Электростатические поля вокруг биологических макромолекул как факторы молекулярного узнавания

Электростатическое поле белковой молекулы является одной из ее важнейших функциональных характеристик, часто определяющей скорость образования, конфигурацию и стабильность комплексов белков [1−6].

Долгое время считалось, что электростатика слабо влияет на взаимодействия белков в воде. Это мнение основано на превалирующем вкладе энтропийного фактора в термодинамику связывания белков, что традиционно интерпретируется как превалирующая роль гидрофобных взаимодействий [7]. Действительно, если взаимодействие гидрофобное, то основной вклад в его свободную энергию внесет энтропийный член [8]. Однако обратное, вообще говоря, неверно. Известно [9], что энергия электростатического поля не только в вакууме, но и в диэлектрике может быть целиком использована для совершения системой работы. Поэтому она вносит аддитивный вклад в свободную энергию, а не только в энтальпию. При этом энтальпийный и энтропийный вклады определяются зависимостями диэлектрической проницаемости среды от температуры, а именно, они пропорциональны производным <�ЦеТ)1с1Т и с1 е! йТсоответственно [10]. Вода же, вещество аномальное во многих отношениях, аномальна и как диэлектрическая среда, а именно её диэлектрическая проницаемость обратно пропорциональна температуре. Поэтому электростатические взаимодействия в водной среде, точно так же, как и гидрофобные, в значительной мере имеют энтропийную природу, и утверждение в первом предложении этого абзаца оказывается необоснованным. Имеются и примеры доказанного решающего вклада электростатики в свободную энергию комплексообразования белков. В частности, это касается белков-переносчиков электрона [11,12].

Взаимодействие же белков с нуклеиновыми кислотами имеет электростатическую природу уже потому, что нуклеиновые кислоты являются полианионоами.

Укажем свойства электростатических взаимодействий, определяющие их ключевую роль в молекулярном узнавании. Во-первых, это наличие у электростатических зарядов знака, который вносит ключевой вклад в специфичность взаимодействия. Во-вторых, это неустойчивость любых систем электростатических зарядов (теорема Ирншоу), предопределяющая способность этих систем к развитию во времени. В-третьих, это уже указанное дальнодействие, исключающее нежелательные (например, приводящие к агрегации) межмолекулярные контакты и способствующие физиологически значимым уже при подходе молекул друг к другу, ещё до образования межмолекулярного контакта.

Поскольку речь в работе идёт о межмолекулярном взаимодействии и узнавании, мы ограничимся рассмотрением-роли электростатики во взаимодействиях белков и нуклеиновых кислот, т. е. будет рассмотрена роль электростатического поля за пределами биомолекул в реакциях с их участием. При этом для анализа электростатических полей выбирается максимальное расстояние, при котором энергии электростатического поля значимы по сравнению с энергией теплового движения, примерно 5 А от молекулярной поверхности. На меньших же расстояниях действуют, помимо электростатических, и другие не менее значительные силы, например, лондоновские и обменные.

Как известно, электростатический потенциал вокруг белковой молекулы определяется в основном зарядами ионизирующихся в нейтральной среде боковых групп следующих аминокислот: катионных — лизина и аргинина и анионных — глутаминовой и аспарагиновой кислот. Поэтому следующим г вопросом, рассматриваемым в настоящей работе, является пространственный масштаб специфичности электростатических потенциалов биомакромолекул. До представленных в настоящей работе исследований преобладало представление о необходимости строгой комплементарности распределений зарядов белков по принципу «одна положительно заряженная аминокислота на одну отрицательно заряженную» для обеспечения белковой системой биологической функции, сделанное в работе [13] на примере взаимодействия цитохрома С с редокс-партнерами — оксидазой и редуктазой. В настоящей работе будет показано, что именно для этих систем это неверно, так же как и для других систем, например цитохром С — цитохром Bs.

Целью работы было определить, какие именно характеристики электростатических полей вокруг макромолекул определяют вклад электростатических сил в молекулярное узнавание белками других белков и ДНК. В работе было выдвинуто и доказано предположение, что такими характеристиками являются односвязные области положительного и отрицательного потенциала — так называемые лоскуты (в англоязычной литературе patchesв топологииэто односвязная область, ограниченная замкнутой кривой, в молекулярной биологии — область поверхности белка), и были исследованы их связи со структурой, функцией и эволюцией белков. Более того, лосукты электростатического поля, в случае, если они выполняют одну и ту же функцию, например связывание с ДНК либо кофактором, почти идентичны (инвариантны) по положению на поверхности белка, размеру и форме даже у очень непохожих по аминокислотной последовательности белков. Кроме того, исследованы электростатические потенциалы вокруг нуклеиновых кислот, где также обнаружены электростатические лоскуты.

В диссертации были поставлены следующие задачи:

1) Изучить зависимость электростатических потенциалов и полей белков от геометрической формы диэлектрической границы между молекулой и растворителем, а также дисперсии диэлектрической проницаемости растворителя.

2) Определить эффективные размеры и заряды белков, рассматриваемых как однородно заряженные частицы, из экспериментальных значений аффиностей и скоростей их комплексообразования при разных ионных силах.

3) Вычислить распределения электростатического потенциала вокруг белков и сравнить их с определенными из задачи 2) параметрами.

4) Сравнить распределения электростатического потенциала в нескольких семействах белков, определить инвариантные области (лоскуты) потенциала внутри каждого из семейств и исследовать инвариантность образующих эти лоскуты заряженных аминокислот.

5) Вычислить и сравнить электростатические потенциалы промоторных ДНК, изучить их вклады в ДНК-белковое узнавание в зависимости от степени конденсации противоионов.

6) Исследовать роль электростатических потенциалов ДНК в ДНК-белковом узнавании, включая и стадию формирования атом-атомных ДНК-белковых контактов.

7) Вычислить электростатические потенциалы транспортных РНК, оценить величины конденсации противоионов на поверхности тРНК и влияние поля тРНК на заряды гистидиновых*остатков аминоацил-тРНК синтета-зы при ее связывании с тРНК.

8) Изучить, насколько электростатическое поле сильно заряженного полимера может изменить скорость взаимодействия присоединенного к полимеру фермента с ингибитором, заряженным противоположно по отношению к полимеру.

Таким образом, две рассмотренные в настоящей работе биохимические реакции относятся к ферментативным — реакция трипсина с ингибитором и супероксид-дисмутазная реакция, четыре — к реакциям межбелкового переноса электрона — реакции цитохрома С с оксидазой, редуктазой, цитохромом В5, перенос электрона с белка-кофактора на цитохром Р450 и две — ко взаимодействию ДНК-связывающих белков с ДНК — бактериальных сигма-факторов и эукариотических гомеодоменов. Заметим, что перенос электрона на цитохром Р450 и взаимодействие указанных ДНК-связывающих белков с ДНК являются компонентами монооксигенации субстратов и РНК-полимеразной реакции соответственно, так что эти реакции тоже можно считать ферментативными.

Для трех рассмотренных классов белков имеется большое количество экспериментальных данных по роли электростатики в их функционировании, что и предопределило их выбор в качестве объектов исследования настоящей в работы. Что касается нуклеиновых кислот, то были выбраны промоторные ДНК, являющиеся физиологическими партнерами рассмотренных ДНК-связывающих белков, и транспортные РНК^из-за их необычного сочетания большого заряда и геометрической формы, более близкой к белку, чем к регулярным нуклеиновым кислотам.

Научная новизна и значимость работы заключается в том, что лоскуты электростатического потенциала впервые введены здесь как параметры молекулярного узнавания на характерных расстояниях около 5 А от молекулярной поверхности биомакромолекул. Эти расстояния относятся к чисто электростатической стадии молекулярного узнавания. Они задаются границей второй гидратной оболочки (~5 А), дебаевским радиусом экранирования при физиологической ионной силе (8 А от зарядов) и бьёррумовой длиной при низкой ионной силе (7 А) — расстоянием, на котором два элементарных заряда в воде взаимодействуют с энергией, равной энергии теплового движения.

Эти расстояния обусловлены также тем, что уравнение Пуассона-Больцмана теряет смысл из-за флуктуаций противоионов и молекул воды и корреляций в их взаимных положениях, а также квантовых эффектов [2,14]. На расстояниях же, больших 5−7 А, энергия электростатического поля становится сопоставимой с энергией теплового движения, и поле не может вносить существенного вклада в узнавание. До настоящей работы в биологической литературе подобные лоскуты вычислялись непосредственно на молекулярной поверхности белков [15,16], но из-за неопределенностей, вносимых указанными эффектами, трактовать их физико-химическую природу не удавалось.

Кроме того, в рамках работы разработан высокоэффективный вариант многосеточного конечно-разностного метода для расчета электростатических потенциалов не только глобулярных (цитохромы, ДНК-связывающие белки), но и протяженных структур, например вытянутых (промоторные ДНК) и сплющенных (мембраны, тРНК).

Основными положениями, выносимыми на защиту, являются:

1) Наличие характеристического параметра поля вокруг макромолекулы — электростатического лоскута, важного для межмолекулярного узнавания.

2) Инвариантность размера, формы и положения электростатических лоскутов в семействах белков даже при отсутствии инвариантности в их первичных структурах заряженных аминокислот, образующих лоскуты, и следующая отсюда эволюционная обусловленность электростатических потенциалов белков.

3) Анизотропия электростатическихпотенциалов промоторных ДНК в направлении, перпендикулярном оси спирали ДНК, отличающая не только промоторные ДНК от периодических, но и промоторы один от другого, а также участки промоторов друг от друга.

4) Двойственность функции фосфатов ДНК при образовании атом-атомных контактов в системе гомеодомен-ДНК: образование электростатического лоскута и нейтрализация зарядов фосфатов ДНК лизиновыми и аргининовыми остатками белка в интерфейсе ДНК-белковых комплексов.

5) Почти полное отсутствие конденсации противоионов на транспортных РНК в отличие от двуспиральных ДНК из-за различия в их геометрии. Как следствие, дополнительная индукция электростатическим полем тРНК зарядов на аминоацил-тРНК синтетазе посредством ионизации ее гистидинов для специфичности и надёжности узнавания.

Практическая значимость настоящей работы обусловлена необходимостью понимания механизмов электростатических взаимодействий белков и нуклеиновых кислот для создания белков с заранее заданными свойствами. Это особенно касается иммобилизации белков, лежащей в основе биосенсорных технологий. В частности, был выполнен расчёт электростатических взаимодействий, обеспечивающих ускорение реакции фермента трипсина с его ингибитором путём иммобилизации трипсина на поликатионной матрице. Результаты этого расчёта подтвердились экспериментально — константу скорости удалось увеличить более чем**на два порядка. Выполненное в настоящей работе моделирование электростатических взаимодействий белков и нуклеиновых кислот составляет основу предсказаний свойств нековалентно иммобилизованных белков, являясь тем самым одним из направлений в новой междисциплинарной области науки — вычислительной бионанотехнологии.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

Способы определения вкладов рассчитываемых электростатических параметров в биомолекулярное узнавание. В нескольких разделах настоящего обзора изложены имеющиеся в литературе экспериментальные данные по скоростям специфических взаимодействий с участием рассматриваемых биополимеров и аффинностям образующихся при этом комплексов, с учетом структурных аспектов рассматриваемых процессов узнавания. В настоящем разделе описывается связь этих данных с вычисляемыми электростатическими характеристиками белков. Сами же методы расчета этих характеристик явились предметом нескольких исчерпывающих обзоров [1−6], поэтому будут упомянуты в диссертации лишь вкратце, при обсуждении результатов. Система трипсин — соевый ингибитор трипсина (Глава 1 результатов и обсуждения), в настоящей диссертации используется лишь для оценки влияния поля ковалентно пришитого заряженного полимера на белок-белковое узнавание в этой системе. Поскольку поле использованного полимера заведомо превосходит по напряжённости поля обоих белков, особенности последних в настоящей диссертации не рассматриваются, и соответствующие литературные данные в настоящий обзор не вошли. Что касается цитохромов Р450, исчерпывающий обзор структурных и электростатических аспектов их взаимодействия с редокс-партнерами сделан в [17], а проведенный диссертантом литературный поиск показал, что данные этого обзора не устарели.

Для получения основных результатов настоящей диссертации принципиально важны способы сопоставления рассчитываемых электростатических параметров (потенциалов, энергий взаимодействия и т. п.) с экспериментально наблюдаемыми величинами, характеризующими молекулярное узнавание. Ими здесь являются константы скорости и равновесные константы реакций с участием белков электронного транспорта, ферментов и нуклеиновых кислот. ж.

Выбор способа сопоставления теоретических расчетов с экспериментальными данными определяется тем, является ли рассматриваемая реакция диффузионно-контролируемой или активационно-контролируемой. В первом случае аналитическое выражение для константы скорости удается получить лишь для однородно заряженных сферических молекул путем решения уравнения Фика с соответствующими граничными условиями [18,19]. Для белков же характерна асимметрия распределения заряда, а для многих ферментов — еще и весьма далекая от сферичной геометрическая форма. Для.

— с этих случаев разработан метод броуновской динамики (Brownian Dynamics, BD), который представляет собой имитацию траекторий относительного движения двух белков согласно уравнению Ланжевена, причем на каждом шаге траектории к смещению добавляется случайный член, воспроизводящий коэффициенты диффузии белков, и таким образом моделирующий броуновское движение. При BD-моделировании скорости переноса электрона важно принять критерий определения той точки этой траектории, в которой происходит перенос электрона. Подробное изложение метода можно найти в работах [20,21], где он применен к супероксид-дисмутазной реакции.

