Фитохимическое изучение кукурузы столбиков с рыльцами и создание на их основе препаратов гепатопротекторного действия

Актуальность темы

Кукуруза обыкновенная {Zea mays L.) — растение семейства злаковые, син.: мятликовые (Grammineae, syn.: Poaceae), является традиционным источником биологически активных веществ (БАВ), среди которых преобладают вещества фенольного характера [50, 89, 138]. Официнальным лекарственным сырьем кукурузы обыкновенной, зарегистрированным в государственном реестре лекарственных средств в качестве желчегонного препарата, являются столбики с рыльцами [25].

Кукуруза обыкновенная культивируется повсеместно, в том числе и в Алтайском крае. По данным государственной службы статистики по Алтайскому краю только в 2011 году посевная площадь кукурузы на зерно, силос, зеленый корм и сенаж составила более 90 тыс. га [62]. Несмотря на большую сырьевую базу кукурузы обыкновенной, в Алтайском крае в настоящее время заготовка кукурузы столбиков с рыльцами в медицинских целях не проводится. На фармацевтический рынок края поступает сырье, заготовленное в европейской части России, или поставляется из других стран [25, 39].

В ГРЛС РФ внастоящее время зарегистрировано 12 фирм — держателей регистрационного удостоверения на кукурузы столбики с рыльцами, большая часть которых при установлении качества данного лекарственного растительного сырья пользуется требованиями, изложенными в ГФ XI изд. Обращает на себя внимание тот факт, что в указанной НД отсутствуют разделы «Подлинность» (по биологически активным веществам) и «Содержание фармакологически активных веществ», которые являются обязательными разделами в соответствии с требованиями современной НД [25,59]. Наряду с этим, в литературе имеются сведения о методиках спектрофотометрического определения содержания БАВ (флавоноидов и фенолокислот) в кукурузы столбиках с рыльцами, которые отличаются как по параметрам пробоподготовки, так и по аналитической длине волны [52, 106, 152].

Следует отметить, что не существует единого мнения относительно оптимального периода сбора указанного вида лекарственного растительного сырья.

Кукурузы столбики с рыльцами рекомендуется заготавливать как в период молочно-восковой, так и полной спелости початков [24, 86, 89].

Согласно данным в основном зарубежных авторов основными группами фенольных соединений кукурузы столбиков с рыльцами являются флавоноиды (агликоны и С-гликозиды флавонов, в основном, производные лютеолина), фенолокислоты (хлорогеновая, кофейная, феруловая кислоты) и дубильные вещества (гидролизуемая группа) [106, 135, 138, 159]. В то же время, имеются лишь единичные сведения об изучении химического состава кукурузы столбиков с рыльцами, заготовленных на территории России [52].

В официнальной медицине кукурузы столбики с рыльцами используются с первой половины XX века в качестве желчегонного, мочегонного, гемостатического средства [4,46,66]. Однако, с учетом современных данных, спектр фармакологической активности лекарственных средств на основе кукурузы столбиков с рыльцами может быть расширен, в связи с выявлением других видов активности. По нашему мнению, наиболее перспективным является создание препаратов гепатопротекторного действия, т.к., кроме указанной фармакологической активности, кукурузы столбики с рыльцами обладают противовоспалительным, антиоксидантным и желчегонным действиями [66,83, 154,168]. Несмотря на вышеизложенное, официнальных лекарственных препаратов на основе кукурузы столбиков с рыльцами в настоящее время на фармацевтическом рынке страны не существует.

Препараты растительного происхождения являются наиболее востребованной группой гепатопротекторов. Вместе с тем, на фармацевтическом рынке нашей страны указанная группа лекарственных средств представлена в основном препаратами зарубежного производства [25]. Перспективным направлением разработки лекарственных средств гепатопротекторного действия, кроме поиска новых растительных источников БАВ, является также создание комплексных препаратов, содержащих компоненты, отличающиеся по механизму гепатопротеторной активности [54]. Особого внимания, на наш взгляд, заслуживает комбинация растительных препаратов с энтеросорбентами, с успехом используемая в комплексной терапии гепатитов [17, 18], но не нашедшая до сих пор воплощения в одной лекарственной форме.

Вышеизложенные факты свидетельствуют об актуальности проведения комплексных фитохимических исследований кукурузы столбиков с рыльцами, а также необходимости разработки фитопрепаратов на их основе и расширения спектра их применения в медицинской практике.

