Изучение свойств реакционных центров пурпурной бактерии Rhodobacter sphaeroides с измененным белковым окружением мономерного бактериохлорофилла BA

Актуальность темы

исследования.

Фотосинтез является уникальным биосферным процессом, в ходе которого происходит превращение и запасание энергии света в энергию химических связей органических соединений, необходимых для жизнедеятельности большинства организмов Земли. Первичное преобразование поглощенной фотосинтетическими пигментами световой энергии в энергию разделенных зарядов протекает в мембранных белках — реакционных центрах (РЦ) фототрофных организмов, где происходит первичный перенос электрона между кофакторами с образованием трансмембранного потенциала. Квантовая эффективность начальных этапов фотосинтеза, составляющая почти 100%, очевидно, достигается путем тонкой регулировки свойств кофакторов за счет их взаимодействий друг с другом и с окружающим белком.

Исследования РЦ пурпурных аноксигенных бактерий имеют большое значение для понимания принципов и механизмов преобразования энергии при фотосинтезе. Аминокислотная последовательность белков и кристаллографическая структура бактериальных реакционных центров известна с середины 80-х годов XX века [Deisenhofer et al., 1984; Youvan et al., 1984aMichel et al., 1985; 1986а]. Хорошо охарактеризованные бактериальные РЦ многие годы служат структурной и функциональной моделью для исследования более сложно организованной фотосистемы 2 зеленых растений и водорослей. РЦ пурпурных бактерий обладают рядом свойств, делающих их удобным объектом исследований. Среди них можно отметить сравнительную фотои термостабильность, относительно простую организацию, спектральное разрешение полос поглощения отдельных кофакторов, наличие разработанных методов генетической и химической модификации, позволяющих манипулировать составом и свойствами кофакторов.

Фотосинтетический РЦ пурпурной бактерии Rhodobacter (Rba.) sphaeroides представляет собой трансмембранный пигмент-белковый комплекс, состоящий из трех субъединиц белка и 10 кофакторов, образующих две структурно-функциональные ветви. Каждая ветвь начинается с димера бактериохлорофиллов (БХл) Р, проходит через молекулы мономерного БХл, бактериофеофитина (БФео), и убихинона. Димер БХл выполняет функцию первичного донора электрона. Перенос электрона в нативных РЦ осуществляется по одной, так называемой А-ветви.

Детальный молекулярный механизм начальной стадии разделения зарядов в бактериальных РЦ остается объектом пристального внимания. До последнего времени активно 7 обсуждалась роль мономерного бактериохлорофилла активной ветви переноса электрона Вд и факторов, определяющих направленность электронного транспорта. Ранее были предложены две гипотезы переноса электрона от первичного донора Р на бактериофеофи-тин Нд — по механизму супер-обмена, без непосредственного участия БХл Ва [Martin et al, 1986; Bixon et al., 1989], и двустадийный последовательный перенос с образованием промежуточной радикальной пары Р+Вд [Shuvalov et al., 1978]. В процессе исследования на-тивных и феофитин-замещенных РЦ Rba. sphaeroides методом фемтосекундной спектроскопии была зарегистрирована полоса при 1020 нм, соответствующая поглощению анион-радикала ВА~, что свидетельствует в пользу второй гипотезы [Arlt et al., 1993; Kennis et al., 1997].

Использование сайт-направленного мутагенеза, позволяющего селективно замещать отдельные аминокислотные остатки в сайтах связывания хромофоров, дает уникальные возможности для исследования начальных стадий фотопереноса электрона в РЦ и роли отдельных пигментных кофакторов и аминокислотных остатков в этом процессе.

Цели и задачи исследования.

Целью работы являлось исследование влияния ближайшего белкового окружения первичного акцептора электрона бактериохлорофилла Вд на его спектральные свойства и процессы разделения зарядов в реакционных центрах пурпурной бактерии Rhodobacter sphaeroides.

Были поставлены следующие задачи:

1. Внесение сайт-направленных мутаций и получение штаммов Rba. sphaeroides с аминокислотными замещениями в L-субъединице реакционного центра: H (L153)C, H (L153)L, H (L153)M, H (L153)Y и Y (L128)Hв М-субъединице: H (M182)L, а также с двойным замещением H (L153)Y+H (M182)L.

2. Выделение стабильных генетически-модифицированных реакционных центров, исследование их спектральных свойств и функциональной активности.

3. Исследование нестабильных мутантных РЦ в составе фотосинтетических мембран. Изучение их пигментного состава и фотохимической активности.

Научная новизна и практическая значимость работы.

Впервые получены мутантные штаммы Rba. sphaeroides, содержащие реакционные центры с одиночными аминокислотными замещениями гистидина в позиции L153 на ци-стеин и метионин, а также с двойным замещением, гистидина L153 на тирозин и гистидина Ml 82 на лейцин.