Метод броуновской динамики применен к моделированию суммарного процесса взаимодействия Cyt С — Cyt В5, включающий и ассоциацию белков, и перенос электрона [22], причем были использованы два подхода: 1) модель порогового расстояния, в которой было принято, что перенос электрона происходит мгновенно при достижении белками определенных ориентаций, характеризуемых межгемовыми расстояниями и двугранными углами, и.

2) модель экспоненциальной реактивности, в которой вероятность переноса электрона зависела от расстояния между краями гемов экспоненциально:

Аге1=?°ех р (-да (1) где Я — расстояние между краями гемов, кл и к^ - мономолекулярные константы скорости переноса электрона для данного расстояния и для непосредственного контакта гемов, соответственно.

Выбор между этими двумя моделями непосредственно связан с предположением о том, какая из стадий процесса является лимитирующей. В то время как для модели порогового расстояния реакция является полностью диффузионно-контролируемой, модель экспоненциальной реактивности учитывает соотношение между временем жизни т.н.комплекса столкновения (то есть чисто электростатического комплекса, еще не специфичного по атом-атомным контактам) и характерного времени переноса электрона. Тогда модель оказывается промежуточной между диффузионно-контролируемой и недиффузионно-контролируемой (активационно-контролируемой) реакцией.

Теоретические подходы, основанные на теории активированного комплекса, были разработаны с целью описать влияние ионной силы на скорость окислительно-восстановительных реакций между белками [23]. В этих работах показано, что уравнения, вытекающие из тёЬрий Бренстеда-Дебая-Хюккеля или Маркуса хорошо описывают взаимодействие между малыми молекулами, а в ряде случаев и реакции между малыми молекулами и белками, а также белок-белковые взаимодействия.

Принципиальное отличие между подходами, исходящими из двух упомянутых теорий, заключается в том, что в первом исходят из теории активированного комплекса независимо от типа протекающей реакции, а во втором используется специфика реакций переноса электрона, в которых по теории Маркуса электростатическая составляющая константы скорости определяется энергией парного электростатического взаимодействия.

В первом подходе используется соотношение Бренстеда-Бьеррума, связывающее константу скорости к любой реакции в растворе с коэффициентами активности реагентов /у,/г и активного комплекса /12: где ко — константа скорости при бесконечном разбавлении (нулевой ионной силе). В случае реакции переноса электрона между белками активным комплексом будет комплекс этих белков с достаточно высокой вероятностью переноса электрона между их редокс-центрами. При повышении ионной силы происходит усиление взаимодействия белка-реагента или комплекса со своей ионной атмосферой, что и выражается соответствующим уменьшением коэффициента активности: к = к0/½ //12.

2).

1п/,=.

3).

Яя?0еквТ (+кИ,) где — заряд частицы (белка или комплекса), е — заряд электрона, квыраженный в А" 1 обратный дебаевский радиус, равный 0.329 /|/2,1 — ионная сила, Л, — - радиус частицы, ¿-о — диэлектрическая проницаемость вакуума, едиэлектрическая константа растворителя, кв — постоянная Больцмана, Т-абсолютная температура.

Здесь и молекулы белка, и их комплекс представлены непроницаемыми для растворителя сферами с однородным распределением заряда на поверхностях. Заметим, что, поскольку во взаимодействии заряда белка с противоионами играет роль только поле вне белка, такое представление в силу симметрии и по теореме Гаусса эквивалентно точечным зарядам в центрах сфер. Величину этого заряда обычно рассчитывают, исходя из зарядов аминокислотных остатков при данном рН, или оценивают экспериментально из данных потенциометрического титрования и сравнивают с величинами, полученными из тех же кривых, описывающих зависимость скорости реакции от ионной силы. При этом зависимость константы скорости реакции от ионной силы будет описываться при /<0.1 уравнением Бренстеда-Дебая-Хюккеля:

2 Г -72 ГГ7, Г7 ч2 Л 1п&-0 +.

8тг£0 еквТ.

1 + I+аЯ2 1 + кК где к — константа скорости для данной ионной силы / (и, соответственно, для данного к), -/?ь — радиусы взаимодействующих частиц, 2,2гих заряды. Радиус активированного комплекса В. обычно принимают равным.

Многие авторы пользуются упрощенным вариантом уравнения (4), принимая, что переходный комплекс и реагирующие ионы имеют одинаковый радиус, Я1=Я2=Я, что вполне справедливо для малых молекул, и получают выражение.

При очень низкой ионной силе (к/?с1) зависимость 1п к от 1 т становится линейной:

1пА: = 1пЛь + 2.34 2{1гГ.

4/2.

5а).

Разные варианты уравнения (5) применяются без всяких к тому оснований также и к белкам и в ряде случаев хорошо описывают экспериментальные данные. Причина, видимо, заключается в том, что в этом уравнении правая часть является функцией не более одной переменной размерности длины, и, следовательно, уравнение описывает по существу энергию парного электростатического взаимодействия заряженных частиц в растворе, то есть принадлежит к методам второй группы.

Во второй группе методов наиболее простым является уравнение Веланда-Грэя [23], использующее выражение теории Дебая-Хюккеля для расчета парного взаимодействия однородно заряженных сферических частиц в диапазоне /0−0.3. В нем, в отличие от уравнений первой группы (4−5), параметром является константа скорости при бесконечной ионной силе (&"):

Ък = пк&bdquo—-^^.

8 тг?0?квТ (К1+К2).

2 С 0~"*г Л.

6).

1+Л/?, +КЯ2;

Уравнение (6) широко используется для описания зависимостей от ионной силы в реакциях переноса электрона с участием белков. При изучении взаимодействия Су1 С с Су1 В5 было показано [23], что близкая к линейной.

I м зависимость 1п к от / хорошо описывается уравнением (6) в диапазоне /=0.05−2.5 только при значениях Я=Я2-К=2 А и 22г=-1, что не соответствует ни полным зарядам, ни радиусам реагирующих молекул. Авторы предположили комплементарные взаимодействия заряженных групп в комплексе переноса электрона и предложили, следуя подходу Веланда-Грея, уравнение.

1пк = ъкх +3.576/1 6ХР ((7) где п — число комплементарных взаимодействий, К=2 А и Х=-2г=. При более низкой ионной силе, /<0.05, это уравнение редуцируется в уравнение, аналогичное по форме простому уравнению Бренстеда (5а): пк = пко- 2.34"/172 (8).

При выводе этих уравнений сделано несколько смелых допущений, в том числе предполагалось отсутствие электростатических взаимодействий между ионами, участвующими в комплементарных парах. Последнее, как отмечают сами авторы, справедливо при/>0.1, но, очевидно, не выполняется при низких 2 ионных силах, вследствие чего п в уравнении (8) следовало бы заменить на п .

Следует заметить, что в случае, когда за активированный комплекс принимается не сфера увеличенного радиуса, а две соприкасающихся сферы с радиусами, равными радиусам реагирующих белков, нет необходимости применять соотношение Бренстеда-Бьеррума. Вместо этого можно, исходя из основного выражения теории активированного комплекса: к = (квТ/И)К* (10) где, А — постоянная Планка, а К* - формальная константа равновесия между переходным состоянием и исходными веществами, далее выразить К* через коэффициенты активности [24], что приведет к уравнению (2). Можно также вь1разить К* через соответствующую свободную энергию — свободную энергию активации. Электростатическая часть последней будет работой, совершаемой белками для сближения, необходимого для образования активированного комплекса с бесконечного расстояния, т. е. энергией парного электростатического взаимодействия в комплексе. Таким образом, теоретические зависимости констант скоростей переноса электрона от ионной силы, рассчитанные на основе энергии парного взаимодействия (вторая группа методов) могут получаться не только из теории переноса электрона Маркуса, но и непосредственно из теории активированного комплекса.

Как в первой, так и во второй группе методов для уточнения используемых приближений помимо полного заряда применяется учет дипольного момента одной или обеих взаимодействующих молекул [23].

Взаимодействие цитохрома С с цитохром С-оксидазой и редуктазой. Цитохром С-оксидаза и редуктаза — сложные мембранные комплексы, состоящие из нескольких субъединиц, а СуХ С переносит электрон с редуктазы на оксидазу, причем центральным вопросом в функционировании оксидазно-редуктазного комплекса является то, каким образом цитохром выполняет свою роль переносчика, т. е. диффундирует ли он между активными центрами оксидазы и редуктазы или фиксирован между ними [25]. С этим связан и вопрос о контактных площадках на цитохроме С: если они совпадают для оксидазы и редуктазы, то работает первый механизм, т.к. оксидаза и редуктаза не могут занимать одновременно одну и ту же площадку. Первоначально, на основании сопоставления кинетических данных по переносу электрона (константы Михаэлиса) с независимо измеренными константами устойчивости комплекса С с оксидазой предполагалось, что связывание Су1 С с мембраной с высоким сродством (высокоаффинное) обеспечивается в основном оксидазой, а редуктаза также может восстанавливать СуХ С в том же месте связывания [26]. Однако изучение диффузионных характеристик отдельных компонентов митохондриальной электрон-транспортной цепи [27] показало лишь то, что наблюдаемые скорости переноса электрона не достигают диффузионного предела (определенного исходя из измеренных коэффициентов диффузии). Таким образом возможную роль латеральной диффузии Су1 С при переносе электрона между оксидазой и редуктазой с его участием исключить не удалось.

На основании рентгеноструктурных данных было сделано предположение, что во взаимодействиях СуХ С ключевую роль играет кластер из боковых групп лизина, расположенных по краям гемовой щели [28]. Для проверки этого предположения была проведена химическая модификация цитохрома С по остаткам лизина. При замене у нескольких цитохромов типа С всех лизинов на аргинин, не меняющей знак заряда групп, но несколько увеличивающей как их заряд, так и размеры [29] скорость переноса электрона не уменьшилась, т. е. функционально важен главным образом заряд лизинов цитохрома С. Модификация же индивидуальных лизинов реагентами, убирающими заряд, V трифторацетатом (ТФА) и трифторметилфенилкарбаматом (ТФК) (последний более объемист) в примерно одинаковой степени уменьшает скорость переноса, указывая на более важную роль электростатических взаимодействий по сравнению со стерическими [30]. Модификация лизинов 4-карбокси-2,6-динитрофенилом (КДНФ), меняющим заряд на противоположный, дает гораздо больший эффект [13].

Распределение лизинов по степени уменьшения скорости при модификации представлено в Табл. 1.

Табл.1. Эффекты химической модификации лизинов цитохрома С на скорости реакций с оксидазой и редуктазой. Знаки ««> и «=» означают соотношения величин эффектов между различных лизинов цитохрома, числа — номера этих лизинов в аминокислотной последовательности цитохрома.

Модификация Эффект с оксидазой Эффект с редуктазой.

ТФА/ТФК (без Ьуэ86) 13>72>87>25 = 8 13>72>79>87>27.

КДНФ (без Ьуэ79) 13>72>86>87=8 13>86>87>27.

Сравнительная 13>86>87>8>72 13>86>87>8>79.

Интересно, что замена соседнего с Ьуз72 лизина 73 не влияет на перенос электрона. Согласно рентгеноструктурным данным, этот лизин, в отличие от а".

72, обращен аминогруппой в сторону, противоположную гемовой щели. С этой же стороны (в литературе называемой задней) располагаются также остатки ШвЗЗ и Ме1б5, при метилировании которых оксидазная активность Су1 С не изменяется [31]. Таким образом, доказано, что «задняя» сторона С^ С в переносе электрона с физиологическими партнерами не участвует.

Предпринята попытка объяснить уменьшение скорости реакции цитохрома С с оксидазой и редуктазой эффектом нарушения ориентации диполя цитохрома при модификации заряженных аминокислот [13]. Авторы оценили дипольный момент наивного Су1 С (300 Б) и рассчитали, насколько он изменится при той или иной точечной замене заряженных аминокислот. Исходя из этого, была оценена дополнительная работа для достижения модифицированным белком ориентации наивного (свободная энергия ориентации). В предположении однородности электрического поля оксидазы и редуктазы зависимость логарифма константы скорости от коэффициента ориентации, определенного как отношение энергии ориентации к потенциалу поля редуктазы, должна быть линейной (кадедой модификации соответствует точка на графике). Точки, соответствующие лизинам, не упомянутым в Табл.1, действительно лежат на прямой, наклон которой дает значение напряженности поля редуктазы 2×107 В/м. Прочие точки отклоняются от прямой, и чем левее соответствующие модификации располагаются в Табл.1, тем больше отклонение. Показательно, что модификация ни одного из лизинов не приводила к полному подавлению переносу электрона в системе, а данные сравнительной (в присутствии и отсутствии оксидазы либо редуктазы) химической модификации Cyt С по остаткам лизина (3-я строка Табл.1) в целом согласуются с результатами модификации индивидуальных лизинов.

32]. Все приведенные данные свидетельствуют в пользу перекрывания контактных площадок для оксидазы и редуктазы на цитохроме С.

Была изучена зависимость скорости реакции Cyt С с цитохро-мом Ci (гемсодержащий фрагмент редуктазного комплекса) от ионной силы.

