В настоящее время еще не получено ни одной гибридной вакцины против СГВ, однако гибридные вакцины против ряда других возбудителей активно разрабатываются и широко исследуются в мире. Среди новейших разработок представлены гибридные вакцины в качестве меры профилактики против таких заболеваний как рак простаты [Perez SA 2010], воспаление легких, вызванное Yersinia pestis [Tinker JK 2010], диарея, вызванная энтеротоксигенной кишечной палочкой [Tobias J 2010], малярия [Xue X 2010, Singh В 2010], ВИЧ [Lapelosa М 2010], энцефалит [Kenney JL 2010] и сибирская язва [Wu G 2010].

Еще одним современным направлением использования рекомбинантных иммуногенных полипептидов является создание «живой» вакцины с использованием пробиотического микроорганизма (например, Lactococcus lactis) в качестве средства доставки антигена на вагинальный эпителий беременных или женщин, планирующих беременность. Такой препарат был получен на основе белка пилей СГВ PI-1 [Buccato S 2006]. Однако, несмотря на то, что компоненты пилей долгое время рассматривались в качестве потенциальных компонентов вакцины против СГВ, вакцины на их основе не оказались эффективными, что связано с большим разнообразием белковых структур пилей в разных штаммах СГВ [Rinaudo C.D. 2009].

В результате настоящего исследования сконструированы штаммы-продуценты пяти рекомбинантных полипептидов: трех на основе С5а пептидазы и двух на основе протеазы CspA. Фундаментальная значимость работы состоит в том, что впервые в качестве вакцинных кандидатов исследованы различные участки С5а пептидазы и протеазы CspA. Доказана распространенность гена cspA и консервативность его фрагментов. Продемонстрировано, что содержание а-спиралей во вторичной структуре полипептидов влияют на их иммуногенность и протективность. В качестве перспективных кандидатов в компоненты вакцины против СГВ из пяти созданных полипептидов выбраны три полипептида (два на основе С5а пептидазы и один на основе протеазы CspA), обладающие наибольшей иммуногенностью и протективной активностью. Отобранные полипептиды отвечают всем требованиям, предъявляемым к кандидатам в компоненты вакцин. Отсутствие к настоящему времени вакцины против СГВ подчеркивает ценность проведенного исследования, открывшего перспективы создания отечественной рекомбинантной вакцины против СГВ.