Электродиффузионные градиенты концентраций ионов и их использование для разделения биологически активных веществ

Актуальность работы

В биофизике, молекулярной биологии и биохимии большое значение имеют методы фракционирования, концентрирования и идентификации веществ биологического происхождения. Многие из этих веществ являются слабыми электролитами, благодаря чему широкое распространение получили электрофоретические методы их разделения и очистки.

Для веществ цвиттер-ионной природы, прежде всего белков, особенно эффективен метод изоэлектрического фокусирования, позволяющий с высокой точностью разделять вещества на основе различия их изоэлек-трических точек (которые для белковых молекул являются практически индивидуальной характеристикой каждого вида белков). Основной трудностью этого метода является создание градиента рН, в котором проводится электрофорез разделяемых молекул.

Существует ряд методов создания градиентов рН для изоэлектрического фокусирования, но все они обладают теми или иными недостатками и ограничениями. Поэтому актуальна задача разработки новых методов создания градиентов рН для изоэлектрического фокусирования.

Для слабых электролитов не цвиттер-ионной природы также актуальна задача разработки методов их разделения, подобных изоэлектри-ческому фокусированию, то есть позволяющих фокусировать вещества в узкие, не уширяющиеся в процессе фракционирования зоны, разделяя вещества на основе их индивидуальных характеристик (таких, например, как константа диссоциации).

Цель работы

Теоретическое исследование электродиффузионных (формирующихся за счёт электромиграции и диффузии ионов электролита) градиентов концентраций ионов, в частности, градиентов рН, в неподвижной и движущейся среде. Теоретическое исследование пригодности таких градиентов в качестве градиентов рН для изоэлектрического фокусирования и возможных модификаций этого метода. Теоретическое исследование возможности электрофокусирования неамфотерных слабых электролитов.

Задачи исследования

Решение уравнений, описывающих электродиффузионные распределения концентраций ионов в неподвижной и в движущейся среде. Анализ полученных решений в аспекте пригодности этих распределений концентраций ионов в качестве градиентов рН для изоэлектрического фокусирования и его возможного аналога для неамфотерных слабых электролитов. Решение уравнений, описывающих распределение концентрации слабого электролита в среде, движущейся относительно градиента концентрации рабочих ионов. Теоретическое описание электрофокусирования слабых электролитов в среде, движущейся относительно градиента концентрации рабочих ионов. Определение необходимых и достаточных условий фокусирования.

Положения, выносимые на защиту:

1. На основе уравнений электродиффузии получены формулы, позволяющие рассчитывать форму самоформирующихся стационарных электродиффузионных градиентов концентраций ионов в неподвижной и в движущейся среде.

2. Теоретически показано, что электродиффузионные градиенты рН могут использоваться для изоэлектрического фокусирования белков и других амфотерных цвиттер-ионов.

3. Теоретически показана возможность электрофокусирования слабых электролитов в среде, движущейся относительно градиента концентрации рабочих ионов.

Научная новизна

Проведено исследование решений электродиффузионных уравнений, описывающих распределение концентраций ионов электролита в элек-трофоретической камере. Определены необходимые и достаточные условия, при которых эти уравнения имеют точное электронейтральное решение. Получено приближённое решение для случаев несоблюдения строгой электронейтральности.

Предложен способ электрофокусирования слабых электролитов в среде, движущейся относительно градиента концентрации рабочих ионов. Определены необходимые и достаточные условия фокусирования. Проведено теоретическое исследование электродиффузионных градиентов концентраций ионов, которые могут быть предложены для использования в этом методе.

Практическая значимость работы

Проведённое исследование электродиффузионных распределений концентраций ионов свидетельствует о применимости их в качестве градиентов рН для изоэлектрического фокусирования, что является вкладом в доведение до практического использования электродиффузионного метода создания градиента рН для изоэлектрического фокусирования.

Предложенный способ электрофокусирования слабых электролитов

J I может быть эффективен для разделения неамфотерных слабых электролитов биологического происхождения.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 11 статей и тезисов докладов.

Апробация работы. Основные положения диссертации были представлены на III, IV и VI Всероссийских семинарах «Моделирование неравновесных систем» (Красноярск, 2000, 2001, 2003 гг.).

Объём и структура диссертации. Диссертация состоит из введения, 4 глав, выводов и списка литературы. Материал диссертации изложен на 109 страницах машинописного текста, включая 13 рисунков и список литературы из 52 наименований.