33]. Оказалось, что в диапазоне от 0.22 до 1*13 М константа скорости уменьшается более чем на два порядка, с З. Ох 107 до 1.8×105 M’V1. Равновесная константа переноса электрона, определенная при высоких значениях ионной силы (>1М) из кинетических и равновесных измерений, оказалась идентичной (0.74), что свидетельствует в пользу недиффузионного контроля реакции переноса электрона. При использовании высокочистого Cyt Ci, содержащего только гем-пептид, зависимость от ионной силы была гораздо слабее [34]. Однако при иммобилизации высокочистого Cyt Q на липосомах зависимости от ионной силы была такой же, как и у мембранно-связанного белка [35].

Бимолекулярная константа скорости переноса электрона от Cyt С к оксидазе при ионной силе 0.2 М составляет Зх 107М" 1с" 1, а эффект ионной силы на нее двоякий: общее понижение скорости и появление второй кинетической фазы, возможно отвечающей второму, менее зависящему от электростатических взаимодействий месту связывания Cyt С на оксидазе [36].

При этом оцененная из концентрационных зависимостей скорость внутри-комплексного переноса электрона между Cyt С и оксидазой сама по себе зависит от ионной силы и обнаруживает максимум при 0.11 М [37]. Из этого следует, что электростатические взаимодействия в комплексе между двумя белками не обязательно обеспечивают оптимальную, с точки зрения переноса электрона, конфигурацию комплекса, даже в случае физиологических партнеров. При ковалентной сшивке Cyt С с оксидазой карбодиимидом в условиях, соответствующих образованию электростатически стабилизированного комплекса оказалось, что перенос электрона в сшитом комплексе вообще не идет [38], однако при этом свободный Cyt С отдает электрон оксидазе несмотря на наличие ковалентно связанной молекулы Cyt С, хотя и с пониженной примерно вдвое скоростью. Это также указывает на наличие на оксидазе более одного места связывания Cyt С.

При замене ароматического остатка Phe82 на Ser, Тгр и Не оказалось, что реакция с оксидазой практически не замедляется, хотя в случае замены Phe на алифатические остатки Ser и Не (но не ароматический Тгр) вместо моноэкспоненциальной обнаруживается полиэкспоненциальная кинетика, характерная для большего разброса ориентаций в комплексе переноса электрона [39]. При этом пространственная структура цитохрома С в целом не меняется (см. записи банка данных PDB lcif, lcig, leih).

Роль положительно заряженного остатка Cyt С в положении 13 в переносе электрона на оксидазу была подтверждена тем, что его замена на цистеин в дрожжевом Cyt С (Argl3Cys) привела и к общему падению скорости, и к исчезновению одной из кинетических фаз [40]. При этом, вопреки принятой в литературе точке зрения, что солевой мостик этого остатка с карбоксилом в 90-м положении играет важную роль в стабильности глобулы Cyt С, никаких изменений в стабильности при замене не наблюдалось. Замена же 90-го остатка (Asp90Cys), наоборот, понижала стабильность Cyt С, но не его эффективность в реакции переноса электрона с оксидазой.

Мономолекулярный перенос электрона между Cyt С и оксидазой в условиях, когда между ними существует комплекс, изучался для рутенирован-ного по индивидуальным лизиновым группам Cyt С, полученного с помощью (дикарбоксипиридин)-бис-(дипиридин)-рутения (11) [41]. Возбуждение лазерным импульсом приводило к быстрому восстановлению гемового железа Cyt С, а затем происходил перенос электрона на оксидазу. Скорость последнего была примерно одна и та же (константа около 104с" ') для Cyt С, рутенированного по Lys25 (периферия гемовой щели) и по Lys 7, 39, 55 и 60 (противоположная сторона цитохрома) и примерно на порядок ниже — по Lys 13 и 27 — в непосредственной близости от гема. Авторы предполагают, что в последних случаях объемистая рутениевая группа создает стерические препятствия для достижения ориентации комплекса, оптимальной для переноса электрона. Рутенирование Cyt С другим реагентом, (4-бромметил-4'метилдипиридин)-(бис-дипиридин)-рутением (II) по 39-му остатку, для этой цели превращенному путем мутагенеза в цистеин, дало при низких ионных силах скорости того же порядка. Однако вышеупомянутый максимум зависимости от ионной силы при 0.11 М воспроизвести не удалось, так как при ионной силе 0.1 М реакция становится бимолекулярной. Бимолекулярная.

1 11 константа скорости (около 2.6×10 М" с" при /=0.23) при этом практически та же, что и у нативного С^ С [42].

Точечный мутагенез медьсодержащего фрагмента бактериальной Су! С-оксидазы дал возможность выявить четыре карбоксильных аминокислотных остатка, ответственных за взаимодействие с Су1 С (три из них консервативны). При этом замена каждого из них снижала скорость переноса на 35−85%, а трех консервативных остатков — более чем в 20 раз. Эта картина практически повторяет вышеупомянутый эффект химической модификации аминогрупп С вблизи гемовой щели и подтверждаете концепцию электростатически комплементарных мест переноса электрона. Бактериальная оксидаза, однако, не является физиологическим партнером Су1 С, и скорости переноса электрона для нативной оксидазы на порядок меньше [43].

При изучении структурных изменений в окисленном Су1 С и оксидазе при образовании комплекса между ними методом резонансной рамановской спектроскопии оказалось, что структурные изменения происходят только в цитохроме, и сводятся к появлению, с 45% содержанием, т.н. конформера II цитохрома С, имеющего более раскрытую гемовую щель, более низкий редокс-потенциал и, возможно, более низкую энергию реорганизации при переносе электрона [44]. Генно-инженерная замена лизинов 72 и 79 на аланин приводят к снижению содержания конформера II до 15% и 35% соответственно, а замена.

Lys79 на Ala приводит также и к локальным конформационным изменениям в гемовой щели [45].

Взаимодействие цитохрома С с цитохромом В5. Здесь и далее под цитохромом В5 имеется в виду его растворимый домен, выделяемый с помощью трипсинолиза. Хотя физиологическое значение этой реакции неизвестно, при низкой ионной силе она протекает со скоростями до о | |.

5x10е MTV1 [13], типичными для физиологических реакций переноса электрона. Эти скорости только на порядок меньше, чем диффузионный предел для идентичных сферических частиц (7×109 M’V1). С учетом того, что при переносе электрона между белками не вся поверхность глобулы реакционно-способна, это значение не исключает диффузионного контроля. С другой стороны, приведенные ниже данные убедительно доказывают существование устойчивого комплекса этих двух белков, что говорит в пользу того, что стадия ассоциации является равновесной.

Поскольку структуры Cyt С и Cyt В5 определены с высоким разрешением [46], были сделаны попытки выявить роль электростатических сил во взаимодействии, в особенности роль положительно заряженных лизиновых остатков, окружающих гемовую полость. В результате компьютерной стыковки (докинга) трехмерных структур Cyt С и Cyt В5 [28] была предложена гипотетическая структура комплекса, в котором концевые аминогруппы лизинов 13,27,72 и 79 цитохрома С участвуют в комплементарных электростатических взаимодействиях с карбоксилами Asp48, Glu44 и Asp60 и наиболее экспонированным гемовым пропионатом, соответственно, цитохрома В5. При этом достигается высокая степень комплементарности поверхностей белков в области контакта, достаточная для полного исключения воды. Наименьшее расстояние между краями гемов в предполагаемом комплексе 8.4 А, а двугранный угол между плоскостями гемов -15 градусов. В уже цитированной работе [22] с использованием более сложного аппарата броуновской динамики наряду с подтверждением данных предыдущего исследования была предложена и другая структура комплекса (см. ниже).

Статические исследования были дополнены расчетами комплекса Су1 СС^ В5 методом молекулярной динамики [47]. Расчеты показывают, что электростатические взаимодействия в месте контакта молекул приводят к образованию гибкого комплекса, в котором разрешены различные относительные положения гемов и конформации аминокислотных остатков. Некоторые из этих промежуточных положений, по-видимому, более благоприятны для переноса электрона, чем сформированные в исходном комплексе.

Существование устойчивого комплекса Су! С с Су1 В5 при низкой ионной ш силе было первоначально экспериментально установлено с помощью ультрацентрифугирования и гель-фильтрации [13]. Зависимость константы устойчивости комплекса от ионной силы, определенная потенциометрическим титрованием [48], совпадает по форме с зависимостью константы скорости переноса электрона в системе, что свидетельствует в пользу активационного контроля реакции переноса электрона, поскольку в этом случае константа скорости переноса электрона пропорциональна константе устойчивости комплекса.

Комплексообразование между С и С}^ В5 изучалось также методом 'Н-ЯМР [49]. Найдено, что при рН 6.3 (27°С, /=0.04), эти цитохромы образуют комплекс 1:1 с константой ассоциации приблизительно 103 М'1. По оценкам характерное время переноса электрона в комплексе составляет примерно 10″ 5 с, что сравнимо с данными, полученными методом импульсного фотолиза для Zn-замещенного Cyt С, приведенными ниже. Область белок-белкового взаимодействия, как было найдено, включает область поверхности Cyt С лошади, где локализованы Ile81, Phe82, А1а83 и Ile85, а также Lysl3 и Lys72. Эти лизины, как полагают, участвуют в двух важных межмолекулярных комплементарных взаимодействиях с анионными группами Cyt В5. Эти результаты свидетельствуют об участии Phe82 в переносе электрона.

Одной из важных особенностей структуры цитохрома В5 состоит в наличии двух гемовых пропионатов около электронпереносящего участка. Чтобы исследовать их роль в белок-белковом взаимодействии, была изучена в широком наборе экспериментальных условий стабильность комплекса Cyt С и Cyt В5, в котором гем был замещен его диметиловым эфиром (DME-Cyt В5) [50]. Оказалось, что при рН 8 (25°С, 1=5 мМ) DME-Cyt В5 и Cyt С образуют комплекс состава 1:1с константой ассоциации Ка=Зх 10б М" 1. При этом значение рН, оптимальное для образования комплекса, значительно выше, чем для взаимодействия между нативными белками. Стабильность комплекса DME-Cyt Bs и Cyt С сильно зависела от ионной силы (значения КА составляли m от 2.4х Ю7 М" 1 при 1=1 мМ до 8.2×104 М" 1 при 1= 13 мМ). Эти данные согласуются с предположением о том, что модельный межмолекулярный комплекс [28] описывает белок-белковую ориентацию, которая является преимущественной при нейтральном значении рН.

Восстановление цитохрома С лошади цитохромом В5 экспериментально изучалось спектрофотометрическими методами в широком диапазоне ионных сил в четырех различных буферных системах [13]. Было найдено, что при низких ионных силах скорость реакции линейно уменьшается с увеличением /ш, указывая на то, что электростатические взаимодействия важны для копмлексообразования. Зависимость скорости реакции от ионной силы количественно описывалась теорией Веланда и Грея (уравнение 6) только в том случае, если эффективный радиус взаимодействия полагать 2 А. Согласно теории, это означает, что взаимодействие между двумя белками лучше всего описывается как сумма п комплементарных взаимодействий, каждое из которых включает определенный лизин цитохрома С и, соответственно, карбоксильную группу цитохрома В5. Число таких комплементарных взаимодействий составляло 5−7. Однако, по данным [51], зависимость от ионной силы бимолекулярной константы переноса электрона в области низких ионных сил идет гораздо круче, что исключает роль комплементарных взаимодействий. Это противоречие, игнорированное авторами [51], будет е разобрано в настоящей диссертации при обсуждении результатов (Глава 3).

Модификация индивидуальных лизинов цитохрома С [52] дала следующий ряд по влиянию на скорость переноса электрона в системе Cyt С — Cyt В5: Lysl3=72>79>27>8. При этом, как и с оксидазой и редуктазой, ТФА и ТФК давали одинаковый эффект и полного подавления переноса электрона не достигалось.

Эта же реакция исследовалась для нативного цитохрома С и его мутантов по лизиновым остаткам [22]. Экспериментально и теоретически исследовали влияние модификации зарядов и стерических изменений на скорость переноса электрона. Чтобы предсказать результат влияния аминокислотных замен на константы скорости, использовался метод броуновской динамики. Предполагалось, что сам акт переноса электрона происходит в точках броуновской траектории с вероятностью, изменяющейся экспоненциально с расстоянием между краями гемов в соответствии с уравнением (1). Методом броуновской динамики удалось количественно предсказать константы скорости для нативного Cyt С в большом диапазоне ионных сил. Для этого, однако, параметр модели {3 из уравнения (1) пришлось установить равным 1.0 A" 1. В отличие от этого, для моделирования взаимодействия Cyt В5 с лошадиным Cyt С [51] и реакции самообмена Cyt С551 [53] оптимальным оказалось значение (3=1.2 A'1. Последнее значение принято также в классической работе [54]. Теоретически рассчитанные константы скорости располагались в том же порядке, что и ж константы, наблюдаемые экспериментально: нативный Cyt С > Lys79Ala > Lys72AIa > Lys72Ala+Lys79Ala, однако сами константы скорости для мутантных белков были приблизительно на 40% меньше экспериментальных. Причиной этих несоответствий теории эксперименту может являться слишком грубое приближение вероятности переноса электрона (уравнение 1), а также то, что броуновская динамика, полагая молекулы твердыми телами, тем самым неправильно описывает взаимодействия белков на малых расстояниях, определяющие конформацию белков в месте их непосредственного контакта.