Цель работы: комплексное изучение химического состава БАВ гидрофильной фракции кукурузы столбиков с рыльцами, заготовленных в Алтайском крае, и разработке на их основе лекарственных препаратов гепатопротекторного действия.

Задачи исследования. В соответствии с поставленной целью определены следующие задачи:

1. Изучить химический состав БАВ гидрофильной фракции кукурузы столбиков с рыльцами.

2. Предложить современные методики количественного определения основных БАВ в сырье и провести их валидационную оценку.

3. Экспериментально обосновать возможность заготовки кукурузы столбиков с рыльцами в качестве лекарственного растительного сырья на территории Алтайского края и выбрать оптимальный срок заготовки.

4. Разработать рациональную технологию получения экстракта кукурузы столбиков с рыльцами сухого и провести его стандартизацию.

5. Изучить острую токсичность, гепатопротекторную и антиоксидантную активности полученного экстракционного препарата.

6. Разработать состав и технологию капсулированной лекарственной формы на основе экстракта кукурузы столбиков с рыльцами сухого, а также провести оценку ее качества.

7. Экспериментально обосновать состав и оптимальную технологию комбинированных таблеток экстракта кукурузы столбиков с рыльцами сухого с энтеросорбентом и провести их стандартизацию.

8. Изучить стабильность сырья, сухого экстракта и твердых лекарственных форм, установить их срок годности и составить проекты нормативной документации. Научная новизна. Впервые проведено углубленное комплексное изучение химического состава БАВ гидрофильной фракции (флавоноиды, фенолокислоты, дубильные вещества, полисахариды) кукурузы столбиков с рыльцами, заготовленных на территории Алтайского края. Изучена зависимость накопления фенольных соединений в сырье от фазы спелости початков кукурузы. Теоретически обоснована и экспериментально подтверждена технология получения сухого экстракта методом многоступенчатого противоточного экстрагирования с последующим сгущением и вакуумной сушкой. Приоритет разработанной технологии подтверждается уведомлением о поступлении заявки на выдачу патента — форма № 94 ИЗ, ПМ, ПО-2011, заявка № 2 012 141 004 «Способ получения средства, обладающего гепатопротекторным действием», авторов Турецковой В. Ф., Дворниковой Л. Г., Мазко О. Н., Смирнова И. В., Золовкиной А. Г. (приложение 24). Выявлены гепатопротекторная (на модели острого токсического гепатита) и антиоксидантная (in vitro) активности экстракта кукурузы столбиков с рыльцами сухого.

Изучены технологические свойства экстракта, выбран оптимальный состав и разработана технология капсулированной лекарственной формы на его основе. Фармакологически обоснована целесообразность сочетания экстракта кукурузы столбиков с рыльцами сухого с энтеросорбентом в одной лекарственной форме, разработан состав и рациональная технология комбинированных таблеток. Разработаны современные научно обоснованные методики качественного обнаружения (ВЭЖХ, СФМ), усовершенствованы методики количественного определения (СФМ) флавоноидов и фенолокислот изучаемого вида сырья, полученного экстракта и твердых лекарственных форм на его основе, проведена их валидация.

Практическая значимость работы. Выявлено, что кукурузы столбики с рыльцами могут заготавливаться в качестве лекарственного растительного сырья на территории Алтайского края, т.к. по содержанию основных БАВ не уступают сырью из других регионов России. Выявлен оптимальный срок заготовки кукурузы столбиков с рыльцами. На основании проведенных экспериментов разработана рациональная технология и создан эффективный стабильный экстракционный препарат из кукурузы столбиков с рыльцами, обладающий гепатопротеторной активностью, на основе которого разработаны состав и технология капсул Маискап и комбинированных с энтеросорбентом СУМС-1 таблеток Маиссорб.

По результатам исследований разработаны проекты ФСП «Кукурузы столбики с рыльцами», «Экстракт кукурузы столбиков с рыльцами сухой», «Маискап капсулы 0,4», «Маиссорб таблетки 0,3» и лабораторные регламенты на производство экстракта кукурузы столбиков с рыльцами сухого, капсул Маискап и таблеток Маиссорб.

В ЗАО «Алтайвитамины» (г. Бийск) проведена апробация предлагаемых технологий получения экстракта кукурузы столбиков с рыльцами сухого, «Маискап капсул 0,4» и «Маиссорб таблеток 0,3» (акты апробации от 19.11.12 г.) (приложения 18−20). Материалы диссертационной работы внедрены в учебный процесс на следующих кафедрах ГБОУ ВПО «Алтайский государственный медицинский университет» Минздрава России: фармацевтической технологии, фармацевтической химии с курсом органической и токсикологической химии, фармакогнозии и ботаники (акты внедрения от 14.11.12 г.) (приложения 21−23).