Выводы

1. На основе системы уравнений Нернста-Планка и Пуассона исследованы стационарные электродиффузионные распределения концентраций ионов, не взаимодействующих друг с другом химически, в неподвижной среде. Найдены точные либо приближённые решения уравнений Нернста-Планка и Пуассона для значительной части случаев, интересных с точки зрения использования электродиффузионных распределений концентраций ионов для создания градиентов рН для изоэлектрического фокусирования и некоторых его модификаций.

2. Показано, что в неподвижной среде стационарные электродиффузионные распределения концентраций ионов, имеющих одинаковый заряд, тождественны и неразличимы.

3. Сформулированы необходимые и достаточные условия точной электронейтральности электродиффузионных распределений концентраций ионов в неподвижной среде. При этих условиях уравнения Нернста-Планка и Пуассона имеют точное аналитическое решение, позволяющее рассчитывать распределения концентраций ионов (градиент рН) и позволяющее сделать вывод о применимости такого градиента рН для изоэлектрического фокусирования.

4. Для случая равенства валентностей всех ионов в системе, найдено приближённое решение уравнений Нернста-Планка и Пуассона для неподвижной среды. Ему соответствует приближённое соблюдение электронейтральности в электрофоретической камере. Для этого приближённого решения показано, что при определённых граничных условиях (которые сформулированы), распределение концентраций ионов линейно, не зависит от электрического поля и свойств самих ионов, определяется только граничными условиями для их концентраций. При иных граничных условиях распределение концентраций ионов выражается нелинейной зависимостью, которая тоже приближённо найдена.

5. На основе системы уравнений Нернста-Планка (с конвекционным членом) и уравнения Пуассона исследованы стационарные электродиффузионные распределения концентраций концентраций ионов в движущейся среде (в потоке жидкости). Для случая равенства валентностей всех ионов в системе найдено приближённое решение этих уравнений, пользуясь которым можно рассчитывать распределения концентраций ионов и электрическое поле в электрофоретической камере с потоком жидкости через неё. Показано, что даже небольшие скорости течения жидкости в электрофоретической камере существенно влияют на форму стационарного электродиффузионного распределения концентраций ионов в ней.

6. На основе уравнений массопереноса слабого электролита в среде с потоком жидкости и неподвижным градиентом концентрации рабочих ионов построена и исследована математическая модель электрофокусирования слабого электролита. Построенная модель позволяет предложить метод неизоэлектрического фокусирования — электрофорез в среде, движущейся относительно градиента концентрации рабочих ионов, позволяющий осуществлять конденсирование частиц слабых электролитов с разделением их по признаку различия констант диссоциации К^.

7. Сформулированы необходимые и достаточные условия фокусирования слабого электролита, как связь между константами, характеризующими фокусируемое вещество и параметрами среды в точке фокусирования. Получены приближённые формулы, описывающие распределение концентрации сфокусированного вещества.

Ажицкий Г. Ю., Троицкий Г. В. Изоэлектрическое фокусирование в искусственном градиенте рН / Электрофоретические методы анализа белков. — Новосибирск: Наука, 1981. — С. 23−32

Ажицкий Г. Ю., Петренко В. Ф., Троицкий Г. В., Жигис Л. С. Изоэлектрическое фокусирование белков в борат-полиольной системе / Электрофоретические методы анализа белков. — Новосибирск: Наука, 1981. — С. 44−57

Ажицкий Г. Ю., Троицкий Г. В., Петренко В. Ф., Загорулько Г. В., Терещенков Н. А., Ворисенко В. Г. Изоэлектрическое фокусирование в борат-полиольных системах. Новые возможности / Молекулярная биология. Республиканский межведомственный сборник. Вып. 28. Теория и практика ультрацентрифугирования и электрофореза. — Киев, Наукова думка, 1981. — С. 63−70

Ажицкий Г. Ю., Жуков М. Ю., Король Л. Е., Троицкий Г. В., Бабский В. Г. Эволюция рН-градиента в системе борная кислота— глицерин / Молекулярная биология. Республиканский межведомственный сборник. Вып. 36. Теория и практика ультрацентрифугирования и электрофореза. — Киев, Наукова думка, 1984. — С. 51−56

5. Базов В. Асимптотические разложения решений обыкновенных дифференциальных уравнений. — М.: Мир, 1968. — 464 с.

6. Васильева А. Б., Бутузов В. Ф. Асимптотические разложения сингулярно возмущенных уравнений. — М.: Наука, 1973. — 272 с.