Работы по мутагенезу системы Cyt С дрожжей — Cyt В5 быка суммированы в работе [55]. В этой же работе структуры комплексов, полученных методом броуновской динамики в [13], были уточнены путем минимизации энергии.

Рассчитанные броуновские траектории предсказывают конфигурации электростатического комплекса между белками, соответствующие самому короткому расстоянию между их темами, около 12 A. Были предсказаны два преобладающих типа электрон-переносящих комплексов, в которых наиболее часто реализуются следующие взаимодействия: Argl3, Lys87, Lys86 и Lys72 цитохрома С и Glu48, Glu56, Asp60 и гемовые пропионаты Cyt В5 со средней электростатической энергией -13.0 ккал/моль. Другой тип комплекса совпадает с вышеупомянутым комплексом, предложенным первоначально [28], с энергией -6.4 ккал/моль. Важный результат этой работы заключается в том, что форма зависимости скорости реакции от ионной силы (независимо от выбранного значения параметра р) хорошо-воспроизводилась в рамках диэлектрической модели, учитывающей различные проницаемости белка и растворителя, но не модели, игнорирующий это различие. Этот результат показывает необходимость подробного учета геометрической формы белка и распределения его зарядов даже в рассматриваемом примере, в котором и общая геометрическая форма белков, и изолинии их электростатических потенциалов в областях контакта почти сферичны.

Для прямого измерения скорости переноса электрона в комплексе Cyt В5 -Cyt С был с помощью (4-бромметил-4'-метилдипиридин)-(дипиридин)-рутения (П) получен модифицированный рутением по 65-й аминокислоте цитохром В5 [56]. Рутениевая группа в Ru65-Cyt В5, локализованная на расстоянии всего 12 A от гема, но не на участке, контактирующем с Cyt С, служила для фотоиндуцированного инжектирования электрона в комплекс. Лазерное возбуждение комплекса приводило к переносу электрона от возбужденного состояния Ru (II*) к гемовой группе Ru65-Cyt В5 с константой скорости более 10б с'1. Последующий перенос электрона от гема Ru65-Cyt В5 к гему Cyt С был двухфазным с константой скорости быстрой стадии 4х Ю5 с" 1 и медленной стадии Зх 104 с" 1, что указывает на наличие двух разных путей переноса электрона в комплексе. Разумно предположить, что ими являются пути через Cysl7 и Phe82. С увеличением ионной силы реакция становится однофазной и скорость ее уменьшается, то есть, в условиях, когда комплекс не образуется, работает только один путь. В эхой системе замена Phe82 на Туг, Gly, Leu или Ile не приводит к заметному изменению констант скорости для какой-либо из фаз [57].

Другой подход для прямого измерения скорости переноса электрона внутри комплекса состоит в изучении редокс-реакции между Zn-замещенным Cyt С и Cyt В5 с использованием лазерного импульсного фотолиза [58]:

3Zn-CytC/CytBs (Fe3+) -> Zn-CytC + CytB5(Fe2+) (11).

Здесь 3Zn — фотоиндуцированное триплетное состояние цинк (П)порфирина. Исследовался как нековалентный, так и ковалентно сшитый комплекс. В случае нековалентного комплекса константа скорости составляла 3.5×105 с" 1 и кинетика реакции была однофазной, что предполагает единственный путь переноса электрона. Скорость не зависела от концентрации белка и ионной силы, но уменьшалась с увеличением вязкости при добавлении глицерина или сахарозы, указывая на то, что самой медленной стадией является не белокшг белковая ассоциация, а скорее конформационные перестройки в уже сформированном комплексе. Напротив, в ковалентном комплексе наблюдались многофазные кинетики, указывая на присутствие по крайней мере двух путей переноса электрона. Из этих данных была получено значение 3.0×105 с" 1 для константы скорости перестройки комплекса 3Zn-Cyt C-Cyt Bs (Fe3+) из начальной конфигурации в более реакционноспособную.

Инфракрасная спектроскопия, благодаря присутствию полос поглощения между 1600 и 1500 см" 1, принадлежащим боковым цепям аминокислот, является быстрым и количественным методом изучения электростатических взаимодействий между белками [59]. В условиях, благоприятствующих образованию ионного комплекса между Cyt В5 и Cyt С, наблюдаются изменения в полосе 1562 см" 1, принадлежащей боковым цепям остатков Glu. Эти изменения указывают на то, что при взаимодействии белков три ионизованных Glu участвуют в образовании солевых мостиков, что хорошо согласуется с модельными структурами комплекса, упомянутыми выше.

Как уже отмечалось, реакция переноса электрона iso-1-феррицитохрома С (ycytc) и нескольких его мутантов с цитохромом Ь5 (cytb5) была изучены в условиях, в которых она бимолекулярна [22]. Влияние изменения электростатического заряда и стерических изменений на кинетику реакции для мутантов ycytc К79А, К72А, К79А / К72А и R38A. Методом броуновской динамики (BD) была имитирована стыковка и диффузионный перенос электрона. Это было использовано для расчета влияния мутаций константу скорости реакции. Метод количественно предсказывает зависимости константы скорости от ионной силы и полуколичественно от мутаций. И экспериментальные, и расчетные константы располагаются в следующем порядке: нативный ycytc>

К79А> К72А> К79А / К72А. Расчеты предсказывают что два белка взаимодействуют посредством единственного интерфейса, с расстоянием наибольшего сближения двух групп в гем твердого тела стыковки 12 А. Преобладают два класса комплексов (Табл. 2), один из которых определяется контактами между суЛ5 и усуКС1и48-А¹³, С1и56-Ьуз87, АБрбО-ЬуэЗб и гем-пропионат-Ьуз72 соответственно, с электростатической энергией -13,0 ккал / моль. Второй, который ранее постулировался в [28], содержит контакты 01и44-Ьуз27, С1и48-Аг?13, Азр60-Ьуз72 и гем-Ьуз79 и имеющие энергию -6,4 ккал / моль. я".

Табл.2. Зарядовые взаимодействия в гипотетических комплексах цитохрома С с цитохромом В5. Курсивом обозначены контакты в одном гипотетическом комплексе [22,28], — жирным шрифтом — в другом [22].

Су1 С дрожжей цитохромом В 5.

Агй13 в1и48 С1и48.

Ьув27 С1и44.

Ьув72 Нете /АврбО.

Ьув79 Нете.

Ьуэ87 в1и56.

1⁸⁶ АярбО.

Дальнейшие исследования комплексов цитохрома С с цитохромом В5 проводились с помощью сочетания методов ЯМР и автоматического (в отличие от ручного, как в [28]) докинга [60]. Главным выводом этих работ является то, что на цитохроме С имеется единственная область контакта, а на цитохроме В5.

— либо весьма протяженная область, либо две области. К сожалению, однозначно определить конфигурацию комплекса из этих данных не удается. Однако среди множества возможных областей контакта встречаются и те, зарядовые контакты которых представлены в Табл. 2.

Для сравнения приведем также взаимодействие цитохрома С с цитохром С.

— пероксидазой, приводящее к образованию физиологического комплекса переноса электрона. Методом интерактивного (ручного) докинга построена гипотетическая модель комплекса [61]. Расстояния в парах, образующих водородные связи и солевые мостики, близки к оптимуму (2.7−3.0 А). В Табл.3 приводится их список для двух цитохромов С и пероксидазы дрожжей.

Табл.3. Зарядовые взаимодействия и водородные связи в гипотетических комплексах цитохрома С с пероксидазой для лошадиного и дрожжевого цитохромов С [61].

Cyt С дрожжей Cyt С лошади Пероксидаза.

Агд13 Lysl3 Asp37.

Lys27 Lys27 Asp79.

Lys72 Lys72 ~ Asp216.

Lys87 Lys87 Asp34.

Lys86 Lys86 Asp37.

Glnl6 Gin 16 Gln86.

Thrl4 Gin 12 Asn87.

В дальнейшем пространственные структуры комплексов пероксидазы с дрожжевым и лошадиным Cyt С получены методами рентгеноструктурного анализа [62]. Эта структура резко отличается от цитированной выше модельной структуры [61]. В Табл. 4 приведен список водородных связей и солевых мостиков, аналогичный Табл. 3. Видно, что резко уменьшилось число ионных контактов (комплементарных электростатических взаимодействий). По сравнению с Табл. 3 остались ионные контакты Cyt С лишь с наиболее заряженной областью пероксидазы (остатки 32−38), а вместо области 217−224 пероксидазы в контактах участвует С-концевая область, так что вместо Hisl81 на предполагаемом пути переноса электрона в этом комплексе оказывается непосредственно примыкающий к гему пероксидазы Тгр191 и следующие по цепи остатки 192−194, последний из которых экспонирован.

Основных отличий между реттеноструктурными комплексами пероксидаз с лошадиным и дрожжевым Cyt С два. Первое — это гораздо большее (10 против 3) число ван-дер-ваальсовых контактов. Второе — в дрожжевом комплексе гем, сера Cysl7 и концевые атомы Gin 16 цитохрома С расположены гораздо ближе (3.6−4 А) к остаткам 193 и 19*4 пероксидазы, чем для лошадиного.

Су1 С (7 А между ближайшими атомами этого фрагмента пероксидазы и гемом Су1С).

Табл.4. Зарядовые взаимодействия и водородные связи в комплексах цитохрома С с цитохром С — пероксидазой для лошадиного и дрожжевого цитохромов, полученных методом рентгеноструктурного анализа [61].

Cyt С дрожжей Cyt С лЪшади Пероксидаза.

Lys87 — Asp34.

— Lys87 Glu35.

— Lys8 Asn38.

Asn70 Lys72 G1u290(0Di).

Lys73 — Glu290(0n2).

Взаимодействие супероксид-дисмутазы с супероксидом. Физиологическая функция супероксид-дисмутазы (SOD) состоит в превращении анион-радикала супероксида 02 в пероксид-анион Ог2~ и кислород 02 посредством циклического процесса, в котором супероксид попеременно окисляет и восстанавливает ион меди, входящий в состав молекулы супероксид-дисмутазы:

SOD (Cu2+) + Or ->S0D (Cu,+) + 02″ S0D (Cu,+) + 0r ->S0D (Cu2+) + 02.

Супероксид-дисмутаза состоит из двух^практически идентичных субъединиц, пространственно связанных осью вращения второго порядка. Область межсубъединичного контакта составляет около 15% общей площади субъединиц. Димерность нужна для поддержания пространственной структуры белка в воде. Молекула имеет два активных центра, каждый из которых содержит ион меди и атом цинка, причем субъединицы функционируют независимо друг от друга [63]. Ключевой особенностью супероксид-дисмутазной реакции является электростатическое узнавание между супероксид-дисмутазой и супероксидом. Действительно, эти молекулы реагируют со скоростями порядка.

109 M’V1, что характерно для диффузионно-контролируемых реакций при условии продуктивности любого столкновения молекул [64]. При этом, однако, рассматриваемая реакция фактически является реакцией супероксида с ионом меди. Это означает, что для того, чтобы реакция прошла, необходим непосредственный контакт супероксида с ионом меди, площадь которого составляет около 0.01% площади белка. Единственное возможное объяснение столь высокой скорости реакции состоит в том, что электростатические силы направляют супероксид к активному центру белка [64].

Последнее, по-видимому, справедливо для супероксид-дисмутаз всех биологических видов, поскольку анализ последовательностей 15 видов подтвердил, что остатки, определяющие стереохимию активного центра, инвариантны, а область положительного потенциала вблизи активного центра динамически расширена и сглажена за счет*конформационной подвижности этих остатков [65].

Кроме того, анализ последовательностей супероксид-дисмутаз 38 видов на основе пространственных структур SOD быка, дрожжей и шпината показал, что существует целых семь устойчивых вариантов расположения заряженных остатков по краю активного центра, причем их суммарный заряд всегда один и тот же [66].

Общий заряд супероксид-дисмутазы быка при нейтральном значении рН составляет -4 и мешает отрицательно заряженному супероксиду достичь активного центра. Таким образом, если учитывать только общий заряд, электростатическое взаимодействие должно мешать реакции, и ее скорость должна повышаться при более высокой ионной силе. Экспериментально наблюдаемый эффект противоположен [64,67]. Это означает, что главную роль играет заряд непосредственного окружения активного центра супероксидт дисмутазы, который положителен вследствие зарядов атомов металлов и близлежащих аминокислотных остатков Ьуэ 133,134 и Аг£141. Об этом же свидетельствуют зависимости от рН и ионной силы активностей супероксид-дисмутаз различных биологических видов, отличающихся по изоионным точкам (от р/8.0 у овцы до р/4.8 у дрожжей), причем аминокислотные последовательности консервативны у супероксид-дисмутаз млекопитающих и отличаются в области активного центра у дрожжевого белка [68]. Во всех случаях найдено, что взаимодействие белка с субстратом управляется ионизацией двух положительно заряженных аминокислот с рКа 9.2 и 11.0 (для дрожжевого белка -9.1 и 11.4), а зависимости от ионной силы аналогичны для всех супероксид-дисмутаз (20%-я убыль в интервале /=0.02−0.1 М при рН 8.5). Скорость реакции идентична для окисленной (купри) и восстановленной (купро) форм фермента, поскольку внутренний остаток Шб61 при восстановлении меди депротонируется, что частично компенсирует изменение общего заряда активного центра [69,70].