Положения, выносимые на защиту:

— результаты фитохимического изучения гидрофильной фракции БАВ кукурузы столбиков с рыльцами;

— данные по изучению технологических свойств изучаемого сырья и технологических фактЬров, влияющих на процесс извлечения фенольных соединений;

— итоги исследований по выбору рациональной технологии экстракта кукурузы столбиков с рыльцами сухого и его стандартизации;

— результаты изучения острой токсичности, гепатопротекторной (in vivo) и антиоксидантной (in vitro) активностей экстракта кукурузы столбиков с рыльцами сухого;

— данные по изучению технологических свойств экстракта, выбору оптимального состава, технологии и стандартизации капсул Маискап;

— результаты технологических и фармакологических исследований по обоснованию целесообразности комбинирования экстракта кукурузы столбиков с рыльцами сухого с энтеросорбентом, разработке состава, технологии и стандартизации таблеток Маиссорб;

— экспериментальные данные по изучению стабильности при хранении кукурузы столбиков с рыльцами, экстракта кукурузы столбиков с рыльцами сухого, капсул Маискап и таблеток Маиссорб.

Апробация работы. Основные положения исследований доложены и обсуждены на XI и XII научно-практических конференциях молодых ученых «Молодежь — Барнаулу» (г. Барнаул, 2009, 2010 гг.) — 65-ой, 66-ой, 67-ой региональной конференции по фармации и фармакологии «Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции» (г. Пятигорск, 2010, 2011, 2012 гг.) — межрегиональной научно-практической конференции «35 лет фармацевтическому факультету АГМУ: итоги и перспективы» (Барнаул, 2010) — межрегиональной научной конференции с международным участием, посвященной 70-летию фармацевтического факультета СибГМУ (г. Томск, 2011 г.) — II Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Ученые Урала и Сибири — развитию отечественной фармации: от синтеза до инновационных лекарственных средств», посвященной 300-летию М. В. Ломоносова (г. Новосибирск, 2011 г.) — V Всероссийской конференции с международным участием «Новые достижения в химии и химической технологии растительного сырья» (г. Барнаул, 2012 г.).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 15 работ, из них 3 статьи в изданиях, рекомендованных ВАК.

Связь задач исследования с проблемным планом фармацевтических наук. Работа выполнена в соответствии с планом научно-исследовательских работ ГБОУ ВПО «Алтайский государственный медицинский университет» Минздрава России (номер государственной регистрации 1 200 600 351) как фрагмент комплексной НИР фармацевтического факультета «Изучение природных ресурсов Алтая, пути их рационального использования и совершенствование лекарственного обеспечения населения» (научный руководитель комплексной НИР д-р мед. наук, профессор В.М. Брюханов). Тема утверждена на заседании научно-координационного совета ГОУ ВПО «Алтайский государственный медицинский университет» Росздрава (протокол № 5 от 18.11.2009 г.).

Объем и структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 241 страницах машинописного текста, содержит 63 таблицы, 35 рисунков, 24 приложения и список литературы, включающий 182 литературных источника, в том числе, 91 на иностранных языках.

Во введении обоснована актуальность темы, определены основные цели и задачи, показана научная новизна и практическая значимость работы, основные положения, выносимые на защиту.

Первая глава содержит обзор отечественной и зарубежной литературы, отражающий современное состояние исследований в области фитохимического изучения, фармакологических свойств и применения в медицинской практике кукурузы столбиков с рыльцами. Также представлены данные о современных растительных гепатопротекторах, используемых в лечении заболеваний гепатобилиарной системы.

Вторая глава посвящена описанию объектов исследования, а также методов исследования, используемых в фитохимических, технологических, биофармацевтических и фармакологических экспериментах.

В третьей главе приведены результаты комплексного изучения химического состава БАВ гидрофильной фракции кукурузы столбиков с рыльцами и выбора оптимального срока заготовки сырья.

В четвертой главе приведены результаты исследований по определению технологических свойств кукурузы столбиков с рыльцами, выбору рациональной технологии, разработке технологической схемы получения и стандартизации экстракта кукурузы столбиков с рыльцами сухого. Изложены результаты изучения острой токсичности экстракта кукурузы столбиков с рыльцами сухого, а также его гепатопротекторной и антиоксидантной активностей.