7. Васильева А. Б. Условно устойчивые сингулярно возмущенные системы с особенностями в граничных условиях // Дифференциальные уравнения, 1975, т. Х1, № 2 — С. 227−238

8. Васильева А. Б., Бутузов В. Ф. Асимптотические методы в теории сингулярных возмущений. — М.: Высш. школа, 1990. — 208 с.

9. Волик В. Ю., Межевикин В. В., Почекутов A.A. Электрофокусирование слабых электролитов в движущейся среде / Материалы III Всероссийского семинара «Моделирование неравновесных систем — 2000». — Красноярск: ИПЦ КГТУ, 2000. — С. 43−44

10. Волик В. Ю., Меоюевикин В. В., Почекутов A.A. Самоформирующиеся в подвижной среде градиенты концентраций ионов для электрофокусирования слабых электролитов / Материалы III Всероссийского семинара «Моделирование неравновесных систем — 2000». — Красноярск: ИПЦ КГТУ, 2000. — С. 45−46

11. Гаммет Л. Основы физической органической химии. — М.: Мир, 1972. — 536 с.

12. Голубев В. В. Лекции по аналитической теории дифференциальных уравнений. — М., 1950. — С. 151−203

13. Дамаскин Б. Б., Петрий O.A. Основы теоретической электрохимии. — М.: Высшая школа, 1978. — 239 с.

14. Духин С. СДерягин Б. В. Электрофорез. — М.: Наука, 1976. — 332 с.

•

15. Жуков М. Ю., Юдович В. И. Создание рН-градиента в растворе с помощью амфолитов-носителей / Молекулярная биология. Республиканский межведомственный сборник. Вып. 28. Теория и практика ультрацентрифугирования и электрофореза. — Киев, Наукова думка, 1981. — С. 70−74

16. Зайцев В. Ф., Полянин А. Д. Справочник по обыкновенным дифференциальным уравнениям. — М.: Физматлит, 2001. — С. 347−348

17. Камке Э. Справочник по обыкновенным дифференциальным уравнениям. — М.: Гос. изд-во физ.-мат. литературы, 1961. — С. 569−570

18. Корыта Я., Дворэ/сак И., Вогачкова В. Электрохимия. — М.: Мир, 1977. — 472 с. г 19. Лазарев А. И., Волконский JI.H. Прибор для изоэлектрического фокусирования в борат-полиольных буферных растворах / Моле* кулярная биология. Республиканский межведомственный сборник. Вып. 36. Теория и практика ультрацентрифугирования и электрофореза. — Киев, Наукова думка, 1984. — С. 57−59

20. Малер Г., Кордес Ю. Основы биологической химии. — М.: Мир, 1970. — 567 с.

21. Маргулис Б. А. Изоэлектрическое фокусирование в полиакрил амид-ном геле / Электрофоретические методы анализа белков. — Новосибирск: Наука, 1981. — С. 33−44

22. Межевикин В. В., Почекутов А. А. Электродиффузионные градиенты рН для изоэлектрического фокусирования / Материалы III

Всероссийского семинара «Моделирование неравновесных систем — 2000». — Красноярск: ИПЦ КГТУ, 2000. — С. 154−155

23. Межевикип В. В., Почекутов A.A., Рузанова JI.H. Электродиффузионные градиенты pH для изоэлектрического фокусирования белков // Доклады РАН, 2001, т.377, № 3 — С. 406−407

24. Межевикин В. В., Почекутов A.A. Электрофокусирование слабых электролитов, не являющихся цвиттер-ионами, в потоке / Материалы VI Всероссийского семинара «Моделирование неравновесных систем — 2003». — Красноярск: ИПЦ КГТУ, 2003.

25. Меэюевикин В. В., Волик В. Ю., Почекутов A.A. Электрофокусирование слабых электролитов в движущейся среде // Доклады РАН, 2001, т.377, № 4 — С. 556−558

26. Межевикин В. В., Волик В. Ю., Почекутов A.A. Самоформирующи-сся в потоке электродиффузионные градиенты концентраций ионов для электрофокусирования слабых электролитов // Доклады РАН, 2003, т.388, № 2 — С. 262−264

27. Мурель А. П. Синтез и свойства амфолитов-носителей / Элек-трофоретические методы анализа белков. — Новосибирск: Наука, 1981. — С. 106−113

28. Новиков Г. И. Основы общей химии. — М.: Высшая школа, 1988. — 431 с.

29. Ныомеп Дж. Электрохимические системы. — М.: Мир, 1977. — 464 с.