Изучались кинетики ферментативной реакции супероксид-дисмутазы для нативного и модифицированного полиэтиленгликолем (ПЭГ), уксусным или янтарным ангидридами белка в зависимости от рН и ионной силы [71]. Было показано, что основную роль в направляющем действии электростатического поля при подходе субстрата к активному центру принадлежит остаткам Ьуэ120 и 1¹³⁴. Сравнение кинетических данных для нативного с ПЭГ-модифицированным белком показало, что ПЭГ-модификация затрагивает только Ьув120 и при этом направляющее действие поля сохраняется. Напротив, депротонирование путем повышения рН, модификации всех аминогрупп ангидридами, а также повышение ионной силы снижает бимолекулярную константу скорости до одного и того же значения Зх 108 ГуГ’сЛ.

В ряде работ проведено моделирование взаимодействия супероксид-дисмутазы с супероксидом методом броуновской динамики, в которых супер оксид считался однородно заряженным шаром, а для моделирования супероксид-дисмутазы и распределения зарядов на ней использовались различные модели. Для простых моделей, в которых форма супероксид-дисмутазы считалась сферической, а при расчете электростатических сил игнорировалась разница диэлектрических свойств белка и растворителя [19,20] в лучшем случае удавалось воспроизвести лишь знак зависимостей от ионной силы, но наклон кривых зависимостей скорости реакции от ионной силы был сильно занижен.

Расчет распределения электростатического потенциала супероксид-дисмутазы путем решения линеаризованного уравнения Пуассона-Больцмана [72]. Диэлектрическая константа была задана равной 2 для белка и 80 для растворителя. Расчет показал, что, в отличие от модели с постоянной диэлектрической проницаемостью, область положительного потенциала доступна из объема раствора, а не прикрыта потенциалом противоположного знака, вызванным суммарным зарядом белка и зарядом близлежащих карбоксильных групп.

Расчет бимолекулярных констант скорости методом броуновской динамики с использованием этой электростатической модели и топографической модели белка с точностью до атома для супероксид-дисмутазы дикого типа воспроизводит форму зависимости от ионной силы существенно лучше, чем для простой электростатической модели с ?-=50 во всем объеме [21,22].

При использовании этой же топографической модели, но при полном отсутствии зарядов, предсказанная константа скорости составила 2×108, что лишь в полтора раза меньше экспериментально измеренной позднее константы скорости для высокой ионной силы [71].

Такое же исследование для диэлектрических констант 2 и 80 для белка и растворителя проведено в работе [72], но форму зависимости константы скорости реакции авторам воспроизвести не удалось, хотя направление эффекта ионной силы предсказано правильно. Для нативного белка и белка с нейтральным А¹⁴¹ влияние ионной силы, в этой работе недооценено, а для случая, когда все лизины нейтрализованы — переоценено по сравнению с цитированными в той же работе экспериментальными данными (в последнем случае повышение ионной силы ускоряет реакцию).

Направляющий эффект электростатических взаимодействий был теоретически исследован методом броуновской динамики для различных моделей распределения зарядов супероксид-дисмутазы, включая удаление зарядов с ионизованных аминокислотных остатков [73]. Эти расчеты предсказывают, что удаление заряда приводит к заметному (в 2 раза) изменению скорости лишь для непосредственно примыкающих к активному центру остатков Argl41, Glul31 и Lysl34. Для других остатков этот эффект порядка 20−40%. Ни общий заряд супероксид-дисмутазы, ни степень окисления меди на скорость реакции не влияют, что прекрасно согласуется с вышеприведенными экспериментальными данными [70,71]. Что касается эффекта модификации остатка Argl43, по которому также имеются экспериментальные данные, он, по расчетам [73], сильно занижен. Действительно, химическая модификация дает эффект в 5−50 раз [64,74], мутация на аланин -10 раз, а на лизин (т.е. с сохранением заряда) — в 2,5 раза [75]. Таким образом, хотя часть эффекта модификации Argl43, очевидно, имеет неэлектростатическую природу (например, стерическое блокирование), электростатическая часть эффекта замены Arg 143 в этих расчетах все равно недооценивается. Рассчитанный наклон зависимости от ионной силы для мутантного белка по сравнению с белком я" дикого типа при этом практически не уменьшается, что соответствует экспериментальным данным. Объяснение, видимо, состоит в том, что эффект Argl43 локализован в пределах канала активного центра [64], и его модификация мало влияет на диффузию супероксида в объеме раствора. Остаток Lysl34, напротив, находится на периферии активного центра. У супероксид-дисмутазы акулы этот остаток заменен на Arg — без изменения заряда, и ферментативная активность его при нейтральном pH не отличается от других видов, хотя эта замена отражается на pH-зависимости в щелочной области [76].

Молекулярно-динамические расчеты супероксид-дисмутазы показывают, что мутации в положении 132,133 и 136 не затрагивают канала активного центра [77], в отличие от положения 137, мутация которого снижает ферментативную активность на 30% [78]. ~.

При вычислении констант скорости реакции методом броуновской динамики ключевым моментом является критерий, по которому определяется, прошла ли реакция в данной точке броуновской траектории. Таким критерием принимается либо столкновение супероксида с атомом меди, либо приближение его на расстояние менее некоторого фиксированного. Что касается самих значений констант скорости, то в случае грубых моделей супероксид-дисмутазы и поля вокруг нее сравнение их с экспериментом не имеет смысла из-за слишком большого произвола в выборе критерия реакции. Более точные модели, учитывающие геометрическую форму белка и различие поляризуемости белка и воды, во всех случаях дают систематически завышенные значения констант скорости. Возможно, это связано с тем, что канал, ведущий от поверхности супероксид-дисмутазы к атому меди, плотно заполнен молекулами воды, связанными водородными связями, как показало кристаллографическое исследование супероксид-дисмутазы с высоким разрешением [79]. С другой стороны, из этого результата следует, что вместо с диффузии субстрата к атому меди по каналу реакция может происходить путем передачи протона.

Основываясь на распределении заряда супероксид-дисмутазы, с помощью генной инженерии были сконструированы точечные мутанты по остаткам С1и132 и 133 [80]. Эта работа будет рассмотрена здесь наиболее подробно, поскольку в ней скорости реакции и определены экспериментально, и рассчитаны теоретически. Замена любого из этих отрицательно заряженных остатков на нейтральные (Gin) увеличивает скорость реакции. Это соответствует предполагаемому направляющему эффекту положительного заряда области активного центра супероксид-дисмутазы.

Однако в случае двойного мутанта Glul32Gln+Glul33Lys дополнительное введение положительно заряженного остатка понижает скорость по сравнению с Glul32Gln.

Это свидетельствует в пользу диффузионного контроля процесса дисмута-ции, так как в противном случае скорость определялась бы энергией взаимодействия супероксид-дисмутазы и супероксида лишь в реакционноспо-собном комплексе, но не на всей протяженности диффузионных траекторий, ведущих к этому комплексу, и соответственно увеличивалась бы при увеличении электростатического потенциала в области активного центра. Падение же скорости при введении дополнительного положительного заряда в область активного центра, очевидно, вызвано искажением диффузионных траекторий, которые при отсутствии этой замены более эффективны. Кроме того, замена глутаминовой кислоты на лизин (но не на глутамин) приводит к введению дополнительной СНг-группы, что может вызвать стерические затруднения при подходе субстрата.

У всех мутантов, по сравнению с нативным белком, возросли как абсолютные значения констант скорости, так и наклоны зависимостей от ионной силы. Однако теоретический расчет бимолекулярных констант скорости методом броуновской динамики, как и во всех других процитированных здесь работах, для всех вариантов белка дает завышенные значения констант скоростей реакции. При этом форма кривой зависимости скорости реакции от ионной силы воспроизводится лишь для нативных белков, а для всех мутантов наклон теоретических зависимостей меньше экспериментальных. Неточно воспроизводится и соотношение скоростей для различных мутантов. Экспериментально определенное влияние мутации С1и13 301п на скорость т реакции при высокой ионной силе оказалось таким же, как С1и132С1п (30%), в то время как броуновская динамика предсказывает эффект мутации около 10% для 01и132 и более чем в два раза для С1и133. Предсказанный наклон зависимости от ионной силы для этих двух мутаций одинаков и соответствует, в интервале ионных сил 19−265 мМ, уменьшению константы скорости в 3 раза, а экспериментально наблюдается уменьшение в 3.5 и 4 раза для остатков 132 и 133 соответственно. Для двойных мутантов 01и (133,132)С1п и ' 01и13 201п, 01и133Ьуз теоретический расчет даст, в том же диапазоне ионных сил, уменьшение константы скорости в 4 раза, а экспериментально наблюдается уменьшение в 8 и 4 раза соответственно. У всех вариантов белка значения констант скорости при повышении ионной силы приближаются друг к другу и при 265 мМ составляют (6.7−10.6)х 108 М^с" 1. Этот эффект не предсказывается вычислительным экспериментом методом броуновской динамики, который дает линейные зависимости логарифма константы скорости от квадратного корня ионной силы в рассматриваемом диапазоне для всех вариантов белка.

ДНКсвязывающие белки — сигма-субъединицы бактериальной РНК-полимеразы семейства ст70. ДНК-зависимая РНК-полимераза (РНКП) является ферментом, ответственный за транскрипцию, важнейшую стадию и основную точку контроля биологической обработки информации. Начальная стадия транскрипции — узнавание промотора полимеразой РНКП [81]. За исключением некоторых фагов и митохондрий, где они состоят из одной субъединицы [82], РНКП — олигомерные ферменты, с числом субъединиц от 47 у прокариот до >11 у эукариот [83]. У бактерий холофермента РНКП состоит из тесно связанных центральных или коровых субъединиц (агрр'со, [84]) и способной к диссоциации сигма-субъединицы, также называемой сигма-фактором. Сигма-субъединица отвечает за инициацию транскрипции, особенно за РНКП-промоторное узнавание. Коровый фермент содержит каталитический механизм, работающий при синтезе РНК, который достаточен для элонгации и т терминации. Таким образом, сигма-субъединица, как полагают, отделяется от основной РНКП после завершения инициации транскрипции [85]. Однако некоторые исследования показывают, что она может оставаться связанной с основной РНКП и во время элонгации [86]. Все промоторы, узнаваемые сигмой, содержат характерные нуклеотидные последовательности (элементы) на -10 позиции от точки старта транскрипции [87]. Некоторые из них также содержат специфичные последовательности нуклеотидов около -35-й позиции [87], в то время как другие вместо этого содержат т.н. расширенный -10 элемент, достигающий до -17 позиции [88]. Узнавание некоторых промоторов может быть облегчено также С-концевым доменом апьфа-субъединицы [89], но их узнаваемый сайт промоторной ДНК находится гораздо выше по последовательности (upstream), около -60 позиции. Механизм инициации транскрипции рассматривается в [90]. Вкратце, узнавание промотора приводит к формированию комплекса РНКП: промотор, в котором ДНК остается двуспиральной (закрытый комплекс). Дальнейшие этапы инициации транскрипции связаны с расплетанием (плавлением) двойной спирали ДНК с образованием открытого комплекса, в котором читаемая ДНК связана с активным центром РНКП. Происходит абортивная инициация, т. е. высвобождение коротких олигорибонуклеотидов, которая повторяется, пока нарождающаяся цепь РНК не становится достаточно длинной, чтобы вытеснить фрагмент РНКП, блокирующий её траекторию в комплексе инициации. У бактерий этот фрагмент РНКП считается чЗ&гыо сигма-субъединицы.

Выбор именно второго домена ст-субъединицы для сравнительных расчетов электростатического потенциала обусловлен несколькими известными фактами. Во-первых, второй домен участвует в узнавании промоторов как типа -35/-10, так и типа расширенного -10 [91]. Во-вторых, второй домен является самым консервативным и, видимо, выполняет самый широкий набор функций среди структурных доменов членами семейства о-70 [92]. Этот весьма консервативный домен полностью а-спирален. В-третьих, имеются 3D структуры для пяти различных вторых доменов сигма субъединиц, и все эти домены имеют идентичные укладки, что позволяет провести сравнительные исследования. А именно, пространственные структуры имеются для вторых доменов субъединиц ст70 Е. coli, аА Т. aquaticus и Т. thermophilus (последние почти идентичны) [93], все из которых являются первичными сигмами, а также аЕ Е. coli и aR S. coelicolor [94], обе из которых являются внеклеточными (ECF) сигмами. В-четвертых, четыре сигмы отличаются наличием/отсутствием длинной вставки во втором домене. Много субъединиц типа а70 имеют аминокислотные вставки во втором домене (между субдоменами 1.2 и 2.1), которые меняются в длине от ~ 50 до ~ 250 аминокислот [92]. Более длинные вставки часто содержат кислые (отрицательно заряженные при pH 7) петли. Функция вставки в целом и петель в частности пока остается неясной, и этот вопрос рассматривается в данной работе. Из четырех сигм, рассматриваемых здесь, две непервичных сигмы не имеют вставки, сигмы Т. aquaticus и Т. thermophilus имеют ~50-аминокислотные вставки, а су70 Е. coli имеет ~250-аминокислотную вставку. Не имеющие вставки аЕ Е. coli и aR S. coelicolor регулируются анти-сигмами и не требуют автоингибирования, в отличие от трех других первичных сигм. Кроме того, в случае сигм ECF, анти-сигма-фактором является трансмембранный белок, который удерживает сигма-фактор вблизи мембраны. Только после того, как сигнал принимается внеклеточным доменом анти-сигмы, сигма высвобождается и становится способна связывать и основную (коровую) РНКП, и промотор [94].