Впервые показано, что замещение гистидина L153 на тирозин в реакционном центре Rba. sphaeroides приводит к потере мономерного БХл активной цепи кофакторов переноса электрона, сопровождающейся уменьшением стабильности пигмент-белкового комплекса. Впервые исследован процесс переноса электрона в мембрановстроенных му-тантных реакционных центрах без первичного акцептора электрона. Методом лазерной спектроскопии с фемтосекундным временным разрешением установлено, что переноса электрона в РЦ H (L153)Y с восстановленным хиноном QA не происходит, наблюдается лишь релаксация возбужденного состояния специальной пары Р* в основное состояние. Показано значительное замедление скорости электронного транспорта в мутантном РЦ и десятикатное снижение квантового выхода образования состояния с разделенными зарядами P+Qa~. Выявлено, что такой квантовой эффективности недостаточно для фотосинтетического роста бактерии.

Показано, что дополнительная к H (L153)Y замена гистидина Ml 82 на лейцин, приводящая к замещению бактериохлорофилла Вв молекулой бактериофеофитина Фв, инициирует быстрый перенос электрона с Р* на молекулу Фв за —3,5 пс с последующей рекомбинацией в основное состояние за 180 пс. Наблюдалось полное подавление переноса электрона в А-цепь в РЦ двойного мутанта.

В исследованиях реакционных центров с замещением тирозина L128 на гистидин, которое приводит к образованию водородной связи между аминокислотным остатком и БХл ВА, методом спектроскопии с фемтосекундным временным разрешением впервые наблюдался сдвиг полосы поглощения 1020 нм до 1035 нм, подтверждающий, что данная полоса принадлежит анион-радикалу первичного акцептора электрона Вд~.

Полученные данные о значимости первичного акцептора электрона и его ближайшего окружения для фотосинтетического электронного транспорта в бактериальных реакционных центрах важны с точки зрения разработки высокоэффективных искусственных систем для преобразования солнечной энергии.

Апробация работы.

Основные положения работы изложены на: International Meeting «Photosynthesis in the post-genomic era: structure and function of photosystems» (Пущино, 2006), 5-м Съезде Российского фотобиологического сообщества и Международной конференции «Преобразование света при фотосинтезе» (Пущино, 2008), 15th European Bioenergetics Conference (Дублин, 2008), XIX Пущинских чтениях по фотосинтезу и Всероссийской конференции «Фотохимия хлорофилла в модельных и природных системах» (Пущино, 2009), 15th International Congress of Photosynthesis (Пекин, 2010), XXII Симпозиуме «Современная химическая физика» (п. Шепси, 2010), International Meeting «Photosynthesis Research for Sustain-ability» (Баку, 2011), VI Съезде Российского фотобиологического общества (п. Шепси, 2011), Школе-конференции молодых учёных «Биосистема: от теории к практике», (Пущино, 2012) и ряде других конференций молодых ученых.

Публикации.

По теме диссертационной работы опубликовано 24 печатных работы, из которых четыре — в реферируемых журналах из списка ВАК РФ, в том числе одна — в иностранном.

1. Abresch, E.C., Gong, X.-M., Paddock, M.L., and Okamura M.Y. (2009) Electron transfer from cytochrome C2 to reaction center: A transition state model for ionic strength effects due to neutral mutations. Biochemistry, 48, 11 390−11 398.

2. Alden, R.G., Parson, W.W., Chu, Z.T., and Warshel, A. (1996) Orientation of the OH dipole of tyrosine (M)210 and its effect on electrostatic energies in photosynthetic bacterial reaction centers. J. Phys. Chem., 100, 16 761−16 770.

3. Allen, J.P., and Williams, J.C. (1998) Photosynthetic reaction centers. FEBS Lett., 438, 5−9.

4. Allen, J.P., Feher, G., Yeates, T.O., Komiya, H., and Rees, D.C. (1987) Structure of the reaction center from Rhodobacter sphaeroides R-26: the cofactors. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84,5730−5734.

5. Allen, J.P., Feher, G., Yeates, T.O., Komiya, H., and Rees, D.C. (1988) Structure of the reaction center from Rhodobacter sphaeroides R-26: Protein-cofactor (quinones and Fe2+) interactions. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85(22), 8487−8491.

6. Arlt, T., Schmidt, S., Kaiser, W., Lauterwasser, C., Meyer, M., Scheer, H., and Zinth, W. (1993) The accessory bacteriochlorophyll: A real electron carrier in primary photosynthesis. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90, 11 757−11 761.

7. Axelrod, H.L., Abresch, E.C., Okamura, M.Y., Yeh, A.P., Rees, D.C., and Feher, G. (2002) X-ray structure determination of the cytochrome C2: reaction center electron transfer complex from Rhodobacter sphaeroides. J. Mol. Biol., 319, 501−515.