30. Остерман Л. А. Исследование биологических макромолекул электрофокусированием, иммуноэлектрофорезом и радиоизотопными методами. — М.: Наука, 1983. — С. 3−80

31. Почекутов A.A. Электродиффузионные градиенты концентраций ионов для изоэлектрического фокусирования / Материалы XXXVIII Международной научной студенческой конференции «Студент и научно-технический прогресс» :Физика, ч.2. — Новосибирск: НГУ, 2000. — С. 23−24

32. Почекутов A.A. Электрофокусирование в подвижной среде / Материалы XXXVIII Международной научной студенческой конференции «Студент и научно-технический прогресс»: Физика, ч.2. — Новосибирск: НГУ, 2000. — С. 24−25

33. Почекутов A.A., Меясевикин В. В. Электродиффузионные градиенты концентраций ионов, приближенное решение / Материалы IV Всероссийского семинара «Моделирование неравновесных систем — 2001». — Красноярск: ИПЦ КГТУ, 2001. — С. 122−123

34. Почекутов A.A., Межевикин В. В. Исследование формы электродиффузионных градиентов концентраций ионов, не взаимодействующих химически / Материалы VI Всероссийского семинара «Моделирование неравновесных систем — 2003». — Красноярск: ИВМ СО РАН, 2003. — С. 135−136

35. Ригетти П. Изоэлектрическое фокусирование: Теория, методы и применение. — М.: Мир, 1986. — 398 с.

36. Ригли К. В. Электрофокусирование белков / Новые методы анализа аминокислот, пептидов и белков. — М.: Мир, 1974. — С. 297−343

37. Романовский Ю. М., Степанова Н. В., Чернавский Д. С. Математическое моделирование в биофизике. — М.: Наука, 1975. — С. 30−35.

38. Степанов В. М. Молекулярная биология. Структура и функции белков. — М.: Высшая школа, 1996. — С. 8−12.

39. Троицкий Г. В. Электрофорез белков. — Харьков, Изд-во Харьковского государственного университета, 1962. — 324 с.

40. Троицкий Г. В., Завьялов В. П., Абрамов В. М. Создание устойчивого градиента рН в смеси буферный раствор — неэлектролит. Использование этой системы для изоэлектрофокусирования альбумина и гемоглобина // Доклады АН СССР, 1974, т.24, № 4 — С. 955−958

41. Троицкий Г. В. Особенности различных методов изоэлектрического фокусирования. Теоретические аспекты / Молекулярная биология. Республиканский межведомственный сборник. Вып. 28. Теория и практика ультрацентрифугирования и электрофореза. — Киев, На-укова думка, 1981. — С. 57−63

42. Троицкий Г. В., Ажицкий Г. Ю. Борат-полиольный рН-градиент. Теоретические основы и применение для изоэлектрического фокусирования белков // Биоорганическая химия, 1982, т.8, № 6 — С.863−871

43. Троицкий Г. В., Ажицкий Г. Ю. Изоэлектрическое фокусирование белков в самоорганизующихся и искусственных рН-градиентах. — Киев, Наукова думка, 1984. — 219 с.

44. Чат Р. Физическая химия с биологическими приложениями. — М.: Мир, 1980. — С. 422−455.

45. Hagiund H. Isoelectric Focusing in pH Gradients — A Technique for Fractionation and Characterization of Ampholytes. — Methods of Biochemical Analysis., 1971. V.19 — 104 p.

46. Huang Z., Ivory C.F. Digitally Electrophoretic Focusing Techiques // Analytical Chemistry, 1999, 71(8)

47. Ivory C.F. A Brief Review of Alternative Electrofocusing Techiques // Separation Science and Technology, 2000, 35(11) — pp.1777−1793

48. Luner S.J., Oaks S., Kolin A. Isoelectric Focusing and Fractionation Ampholytes in Thermally Engendered pH Gradients. United States Patent 3 664 939, May 23, 1972.

49. Pollack S. Isoelectric Focusing without Ampholyte // Biochemical and Biophysical Research Communications, 1979, V.87, 4 — pp.1252−1255

50. Righetti P.G., Dossi A. Isoelectric focusing of proteins and peptides in gel slabs and in capillaries // Analytica Chimica Acta, 1998, V.372, pp.1−19

51. Svensson H. Isoelectric Fractionation, Analysis, and Characterization of Ampholytes in Natural pH Gradients. I. The Differential Equation of Solute Concentrations at a Steady State and its Solution for Simple Cases // Acta Chemica Scandinavica. — 1961. V.15, JVf9 2 — pp.325−341

52. Vesterberg 0. Synthesys and isoelectric fractionation of carrier ampholytes // Acta Chemica Scandinavica, 1969, V.23, № 11 — pp.26 532 666