Основанием для выбора электростатических расчетов в качестве метода анализа узнавания РНКП промотором состоит в общепринятой модели процесса белок-ДНК узнавания, сформулированной в [95], которая включает не менее трех этапов. Узнавание начинается с неспецифического связывания белков с ДНК, которая происходит под воздействием электростатической комплементарности ДНК с контактирующей поверхностью белка [96], а затем одномерной диффузии белка вдоль цепи ДНК, которая ускоряет ассоциацию до ш диффузионного предела и даже сильнее [97]. Наконец, формируются более прочные контакты между ДНК и белком, который возникает, когда белок находит свой специфический сайт.

Из литературы известны расчеты электростатического потенциала для РНКП: ДНК элонгационных комплексов, а именно комплекса для фага Т7 РНКП [98] и комплекса бактериальных РНКП [99], где электростатические потенциалы были спроецированы на молекулярные поверхности. Показано, что положительный потенциал совпадает с расположением двойной спирали ДНК в комплексах. Однако использование молекулярных поверхностей для электростатического потенциала отображение отражает состояние системы, когда ДНК уже сильно связана с РНКП, и не позволяет исследовать роль электростатики на ранних стадиях РНКП: ДНК узнавания.

ДНКсвязывающие белки семейства гомеодоменов. В большинстве известных исследований ДНК-белковых комплексов изучалось связывание белков с двуспиральной ДНК в В-форме, в районе ее большого желоба. Авторы [100] проанализировали особенности поверхностей ДНК-связывающих доменов белка, такие как доступность, электростатический потенциал, гидрофобность и консервативность аминокислотных остатков. Оказалось, что наиболее характерным параметром ДНК-связывающих белков, является именно их положительный электростатический потенциал [100]. При узнавании в большом желобе сайт связывания формируется за счет определенной (узнающей) а-спирали, причем ведущую роль играют полярные аминокислоты [101]. Контакты между белком и ДНК традиционно определяются по координатам соответствующих ДНК / белковых пар атомов с помощью таких стереохимических критериев, как пороговые расстояния между углерода в неполярных контактах или параметры водородных связей. Следует отметить, что такое определение контактов не является достаточным для всех случаев, потому что оно игнорирует структурный контекст возникновения каждого данного контакта. В частности, известны «структурные соотношения», выражаемые в виде тензоров, описывающих соотношения между вектором пути основной цепи белка на каждой аминокислоте и плоскостью каждого нуклеотидного основания [102]. В цитированной работе, однако, было идентифицировано семейство белков, где такие отношения оказались очень схожими внутри этого семейства и очень отличными от соотношений других семейств. Поэтому мы выбрали для анализа именно семейство гомеодоменов, учитывая также, что гомеодомены известны как наиболее древнее и консервативное семейство эукариотических белков.

Среди индуцибильных факторов транскрипции, гомеодомены являются едва ли не самым важным в эукариотах, потому что они контролируют дифференциацию развития эмбриональных клеток по тканям или органам. Первоначально обнаруженные у плодовых мушек, эти факторы были найдены и у всех позвоночных животных [103]. Согласно их кристаллографическим структурам, гомеодомены являются тртрехспиральными белками, включающими мотив НТН, к которому присоединена, с его N-конца, осно’вная (положительно заряженная) петля. Взаимодействие гомеодоменов с ДНК были всесторонне проанализированы в [104], но в этой работе не пытались выявить функциональное значение контактов или классифицировать их. Согласно базе данных SCOP [105], насчитывается около 40 гомеодоменов с известными структурами их комплексов с ДНК. Большинство гомеодоменов, даже при самых различных первичных структурах, имеют очень похожие кристаллографические структуры, совпадающие, как правило, со среднеквадратичным отклонением ниже 1 А, и ниже 0,6 А по узнающей спирали. Структуры гомеодоменов очень часто остаются практически неизменными при связывании с ДНК [106]. Исследование методом молекулярной динамики показывает, что не только структура, но также и подвижность гранёного (англ. engrailed, термин описывает узор на крылыйгках дрозофилы) гомеодомена остается неизменной как в ДНК-связанной, так и в свободной форме [107].

Роль электростатики в функционировании нуклеиновых кислот. В то время как электростатический потенциал белков и его роль в белок-ДНК взаимодействии достаточно хорошо изучены (предыдущие разделы Литературного обзора), влияние электростатических свойств ДНК на этот процесс до сих пор остается мало изученным. Электростатические свойства ДНК являются существенными во взаимодействиях ДНК-ДНК и белок-ДНК, а.

— т также определяют природу и структуру конденсированных противоионов окружающих ДНК. Поэтому электрические поля и потенциалы ДНК и детали взаимодействия ДНК-растворитель являются предметом большого числа теоретических исследований.

Электростатические модели систем ДНК-растворитель обязательно используют идеализацию из-за большой длины исследуемых фрагментов ДНК. В ряде исследований использовались упрощенные геометрии и распределения зарядов [108], а также идеализированные модели диэлектрических постоянных [109]. Было разработано несколько теоретических методов расчета потенциалов, основанных на полно-атомной модели ДНК. В частности, Клейн и Пак [110] рассчитывали потенциалы при помощи итеративного метода, основанного на законе Кулона и уравнении Пуассона-Больцмана для определения самосогласованного набора потенциалов и ионных концентраций. Джайярам [111] также применял полно-атомную модель для определения электростатического потенциала B-ДНК, используя метод конечных производных для решения нелинейного уравнения Пуассона-Больцмана. Позже Джайярам и Беверидж [112] решили линаеризованное уравнение Пуассона-Больцмана (в приближении Дебая-Хюкеля) аналитически для конечной длины ДНК для определения свободной энергии различных конформаций.

Хохберг [113] аналитически определил электростатические потенциалы и поля вокруг ДНК в приближении исключительно-фосфатной модели диэлектрического слоя при помощи метода" функций Грина, а позже расширили модель до учета всех атомов ДНК [114]. Этот метод включает предположение о симметрии ДНК. Бейли [115] произвел подобные вычисления для потенциала внутренней части ДНК с учетом окружающего растворителя в приближении Дебая-Хюкеля, но учитывая только фосфатные заряды.

В 1999 году был разработан простой и быстрый метод расчета распределения электростатического потенциала вокруг длинных фрагментов ДНК (>1000 п.о.) [116,117], позднее модифицированный для расчета электростатического профиля нуклеотидных последовательностей целых прокариотческих геномов (>1000 п.о.) [89]. Показано, что электростатический потенциал промоторной ДНК может выявлять функционально значимые свойства промоторов, которые не могут быть обнаружены при анализе собственно ануклеотидной последовательности. В частности, в электростатическом профиле дальней upstream области промоторных ДНК ранних генов генома бактериофага Т4 были обнаружены специфические элементы, вносящие вклад в промоторно-полимеразное узнавание через взаимодействие с а-субъединицей РНК-полимеразы [89]. Установлено, что характер этих взаимодействий определяет функционирование ранних Т4 промоторов. В частности, специфика ответа промоторов ранних генов фага Т4 на физиологический сигнал, связанный с АДФ-рибозилированием а-субъединицы РНК-полимеразы, объясняется характером электростатических взаимодействий между upstream областью соответствующих промоторов и С-концевьцл доменом а-субъединицы, электростатические свойства которого изменяются при АДФ-рибозилировании.

Функция тРНК — доставка аминокислот к рибосоме при трансляции, то есть РНК-зависимом синтезе полипептидной цепи. Кроме тРНК, факторов инициации IF1-IF3, фактор терминации RF-3, рибосом и аминокислот, в трансляции участвуют: мРНК, факторы элонгации EF-Tu и EF-G, и аминоацил-тРНК синтетаза (ARSa3a) [118].

Подробная информация о сценарии цикла элонгации приводится в [119]. Она указывает на два различные типа молекулярного узнавания в этом процессе: кодон-антикодон и ARSa3a-TPHK. Специфика первого типа обеспечена водородными связями между комплементарными нуклеиновыми основаниями. Механизмы элонгации в целом [119] и образования пептидной связи в частности [120] хорошо изучены. Однако природа специфики ARSa3a-тРНК узнавания не совсем ясна. В прокариотах каждая аминокислота имеет свои собственные уникальные тРНК и ARSa3y. Тем не менее, фактор EF-Tu не является специфичным для аминокислот, хотя некоторая специфичность была т отмечена среди несобственных комплексов тРНК с аминокислотами [121].

Для белок-нуклеинового узнавания принят иерархический механизм, состоящий, по меньшей мере, из трех этапов [95]. Первый — неспецифическое связывание белков с нуклеиновой кислотой — происходит за счет электростатической комплементарности контактирующих поверхностей нуклеиновых кислот и белков. Второй шаг, одномерная диффузия белка вдоль цепи ДНК, вряд ли подходит для тРНК, имеющую сложную форму и небольшие размеры. Следующим этапом является формирование более плотных контактов нуклеиновых кислот и белков, которое происходит на целевом сайте, уже локализованном на цепи ДНК (в случае ДНК) или РНК, локализованной относительно АКЭазы или рибосомы.

Исследования электростатических потенциалов тРНК были впервые проведены Пюльманом с сотр. [122], которые использовали методы квантовой химии для расчета электростатического потенциала остова тРНК и азотистых оснований в вакууме. В более поздних исследованиях, электростатический потенциал был рассчитан в растворе с помощью решения уравнения Пуассона-Больцмана. Хонигом с сотр. был рассмотрен электростатический потенциал антикодоновой петли тРНК [123] и выявлены различия между инициаторной и элогнгаторной тРНК, а также различия между конформациями РНК, такими как псевдоузел и тетрапетля [124]. Результаты последнего исследования установили, что функции тРНК не могут быть описаны из одной структуры тРНК, но необходимы расчеты электростатического поля.

Специфика тРНК-белкового узнавания остается до сих пор нерешенной проблемой. Например, в работе [125], взаимодействие тРНК с АЛЗазой рассматривается в предположении, что поле тРНК описывается единичным зарядом (монополем), а специфика определяется уникальным электрическим полем АЯБазы.

МЕТОДЫ.

Вывод выражений для напряженности электростатического поля с учетом структуры растворителя. Для учета структуры растворителя было использовано основное уравнение электростатики, связывающее электрическое смещения.

Ь с полем Ё где р — плотность заряда. Оно традиционно решается в предположении пропорциональности электрического смещения полю: где е — диэлектрическая константа. Последнее предположение означает, что диэлектрический отклик элемента объема на приложенное поле определяется только поляризацией этого элемента объема. В случае ориентационной поляризации каждый постоянный диполь среды будет ориентирован вдоль поля. Это будет не так для взаимодействующих друг с другом диполей, ориентация которых не будет независимой от ориентации соседних диполей. сЦу £>(г) = 4яр (г).

13) = ?{г)Ё{г.

14).

Такая зависимость в нелокальном формализме решения задач электростатики учитывается соотношением между D и Е в виде.

D® = K (r, ry) Ё{7')dr[1 (15) где функция отклика К характеризует взаимную зависимость ориентации диполей. В изотропной среде.

F')=^(|F-r1) — (16) причем К становится постоянной для больших |r — г’j, что отражает малость корреляции на больших расстояниях, так что в последнем случае вместо уравнения (15) имеем (14).

Решение уравнения (13) проводится с помощью преобразования Фурье.

F = jexp (-ikr)dr (17) так что пространственная дисперсия диэлектрической проницаемости вводится в виде зависимости К от волнового вектора к.

К (к)= ?:" ?i +?s (18) 1+^-Рл2 где параметрами являются корреляционная длина сетки водородных связей воды, высокочастотная (короткодействующая) и низкочастотная (дальнодейст-вующая) диэлектрическая константа воды. Это выражение соответствует экспериментально наблюдаемой зависимости проницаемости воды от частоты поля с А=5 А, ei=6 и es—SQ. Таким образом, в этой модели не учитывается структура белка и детали взаимодействия белок-вода. Предполагается, что они могут быть в некоторой степени описаны взаимодействиями, наблюдаемыми в чистой воде. Основанием является то, что пространственный масштаб невалентных взаимодействий внутри белка и между белком и водой близок к масштабу этих взаимодействий в воде и составляет несколько ангстрем. Подставляя в (13) выражение (15), а также соотношение между потенциалом и напряженностью поля.

Дг) = -вга<1р (г) (19) и условие точечности заряда.

Р{г) = д3{г) (20) а затем применяя преобразование (17), ползаем р{к)= (20) К (к)-к.

Подставляя выражение (18) в (20) и применяя преобразование, обратное.

17).

Р" 1 = —/ ехр {-йг)Ог (22).

2лполучаем окончательно выражение для потенциала точечного заряда р (К) = ^[{Уе, -1Я)е*р (-Я/Л) + 1/^] (23) и для поля точечного заряда в зависимости от расстояния от него.

Е{К) = -Ш/е, — 1/е5 XI + Я/Л)ехр (- Д/Л) + /ех ] (24) к.

Аналогичное выражение получаем и для однородно заряженной плоскости, в зависимости от расстояния d от плоскости.

E (d) = —[{l/s, -1/*,)exp (—d/A) +1?st ] (25).