В пятую главу включены результаты исследований по разработке и установлению показателей качества капсул с экстрактом кукурузы столбиков с рыльцами сухим, а также комбинированных таблеток указанного экстракта с энтеросорбентом.

В приложении представлены результаты изучения микробиологической чистоты, сроков годности кукурузы столбиков с рыльцами, экстракта кукурузы столбиков с рыльцами сухого, капсул Маискап и таблеток Маиссорб, проекты ФСП, лабораторные регламенты, основные документы, подтверждающие внедрение результатов диссертационной работы.

ОБЩИЕ ВЫВОДЫ.

1. В результате комплексного фитохимического изучения (методы ТСХ, ВЭЖХ) кукурузы столбиков с рыльцами, заготовленных в Алтайском крае, выявлено их соответствие по составу БАВ гидрофильной фракции сырью, заготавливаемому в других регионах России. При этом установлено наличие девяти флавоноидовпроизводных флавона, которые находятся в форме агликонов, Ои С-гликозидов, среди которых идентифицированы ориентин, лютеолин и апигенин. Доказано присутствие в изучаемом сырье четырех фенолокислот (в том числе, хлорогеновой, феруловой и кофейной кислот), дубильных веществ гидролизуемой группы и полисахаридов.

2. Предлагаемые усовершенствованные спектрофотометрические методики количественного определения флавоноидов и фенолокислот в кукурузы столбиках с рыльцами могут быть рекомендованы для их стандартизации, т.к. обладают соответственно специфичностью, линейностью (Ы2=0,9994 и 0,99 997), повторяемостью (ЯБО = 1,37% и 2,11%), промежуточной прецизионностью (ИБО =.

3,05% и 2,59%) и правильностью (?= 100,35±0,90% и 100,49±0,61%).

3. Заготовку кукурузы столбиков с рыльцами целесообразно проводить в Алтайском крае в связи с высоким содержанием БАВ: флавоноидов (в пересчете на лютеолин) — от 0,45±0,02% до 0,81 ±0,02%, фенолокислот (в пересчете на хлорогеновую кислоту) — от 1,49±0,04% до 2,41±0,06%, дубильных веществ (суммы легкоокисляемых веществ) — от 2,26±0,01% до 4,52±0,02%, полисахаридов — от 3,63±0,01% до 5,30±0,01%.

4. Оптимальным периодом сбора кукурузы столбиков с рыльцами является фаза молочно-восковой спелости початков, т.к. накопление основных групп гидрофильной фракции БАВ в указанный период значительно (в 3−4 раза) превышает аналогичный показатель сырья, заготовленного в период полной спелости початков кукурузы.

5. На основании проведенных экспериментальных исследований и теоретических расчетов выявлены оптимальные значения технологических факторов и параметры технологического процесса получения экстракта кукурузы столбиков с рыльцами сухого с применением метода многоступенчатого противоточного экстрагирования с законченным циклом в батарее из 5 перколяторов с последующим сгущением и вакуумной сушкой, обеспечивающего выход по флавоноидам до 86,66%, фенолокислотам — до 88,63% и экстрактивным веществам — до 86,26%.

6. В ходе фармакологических исследований установлено, что экстракт кукурузы столбиков с рыльцами сухой относится к IV классу опасности (малоопасные вещества) согласно ГОСТу 12.1.007−76. На модели экспериментального токсического гепатита, вызванного тетрахлорметаном, доказано, что изучаемый экстракт проявляет гепатопротекторные свойства в дозировке 100 мг/кг. Для усиления фармакологической активности изучаемого экстракта целесообразно его сочетание с энтеросорбентом СУМС-1 в одной лекарственной форме. Эксперименты, проведенные in vitro, свидетельствовали о том, что механизм гепатопротекторного действия изучаемого экстракта может быть обусловлен антиоксидантной активностью.

7. В результате комплекса проведенных технологических, биофармацевтических и фармакологических исследований выбраны оптимальные составы и технологии твердых дозированных лекарственных форм с экстрактом кукурузы столбиков с рыльцами сухим (капсул Маискап и комбинированных с энтеросорбентом СУМС-1 таблеток Маиссорб), имеющих высокие показатели теста «Растворение» (до 98,22±2,14 и 97,88±2,87% соответственно).