Методика расчета эффектов модификации лизиновых групп Cyt С при его взаимодействии с мембранными белками. Модификация Cyt С изменяет заряды групп на его поверхности и, соответственно, изменяет энергию взаимодействия модифицированного Cyt С с партнером. Последнее было представлено в работе [13] как взаимодействие системы точечных зарядов с однородным электрическим полем. Следуя этой работе, координаты Cyt С из сердца лошади брали из Protein Data Bank и остаткам Cyt С приписывались заряды по -0,5 на терминальные атомы кислорода аспартата, глутамата и гемового пропионата, по +0,5 на терминальные атомы азота аргинина и +1,0 лизина. Разница в энергии между двумя положениями системы относительно поля для произвольного поля Ё, соответствующих лизин-модифицированному и нативному цитохрому, составляет.

LU =^qMW (26) где qi — z'-й заряд, ri — его координаты. В случае однородного поля (26) превращается в выражение.

AU ~гц) = E (j}2 -Д) (26а) где ц — дипольный момент Су1 С, а индексы 2 и 1 соответствуют опять лизин-модифицированному и нативному цитохрому. Эта разница в энергии интерпретируется как дополнительная свободная энергия активации, необходимая для того, чтобы молекула модифицированного Су1 С достигла ориентации нативной молекулы. В случае однородно заряженной плоскости с пространственной дисперсией проницаемости выражение (24) может быть подставлено в (25а), давая «нелокальный» аналог уравения (25а): ас/ = ?1ос (^Г,-Апоп1) (266) где.

Кс. Нелокальные эффекты в этом случае сводятся лишь к модификации значений дипольного момента, теперь учитывающих близость каждого из зарядов к заданной поверхности. Для заряженного диска аналитического выражения для Д£/ получить нельзя, и интеграл (26) рассчитывали численно по формуле Симпсона.

— ш.

Эффект модификации лизинового остатка определялся из уравнения константы скорости теории активированного комплекса к = А ехр (-Ав#/квТ) (27) где АС? — свободная энергия активации. Если С/ есть изменение свободной энергии активации за счет модификации, то для модифицированного белка получаем к0 А ехр (- АО /къТ) — ' где к0икконстанты скорости для нативного и модифицированного белка, соответственно. Для каждого из вариантов белка, модифицированных по определенному лизину, рассчитывалось свое значение U, а также экспериментально измерялась величина к/ко. Таким образом, зависимость 1п (к/ко) от U должна быть линейной. В свою очередь, U прямо пропорциональна поверхностной плотности заряда редокс-партнера Cyt С, которая априори неизвестна. Поэтому для всех модификаций Cyt С рассчитывалось отношение U к плотности заряда. Соотношение между поверхностной плотностью заряда и напряженностью поля в случае однородного поля определяется как.

Е = ег /ее о, (29) так что плотность заряда сможет быть выражена в единицах напряженности соответствующего однородного поля, даже"если поле в действительности не является однородным (см. уравнение 26а). Для «нелокального» случая оно представляет собой поле на достаточном удалении от заряженной поверхности. Дополнительная энергия активации рассчитывалась на единицу однородного электрического поля, U/E. Эту величину, следуя авторам [13], мы называем фактором ориентации. Если отложить экспериментально найденные 1п к против рассчитанных значений фактора ориентации для каждого из лизин-модифицированных вариантов Cyt С, получается прямая линия, из наклона которой можно определить неизвестное значение плотности заряда ст: ln (k/ko)=(q/? e0) x (U/E) (30).

Вышеописанная модель требует дальнейшего уточнения и является первым приближением для оценки эффекта пространственного распределения проницаемости, позволяющей, однако, учесть важное физическое свойство воды как структурированного растворителя,.

Вычисление распределения электростатического потенциала вокруг молекулы белка или нуклеиновой кислоты. Распределение электростатического потенциала белка вычислялось путем решения уравнения Пуассона-Больцмана, получаемого при подстановке в правую часть уравнения (13) пространственного распределения зарядов белка или ДНК и пространственного распределения зарядов подвижных ионов, распределенных по энергии по Больцману:

— У^(г)У^(г)) = 4л:(^0(г) + Л^(г))) (31) где ф — потенциал, & -диэлектрическая проницаемость, роплотность зарядов атомов белка или ДНК, для которой будем использовать выражение ро=2,г,(?5(Я) (где г,-, заряд /-го заряженного атома молекулы, — радиус-вектор этого атома, е — заряд электрона), р ехр (-2,еср/?в7) — плотность зарядов ионов (где щ — концентрация ионов /-го типа, 2, — - заряд иона /-го типа. Уравнение (31) нелинейное, т.к. член р1 в правой части содержит неизвестный потенциал под экспонентой.

Кроме уравнения (31), будем также рассматривать упрощенные модели: 1) Уравнение Пуассона (описывает поле молекулы в отсутствие соли в растворе).

— У (^(г)У^(?)) = 4л-р0(г) (32).

2) Линеаризованное уравнение Пуассона-Больцмана:

— У (е (г)У<�р (г)) + к2<�р (г) = 4тгр0 (г) где к2-=е2(Е]"] ^)/квТквадрат обратного радиуса ионной атмосферы дебаевского радиуса).

Граничное условие для потенциала определяется тем, что на достаточном удалении от белковой глобулы потенциал не зависит от диэлектрической проницаемости внутри глобулы. Поэтому для численного решения бесконечную область заменим достаточно большим параллелепипедом Г, на границе которого примем.

Использовались три варианта зависимости диэлектрической проницаемо ста от координат: •.

1) Постоянная диэлектрическая проницаемость во всей области;

2) Ступенчатая зависимость: где ер, е8 — диэлектрические проницаемости белка и воды, г — радиус-вектор ближайшего атома белка, г0 — средний радиус этого атома белка плюс эффективный радиус молекулы растворителя (принят равным 1.4 А) — ш.

3) Плавная экспоненциальная зависимость:

34) ер, если г-гр <�г0 если г-гр >г0.

35).

1/е (г)=(1/бр-1/е8)ехр (-|г — гр|/г0)+1/е8 (36).

При дискретизации области на каждом конечном элементе диэлектрическая проницаемость по всему элементу полагается равной ее значению для радиус-вектора центра элемента. Размер элемента в практических расчетах составлял 0.5−2.0 А, что при величине Л порядка 5 А позволило хорошо приблизить плавную зависимость диэлектрической проницаемости.

Для решения уравнения Пуассона-Больцмана в настоящей работе применен метод, предложенный для решения конечно-разностных систем уравнений [126]. Идея метода состоит в том, что высокочастотные (быстро меняющиеся) компоненты поправки к текущему приближению решения искать на мелкой сетке, а для вычисления соответствующих гладких компонент использовать более грубые сетки. Заданная точность решения дискретной задачи при этом достигается за О (А0 арифметических операций (здесь N — число узлов сетки).

Решение нелинейного уравнения (31) проводилось итерационно.

— У (?У<�рп+1) + ар" н =4я (р0 +р1(<�рп)) + а<�рп (37) где ф" - /2-е приближение решения. Таким образом, на каждой итерации.

V, м-М гч решается линеиная задача относительно ф. В качестве начального приближения берется, например, решение задачи (33).

Для решения задач (31−33) с граничным условием (34) область Г разбивается на конечные элементы. Приближение решения ищется в конечномерном пространстве? базисных функций конечных элементов Ф'(г): = 2й'ф< (38>

Применение к уравнениям (31−33) с учётом (34) и (35) метода Галеркина.

126] приводит к линейной алгебраической системе уравнений для определения коэффициентов и:

Аи=/ (39).

Система (39) решается многосеточным методом. В ММ используется последовательность сеток конечных элементов, таких, что = 2^, 5 м ей,/=0,1 (40) где А/ - шаг сетки с номером /, 51 — соответствующее пространство базисных функций. Сетка с номером 0 — самая грубая (с наибольшим шагом йо). Число неизвестных на ней невелико, поэтому система уравнений для этой сетки может быть быстро решена прямым методом, например, гауссовым исключением. Надо получить решение на самой подробной сетке. Решение системы линейных уравнений на сетке Ь ищется итерациями с использованием вспомогательных сеток 0,1,-1. На каждой итерации задача сводится к меньшей системе на сетке Ь-1, для решения которой рекурсивно применяется тот же алгоритм. Алгоритм одной итерации ММ для сетки / приведен ниже: procedure mgm (/, w/j/J) array uifu if /=0 then iio:=A~lf0 else begin integer Jarray d, vui=RELAX (Ai, ut, fi) — d:= //" ' (fi — Ami) — v:=0- for j:=1 until y do mgm (/-l, v, c/) — щ := м/ + //, v;

W/:=RELAX (Ai, uiji) end.

Здесь величины с индексом I относятся к сетке с номером /- запись обозначает процедуру прямого решения на сетке /=0 с малым числом неизвестных- /- оператор перевода с одной сетки на другуюRELAXитерации типа Гаусса-Зейделя для подавления высокочастотных компонент невязки.

Критерием окончания процесса решения является норма вектора невязки r=f-Au||. Для достижения г/||/||<10″ 5-ь10~б обычно требуется 4−5 итераций. Если же в качестве начального приближения на сетке L взять решение, полученное на сетке 1,-1, то потребуются всего 1−2 итерации.

Методика интерпретации зависимостей скорости и аффинности белок-белковых взаимодействий от ионной силы. Сравнительный анализ соответствия уравнений (4−8) экспериментально полученным зависимостям констант скорости переноса электрона от ионной силы проводился посредством нелинейной регрессии. Поскольку каждое в отдельности из этих уравнений широко применяется к исследованию взаимодействия белков, они приводятся и обсуждаются в Обзоре литературы. Бимолекулярные константы скорости окисления МЬОг и Cyt В5 феррицитохромом С при различных значениях рН и ионной силы имеются в литературе (Обзор литературы). Методом нелинейной регрессии определялись неизвестные параметры уравнения, при которых достигается наименьшая сумма квадратов отклонений экспериментальных точек от теоретической кривой (5), а также-фактор взаимозависимости (?>). В качестве неизвестных параметров в уравнениях (4−6) фигурировали ко, 22 г и так как размеры Су1 В5 и Су1: С примерно одинаковы, а заряды входят в виде произведения во все уравнения, кроме (4). Если заряды в уравнении (4) варьировали независимо, то получали, что 2=-2г.

Для учета рН-зависимых электростатических взаимодействий (в исследуемой области рН это взаимодействия с участием остатков гистидина) проводилась аппроксимация зависимостей от ионной силы при определенном рН (рНг), исходя из параметров уравнения (6), полученных для более высокого рН (рН1), с помощью модифицированного уравнения (6) — е Г рН: ю 8 яе0? къТ гЛ) рн, ехР (-*Арн,) + пс ехр (-х#с) 1 + 1+лЯс ,.

41) в котором фиксировались значения и Я, полученными для рНь и было добавлено пс электростатических взаимодействий индивидуальных зарядов аминокислот при Яс-2 А, как в модели комплементарных взаимодействий. Подгоночными параметрами в этом случае были пс и.

В уравнении (7) задавались размеры дисков р в интервале 3−20 А, а в качестве неизвестных параметров определяли ко и 2Хг! ъ, так как точное значение диэлектрической проницаемости 8 электрон-переносящем комплексе неизвестно и может в подобных системах варьировать от 2 до 80 [127].

Методики химической модификации трипсина поликатионом, измерения скорости ингибирования трипсина соевым ингибитором (СИТ) и констант связывания соевого ингибитора с поликатионом. К поликатиону поли-М-этил-4-винилпиридинийбромйду с молекулярной массой 1.8×105 Ба. содержащему 3% остатков ЛГ-(со-карбоксидодецил-пиридиний-бромида, ковалентно, при помощи 1-циклогексил-3-(2-морфолиноэтил)-карбодиимида пара-толуолсульфоната (КДИ) присоединяли трипсин. Выделение модифицированного белка проводилось методом ионообменной хроматографии на карбоксиметил-целлюлозе, на которой время удержания поликатиона гораздо больше, чем у всех остальных компонентов реакционной смеси. За кинетикой ингибирования трипсина соевым ингибитором следили спектрофотометриче-ски по кинетике гидролиза этилового эфира бензоиларгинина. Таким образом, в исследуемой системе трипсин ковалентно присоединен к поликатиону, а СИТ в условиях эксперимента (рН 8) заряжен отрицательно [128].

Взаимодействие СИТ с поликатионом изучали методом тушения флуоресценции. Для этого в СИТ вводили флуоресцентную метку цинк-копропорфирин (ЦКП), которую ковалентно присоединяли к аминогруппе СИТ по одной из карбоксильных групп ЦКП, активированных КДИ. Выделение модифицированного белка проводилось методом жидкостной хроматографии высокого давления при одновременном детектировании выхода белка (по поглощению) и порфирина (по флуоресценции), так что пик, соответствующий модифицированному белку был единственным, присутствующим на обеих хроматограммах. К СИТ присоединялась одна молекула ЦКП, при этом конъюгат СИТ-ЦКП сохранял 100% ингибиторной активности. Поли-№-этил-4-винилпиридинийбромид, как известно, является эффективным тушителем флуоресценции [129]. При расчете кинетических констант пользовались концентрациями активных центров трипсина и СИТ, определенными по выбросу оптической плотности при добавлению к раствору трипсина нитрофенилгидразинбензоата, а ингибитора — по излому на кривой титрования трипсина ингибиором [130]. Условия кинетических измерений и титрований приведены в подписях к соответствующим рисункам (Результаты и Обсуждение).