8. Проведена стандартизация, предложены показатели качества и методики анализа флавоноидов и фенолокислот для изучаемого вида сырья, полученного экстракта и твердых дозированных лекарственной форм на его основе, которые положены в основу соответствующих проектов ФСП: «Кукурузы столбики с рыльцами», «Экстракт кукурузы столбиков с рыльцами сухой», «Маискап капсулы 0,4» и «Маисорб таблетки 0,3». Исследование стабильности вышеуказанного сырья и экспериментальных препаратов позволило установить предварительные сроки годности в условиях естественного хранения: для кукурузы столбиков с рыльцами -1,5 года, для экстракта кукурузы столбиков с рыльцами сухого, капсул Маискап и таблеток Маиссорб — 1 год.

Заключение

.

В результате анализа данных литературы установлено, что кукуруза обыкновенная культивируется повсеместно и имеет большую сырьевую базу в Алтайском крае, но при этом заготовка кукурузы столбиков с рыльцами, являющихся официнальным видом лекарственного растительного сырья, в настоящее время не проводится. Кукурузы столбики с рыльцами рекомендуется заготавливать как в фазу молочно-восковой, так и в фазу полной спелости початков.

Основными компонентами гидрофильной фракции БАВ кукурузы столбиков с рыльцами являются флавоноиды группы флавона, представленные в основном С-гликозидами лютеолина, и оксикоричные кислоты (хлорогеновая, феруловая, кофейная кислоты). По данным литературы содержание флавоноидов в кукурузы столбиках с рыльцами варьирует в значительных пределах (от 0,007% до 6,81%), что в значительной мере обусловлено различиями в методиках анализа. Кроме того, установлено присутствие дубильных веществ гидрофильной группы и полисахаридов.

Подавляющее количество работ, посвященных изучению химического состава, предоставлено зарубежными авторами. Состав БАВ кукурузы столбиков с рыльцами, произрастающих на территории РФ изучен недостаточно, при этом отсутствуют сведения о химическом составе данного вида лекарственного растительного сырья, заготовленного в Сибирском регионе, в том числе, и на Алтае.

Имеются многочисленные экспериментальные данные, подтверждающие наличие широкого спектра фармакологической активности у различных извлечений из кукурузы столбиков с рыльцами (антиоксидантное, желчегонное, противовоспалительное действия). Наибольший интерес в данном аспекте представляет гепатопротекторная активность, установленная для водных и метанольных извлечений, однако препараты с вышеуказанной активностью на основе кукурузы столбиков с рыльцами отсутствуют.

В последние десятилетия возрос и имеет тенденцию к дальнейшему распространению удельный вес заболеваний печени. Согласно заключению специалистов ВОЗ, для лечения заболеваний гепатобилиарной системы в основном должны применяться растительные гепатопротекторы. Активность препаратов растительного происхождения обуславливают в основном суммой фенольных соединений. В комплексную терапию заболеваний печени токсической этиологии часто включают энтеросорбенты.

На основании вышеизложенного, представляется целесообразным проведение фотохимических, фармакологических и технологических исследований с целью разработки на основе кукурузы столбиков с рыльцами препарата гепатопротекторного действия.

ГЛАВА II. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

2.1. Выбор объекта исследования.

Объектом исследования являлись кукурузы столбики с рыльцами (Styli сит stigmatis Zea mayais). Заготовку сырья проводили в различных районах Алтайского края (Первомайский, Павловский, Егорьевский, Рубцовский, Косихинский районы) в периоды молочно-восковой или полной спелости початков кукурузы (август — октябрь 2009;2010 гг.). Сырье сушили до воздушно-сухого состояния, упаковывали в двойные бумажные мешки и хранили в сухом прохладном месте.

Вышеуказанные серии кукурузы столбиков с рыльцами были использованы для проведения фитохимических и технологических исследований, в том числе при установлении оптимального срока заготовки сырья (раздел 3.3). Гербарные образцы растения хранятся на кафедре фармацевтической технологии Алтайского государственного медицинского университета.

Выбор кукурузы столбиков с рыльцами был обусловлен тем, что на основе указанного официнального вида лекарственного растительного сырья, имеющего разнообразный состав БАВ и широкий спектр доказанной фармакологической активности, в настоящее время не производятся экстракционные препараты (раздел 1.1.3.2). Дополнительным аргументом в пользу выбора данного объекта исследования является наличие достаточной большой сырьевой базы в Алтайском крае.

Энтеросорбенты. На основании способности сорбировать токсичные продукты среднемолекулярной массы для проведения исследований были выбраны следующие энтеросорбенты: уголь активированный (ЗАО «Медисорб»), полифепан (ЗАО «Сайнтек»), полисорб (ЗАО «Полисорб»), СУМС-1 (АООТ «Новосибирский завод медицинских препаратов»).

Уголь активированный (ФСП-42−0306−7709−06) — черный порошок без запаха и вкусапрактически нерастворим в обычных растворителях. Имеет развитую поверхность (до 1000 м2/г), микропоры и мезопоры, связывает токсичных вещества за счет неспецифического Ван-дер-ваальсового взаимодействия [46].

Полифепан (ФСП 42−0085−1858−01) — природный полимер растительного происхождения на основе гидролизного лигнина, состоящий из лигнина (80%) и непрогидролизованной целлюлозы (20%). Представляет собой темно-коричневый аморфный порошок без запаха и вкусапрактически нерастворим в воде. Полифепан обладает удельной поверхностью до 20 м2/г. В его структуре присутствуют все типы пор, а на поверхности имеется набор функциональных групп (7,3 — 8,8% метоксильных, 7,7 — 8,9% гидроксильных, 5,4 — 6,0% карбонильных и 1,2 — 1,6% карбоксильных), обуславливающих сродство адсорбента как к гидрофобным, так и к гидрофильным адсорбтивам [81].

Полисорб МП (ФСП 42−0333−1711−01) — высокодисперсный полимерный диокид кремния, благодаря непористой структуре которого возможна сорбция молекул любого размера. Удельная поверхность полисорба достигает 300 м /г. На поверхности сорбента находятся свободные силанольные группы (=Si-OH) и гидроксильные группы, связанные водородными связями [27].

СУМС-1 (ФС 42−3283−96) — энтеросорбент на основе механически прочной минеральной матрицы. Представляет собой округлые частицы черного цвета, выпускается в виде микросферических гранул размером до 0,2 мм и гранул размером 0,2−0,1 мм. СУМС-1 не растворяется в воде, биологических и органических средах, обладает высокоразвитой поверхностью, содержащей гидрофильные и гидрофобные центры, мезои макропористой структурой [63].

Вспомогательные вещества. В ходе разработки технологии твердых лекарственных форм на основе экстракта кукурузы столбиков с рыльцами сухого в качестве вспомогательных веществ использовали вещества, разрешенные к медицинскому применению в Российской Федерации, и отвечающие требованиям соответствующей нормативной документации: аэросил — ФС 68−160 211- кальция стеарат — ТУ 6−09−706−76- лактоза — ТУ 6−09−2293−79- лудипресс (лактоза, Kollidon 30 и Kollidon CL) — НД 42−8803−05- магния оксид — ФСП 42−9383−08- натриевая соль карбоксиметилцеллюлозы (Na-КМЦ) — НД 42−11 281−00- поливинилпирролидон (ПВП) — НД 42−8482−98- целлюлоза микрокристаллическая (МКЦ) — НД 42−3728−99.

2.2. Методы исследования, используемые при изучении качественного состава биологически активных веществ.

При анализе качественного состава БАВ кукурузы столбиков с рыльцами, наряду с традиционными методами (качественные реакции, спектрофотометрия, ТСХ), нами были использованы и современные методы анализа (ВЭЖХ).

1) Для качественного обнаружения биологически активных веществ кукурузы столбиков с рыльцами получали извлечения с использованием экстрагентов различной полярности: а) для установления качественного состава флавоноидов и фенолокислот использовали спирт этиловый 40−70%, для качественного обнаружения дубильных веществ и полисахаридов — воду очищеннуюб) извлечения получали при нагревании на водяной бане, соотношении «сырье: экстрагент» — 1:10, времени экстракции — 10 минут [82].

2) Предварительное обнаружение вышеуказанных групп БАВ в кукурузы столбиках с рыльцами проводили с помощью общепринятых качественных химических реакций [24, 82]: а) флавоноиды — цианидиновая проба, реакции с растворами алюминия хлорида, свинца (II) ацетата, железа (III) хлорида, ванилина, натрия гидроксида, с борно-лимонным реактивомб) фенолокислоты — реакция с диазореактивомв) дубильные вещества — реакции с растворами железоаммонийных квасцов, свинца (II) ацетата, желатинаг) полисахариды — реакция осаждения спиртом этиловым 95%.