Константы диссоциации комплекса конъюгата СИТ-ЦКП с трипсином (в том числе ковалентно связанным с поликатионом) были рассчитаны из кривых титрования трипсина конъюгатом СИТ-ЦКП. Для этого экспериментальные данные подгонялись к уравнению, связывающему концентрацию активных центров фермента Е, с общими концентрациями фермента и ингибитора /о и Ео и концентрацией субстрата 5 [131]:

0 ?

42).

— Е/Е0 Км Е где Км — константа Михаэлиса. Константы Скорости ассоциации трипсина с ингибитором рассчитывались из кинетических кривых убывания концентрации активных центров трипсина в предположении второго порядка реакции.

Пространственное выравнивание структур ДНК-белковых интерфейсов и идентификация инвариантных и вариабельных контактов в них. Для сравнения атом-атомных контактов нескольких ДНК-белковых комплексов необходимо провести пространственное выравнивание интерфейсов. Однако применение общепринятых алгоритмов пространственного выравнивания белковых ж структур (по С-альфа атомам) или двуспиральных ДНК (по параметрам Дикерсона) необоснованно для интерфейсов белок-ДНК, поскольку геометрии белковых альфа-спиралей и двойных спиралей ДНК сильно различаются и по радиусу спирали, и по расположению относительно нее боковых групп. Мы разработали для пространственного выравнивания ДНК-белковых интерфейсов оригинальную процедуру, в которой попеременно (итеративно) совмещаются либо С-альфа атомы узнающих спиралей, либо атомы, участвующие в контактах во всех исследованных комплексах. Пространственное выравнивание производилось с использованием пакета программ МОЬМОЬ.

Идентификация атом-атомных контактов проводилась по пороговому расстоянию 3,35 А для полярных контактов, в том числе и для контактов через молекулу воды, и 3,9 А для неполярных контактов. Инвариантными считались контакты, присутствующие во всех исследованных комплексах.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

ВЫВОДЫ.

1) Разработан вариант многосеточного метода решения уравнения Пуассо-на-Больцмана и построен соответствующий высокоэффективный алгоритм для расчета электростатических потенциалов больших молекул с атомным разрешением: глобулярных белков, протяженных структур (длинные двухцепочечные ДНК до 1000 пар оснований, мембраны, тРНК). Алгоритм реализован в виде программного обеспечения, функционирующего в том числе и в распределенной вычислительной среде ГРИД.

2) Показано, что электростатический лоскут является характеристическим параметром поля вокруг макромолекулы, важным для межмолекулярного узнавания. В белок-белковом узнавании механизм электростатического узнавания посредством полей (электростатических лоскутов) является преобладающим. В этом случае именно лоскут ответственен за раннюю стадию узнавания. Значительно реже встречается механизм контактов заряженных атомов (зарядовая копмлементарность),.

3) Найдено, что размер, форма и положение электростатических лоскутов в семействах белков инвариантны, даже если в их первичных структурах заряженные аминокислоты, образующие лоскуты, не являются инвариантными, указывая на то, что не только структуры белков, но и их электростатические потенциалы подвержены эволюционному отбору и поэтому эволюционно обусловлены.

4) Величина электростатического потенциала промоторных ДНК, являющаяся важной характеристикой при узнавации белками ДНК, определяется её первичной структурой и зависит от степени конденсации противоионов. Появление лоскутов отрицательного потенциала обусловлено степенью конденсации противоионов, равной наблюдаемой в эксперименте.

5) Электростатические потенциалы промоторных ДНК характеризуются протяжёнными участками однородного потенциала, чередующиеся с участками неоднородного потенциала, в частности анизотропного в направлении, перпендикулярной оси спирали. По однородности электростатического потенциала промоторы Е. coli резко различаются также на всей их протяженности. Из потенциалов ДНК периодических последовательностей наиболее однородным является потенциал поли (AT).

6) Найдено, что при образовании атом-атомных контактов в системе гомеодомен-ДНК функция фосфатов ДНК двояка: образование электростатического лоскута и нейтрализация зарядов фосфатов ДНК лизиновыми и аргининовыми остатками белка в интерфейсе ДНК-белковых комплексов. Найдено два типа контактов: инвариантные контакты характеризуют семейство гомеодоменов и выделяют их среди всех ДНК-белковых комплексов. Вариабельные контакты специфичны для индивидуальных комплексов внутри семейства гомеодоменов.

7) Показано, что конденсация противоионов на транспортных РНК, в отличие от двуспиральных ДНК, практически не происходит из-за квазиглобулярной геометрической формы тРНК. Как следствие, электростатические поля тРНК дополнительно индуцируют заряды на аминоацил-тРНК синтетазе посредством ионизации ее гиетидинов, что обеспечивает необходимую специфичность и надёжность узнавания.

8) На модельной системе трипсин+полцкатион-соевый ингибитор (СИТ) экспериментально показано, что электростатические поля способны существенно (два порядка) увеличить скорость белок-белкового взаимодействия. Узнавание происходит посредством связывания СИТ с поликатоном (конденсация) и затем одномерной диффузии СИТ по цепи поликатиона к специфическому месту контакта.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

.

Настоящая работа относится к наиболее ранней и дальней стадии биомолекулярного узнавания — сближению и взаимной ориентации биологических макромолекул. В последние годы в мировой литературе наличие этой стадии постепенно становится общепринятым, и для ее обозначения даже появился новый термин «ухаживание» (англ. courtship) белков и ДНК друг за другом.

170]. Если ранее комплекс столкновения, примерно соответствующий обсуждаемой нами ранней стадии узнавания, считался гипотетическим, то теперь его наличие можно считать установленным экспериментально с помощью нового ЯМР-метода PRE — «Paramagnetic relaxation enhancement» .

171]. Этот метод позволяет измерять расстояния между молекулами до 25 А. Ранее используемый метод (NOE, «ядерны^ эффект Оверхаузера») был ограничен расстояниями 5−6 А. Теперь в рамках этого метода возможна и оценка соответствующих констант ассоциации с помощью титрования [172,173]. Разумеется, молекулярное узнавание этой стадией не исчерпывается. В последнем разделе главы 4, касающейся узнавания ДНК-гомеодомен, рассмотрена и последующая стадия точечных атомных контактов, формирующих интерфейс физиологического комплекса гомеодомена с ДНК, и электростатические эффекты рассмотрены в контексте всего процесса биомолекулярного узнавания.

Оказалось, что для полуколичественного описания ранней стадии узнавания достаточно рассмотреть электростатические лоскуты — односвязные области электростатического потенциала одного знака, ограниченные замкнутой кривой, причем поверхность, на которой изображается лоскут, находится на расстоянии порядка 5 А от молекулярной поверхности белка или ДНК, что примерно соответствует внешней границе второй гидратной оболочки. То есть, лоскуты проявляются именно на таких расстояниях от биомолекул, где воду уже можно считать однородной средой, но энергия единичного заряда в поле данной молекулы все еще превосходит энергию теплового движения. Таким образом, применение весьма грубого приближения — уравнения Пуассона-Больцмана — оказывается именно для этой, наиболее ранней стадии узнавания, оправданным.

Наличие лоскутов выведено в настоящей работе из экспериментальных зависимостей аффинностей белковых комплексов и скоростей их образования от ионной силы. Впервые обнаружено специфическое (функциональное) распределение лоскутов вокруг биополимеров. Оказалось, что если функция гомологичных белков идентична, то лоскуты вокруг них консервативны. Однако те заряженные аминокислоты, которые образуют лоскуты, не всегда являются консервативными. В отличие от консервативных аминокислот, ответственных за пространственную структуру белков, аминокислоты, образующие лоскуты, «консервативны» лишь настолько, настолько это необходимо для консервативности лоскута, но не обязательно консервативны в первичной структуре белка. Из этого следует, что электростатические поля являются тем физико-химический фактором, который подвержен эволюционному отбору, а сами лоскуты являются эволюционно обусловленной характеристикой.

Биологическая значимость лоскутов проявляется в ориентации и фокусировке биомолекул в поле других молекул при их сближении, нейтрализации зарядов фосфатов ДНК зарядами аминокислот лизина и аргинина, одномерной диффузии заряженного белка вдоль цепи заряженного полимера, индукции полем транспортной РНК зарядов на аминоацил-тРНК синтетазе и других явлениях, изученных в настоящей диссертации.

В ряде работ, цитированных в обзорах [1−6], уравнение Пуассона-Больцмана используется и для расчета энергии связывания в комплексах биомолекул, то есть при непосредственном их контакте. Однако фактически (хотя не все авторы это признают) варьируемым параметром в этих работах является положение диэлектрической границы раздела между биомолекулой и растворителем, в зависимости от которой рассчитываемые энергии меняются на порядок величины и даже меняют знак. Если же, как в настоящей работе, рассчитываются и сравниваются электростатические потенциалы биомолекул на достаточно большом расстоянии от белков, эта проблема не возникает. Суть т настоящей работы — не столько в физическом методе расчета электростатических потенциалов, сколько в сравнительном анализе этих электростатических потенциалов, без чего биологический смысл проведенных расчетов в значительной степени теряется. Подобное сравнение электростатических потенциалов белков и их классфикация на этой основе известны, но предсказательная сила этих расчетов весьма ограничена [100,174]. По мнению в диссертанта, причиной является картирование потенциала, рассчитанного, как и в настоящей работе, по Пуассону-Больцману, но, в отличие от нее, непосредственно на молекулярной поверхности, что физически бессмысленно. Как из настоящей работы, так и из литературных данных последних лет следует, что для повышения биологической значимости своих результатов вычислительная молекулярная биофизика должна дополняться сравнительным анализом возможно большего числа белков-гомологов исследуемого белка. Это значит, что должно параллельно решаться большое число однотипных вычислительных задач. Адаптация программного обеспечения для распределенных вычислительных сред, выполненная в рамках настоящей работы, направлена на решение именно таких задач.

С другой стороны, в биоинформатике сравнительный анализ применяется уже давно, но лишь для структур — вначале первичных, а с середины 1990;х годов и третичных, потому что оказалось, что у белков очень непохожих последовательностей могут быть практически идентичные пространственные структуры. Настоящая работа показывает, что и этого недостаточно. Причина в том, что аминокислоты, отличающиеся по положениям и в первичной, и в третичной структурах, могут образовывать похожие электростатические лоскуты. Понимание этого факта в мировом научном сообществе растёт — уже разработаны программные средства для классификации электростатических потенциалов биомолекул [175−177], а среди биоинформатиков-эволюционистов возникло даже понятие «электростатическия эволюция» [178]. Таким образом, настоящая работа, начатая еще в 1980;е годы, теперь оказалась в русле новейших тенденций развития как вычислительной молекулярной биофизики, так и биоинформатики.

Наличие лоскутов оказалось достаточным для ранней стадии молекулярного узнавания, в противоположность необходимости электростатической комплементарности аминокислот контактирующих белков для узнавания, предполагавшейся ранее. Для ряда белков, а также для ДНК в В-форме, показан фокусирующий эффект потенциала на приближающийся партнер-биомакромолекулу. Новым в методическом отношении является применение распределенных вычислений для расчетов электростатических потенциалов ДНК, белков и их комплексов.

Главная проблема, не решенная в настоящей работе, как и в биологической электростатике вообще, связана именно с ролью электростатики во взаимодействиях биомакромолекул. Она состоит в том, что физиологические, среды имеют ионную силу 0,15 М, что соответствует падению потенциала в е раз на расстоянии 8 А, малом по сравнению с размерами белков. Однако эксперименты по определению параметров взаимодействий белков, проводимые в водном растворе при вариации ионной силы от 0.001 до 0.1 М, показывают, что последняя приводит к значительному (на порядки) изменению этих параметров [127]. Таким образом, основное падение приходится на диапазон 0−0.2 М. Физиологическая же ионная сила составляет 0.15 М, при которой электростатические взаимодействия должны быть почти полностью экранированы. Возникает противоречие: за^ем живой клетке нужны электростатические взаимодействия, проявляющиеся в основном при низких, не физиологических, ионных силах?

Разрешить это противоречие возможно, видимо, двумя способами. Во-первых, в цитозоле ионная сила (фактически концентрация солей) не обязательно однородна по клетке. Её физиологическое значение — это лишь среднее по клетке. Во-вторых, коэффициент пропорциональности между дебаевским радиусом и ионной силой включает диэлектрическую константу среды, которая внутри клетки тоже весьма неоднородна. В частности, при небольших (порядка 5А) расстояниях между заряженными объектами имеет место дисперсия диэлектрической проницаемости (Глава 2). Всё это может уменьшить эффективное значение параметра к и увеличить вклад электростатики в термодинамику и кинетику межмолекулярных взаимодействий в клетке. Соответствующее усовершенствование электростатических расчетов, в частности переход с мембранным белкам в природном окружении, а также включение в электростатические расчеты целых органелл, находится в стадии разработки.

Суммируя, отметим, что работа относится к новой междисциплинарной области науки — физической биоинформатике, и в ней обоснована необходимость появления последней как с позиций биофизики, так и с позиций биоинформатики. Обсуждаются ограничения использованного теоретического похода и перспективы его развития, как в плане усовершенствования электростатических расчётов, так и их распространения на большее число биополимерных объектов (вплоть до полных геномов и протеомов) с использованием распределённых вычислений.