3) УФ-спектры поглощения снимали на спектрофотометре Сагу 50 в автоматическом режиме в кювете с толщиной слоя 10 мм в интервале длин волн от 230 до 500 нм. В качестве раствора сравнения при снятии УФ-спектров извлечений использовали соответствующий экстрагент, УФ-спектров хелатов флавоноидов с алюминия хлоридом -.аналогичный раствор без алюминия хлорида.

4) Метод ТСХ использовали для разделения и идентификации фенольных соединений кукурузы столбиков с рыльцами. а) Хроматографирование проводили на пластинках «ЭогЬШ ПТСХ-П-В» размером 10><15 см (ООО «Имид», Россия) восходящим способом в вертикальной камере, предварительно насыщенной в течение 24 часов смесью растворителей. б) Для разделения фенольных соединений использовали следующие системы растворителей:

— н-бутанол: уксусная кислота: вода (4:1:2), н-бутанол: уксусная кислота: вода (4:1:5), уксусная кислота: концентрированная хлористоводородная кислота: вода (30:3:10) при изучении состава флавоноидов [8];

— бензол: метанол: уксусная кислота (45:8:3), бензол: метанол (8:2), хлороформ: метанол (4:1), хлороформ: уксусная кислота (3:2) при изучении состава фенолокислот [7]. в) Для приготовления хроматографических систем применяли растворители марок «ч.д.а.» и «х.ч.». Соотношения растворителей, обозначенные цифрами, взяты в объемных единицах. г) Идентифицикацию веществ осуществляли по величине окраске пятен или цвету флюоресценции:

— в видимом и УФ-свете (Х,=365 нм) до и после обработки хроматограммы алюминия хлорида спиртовым раствором 5% с последующим нагреванием при 105 °C в течение 3−5 мин (флавоноиды) [8, 82];

— в УФ-свете, (>.=254 нм) до и после обработки хроматограммы аммиака раствором 10% и в видимом свете после обработки серной кислоты раствором спиртовым 4% (фенолокислоты) [7,82] с последующим нагреванием при 105 °C в течение 3−5 мин.

5) Метод ВЭЖХ применяли для более детального изучения состава флавоноидов и фенолокислот кукурузы столбиков с рыльцами. а) Для изучения нативного состава флавоноидов и фенолокислот использовали спиртовые извлечения из кукурузы столбиков с рыльцами (раздел 2.2.1), для изучения состава агликонов — гидролизат, полученный по стандартной методике с использованием серной кислоты раствора спиртового 10% при соотношении «сырье: экстрагент» — 1:50 [8]. б) Пробоподготовка гидролизата заключалась в реэкстрагировании фенольных соединений смесью «этилацетат: эфир» (1:1) с последующим промыванием органического извлечения водой очищенной до нейтрального значения рН, вакуумной сушкой (40 °С) и растворением сухого остатка в этаноле 95% [78]. в) ВЭЖХ-анализ осуществляли на микроколоночном жидкостном хроматографе «МилиХром А-02» («ЭкоНова», Новосибирск, Россия) с УФ-детектором, с последующей компьютерной обработкой результатов исследования с использованием программы «МультиХром» для Windows. Неподвижная фазахроматографическая колонка ProntoSIL 120−5-С18 AQ размером 2,0×75 мм. Подвижная фаза — А: трифторуксусной кислоты (ТФУК) раствор 0,01%, Б: ацетонитрил 100%. Температура колонки — 35° С, скорость подачи элюента — 100 мкл/мин, объем пробы — 2 мкл, градиентное элюирование — изменение концентрации элюента Б от 5% до 55% при расходе 3000 мкл элюента, А [29]- г) Для приготовления элюентов использовали ацетонитрил для хроматографии «Сорт 1» («Криохром», Россия), ТФУК марки «ч.д.а» («ВЕКТРОН») и воду очищенную, полученную на установке для получения воды аналитического качества «УПВА-5». д) Детектирование веществ осуществляли при 4 длинах волн: 220, 254, 324 и 360 нм по времени удерживания (т, мин), спектральным отношениям (Sx/S22o) и характеру УФ-спектров (А^ах, нм), снятых в процессе хроматографирования.

6) Результаты хроматографических методов исследования интерпретировались в сравнении с аналогичными показателями СО флавоноидов: лютеолина, ориентина, апигенина («SIGMA Aldrich», США), кверцетина, рутина («Sigma-Aldrich», Германия) и оксикоричных кислот: феруловой, хлорогеновой и кофейной кислот («SIGMA Aldrich», США).

7) Все приведенные значения величин X, max, Rf, времени удерживания, спектральных отношений являются средними величинами 5 повторных измерений, при этом отклонения полученных результатов не превышают 5%.

2.3. Методы исследования количественного содержания биологически активных веществ.

Для количественного определения исследуемых групп БАВ были использованы стандартные (дубильные вещества и полисахариды) или усовершенствованные нами в эксперименте методики анализа (флавоноиды, фенолокислоты). Для определения содержания сумм флавоноидов и фенолокислот был использован метод спектрофотометрии в видимой области спектра, который является доступным и широко используется при анализе указанной группы БАВ в лекарственном растительном сырье, в том числе и в кукурузы столбиках с рыльцами.

1) Количественное определение флавоноидов осуществляли методом дифференциальной спектрофотометрии, основанным на реакции комплексообразования флавоноидов с алюминия хлоридом, который часто применяется при анализе указанной группы БАВ в кукурузы столбиках с рыльцами.

32, 52]. В связи с тем, что представленные в литературе методики данного анализа значительно отличаются друг от друга по используемым параметрам и, на наш взгляд, имеют некоторые недостатки (раздел 1.1.2.1), проводили их совершенствование. При этом нами были подобраны оптимальные условия экстрагирования флавоноидов из сырья, необходимое количество раствора алюминия хлорида, установлено оптимальное время протекания реакции комплексообразования (раздел 3.1.2).

Оптическую плотность снимали на спектрофотометре Сагу-50 при длине волны 400 нм (максимум поглощения хелата лютеолина), расчеты проводили с использованием определенного нами (раздел 3.1.2) удельного показателя поглощения хелата л% лютеолина при указанной длине волны (1см-550,84).

2) Количественное содержание фенолокислот определяли спектрофотометрическим методом при длине волны 329 нм (максимум поглощения хлорогеновой кислоты), расчеты проводили с использованием определенного нами.

раздел 3.1.2) удельного показателя поглощения хлорогеновой кислоты при указанной л% длине волны (|си- 535,14). При этом нами были апробированы два различных варианта указанного метода, применяемые при установлении содержания данной группы БАВ в лекарственном растительном сырье: а) экстракционно-спектрофотометрический метод, заключающийся в предварительной реэкстракции фенолокислот из сгущенного спиртового извлечения этилацетатом при рН=2,0 (для отделения от флавоноидов, имеющих максимум поглощения в области спектра, близкой к максимуму поглощения фенолокислот) с последующим спектрофотометрическим определением фенолокислот в этилацетатном реэкстракте [38]- б) прямая спектрофотометрия по методу Фирордта, с использованием принципа аддитивности и значения оптической плотности флавоноидов, найденного.

А1% через удельный показатель поглощения лютеолина при длине волны 329 нм (1см-492,80) и концентрацию флавоноидов, установленную методом дифференциальной спектрофотометрии.

3) Количественное определение дубильных веществ проводили по фармакопейной методике, основанной на окислении данных соединений калия перманганатом с использованием в качестве индикатора индигосульфокислоты. При работе с данной методикой мы учитывали тот факт, что, кроме дубильных веществ, окислению подвергаются и другие легкоокисляемые соединения, поэтому при обсуждении результатов анализа использовали термин «сумма окисляемых веществ» [24].

4) Количественное определение полисахаридов в кукурузы столбиках с рыльцами проводили по стандартной методике гравиметрическим методом после осаждения данных соединений из водного извлечения спиртом этиловым [24].

5) Содержание БАВ в сырье (разделы 2.3.1−2.3.4) определяли в пересчете на абсолютно сухое сырье.

6) Определение суммы экстрактивных веществ осуществляли по методике ГФ XI изд. с использованием в качестве экстрагентов спирта этилового 40−70% [24].

7) При использовании методик количественного определения (разделы 2.3.12.3.4) для анализа вышеперечисленных групп БАВ в экспериментальных препаратах и извлечениях, полученных при разработке оптимальных технологий, были исключены стадии извлечения БАВ и произведен выбор оптимальных разведений, позволяющих получить растворы с оптической плотностью 0,2−0,9 единиц в интересующем интервале длин волн.

2.4. Методы исследования физико-химических и технологических свойств материалов, оценки качества экспериментальных лекарственных форм.

1) Измельченность сырья определяли путем ситового анализа по методике ГФ XI изд. ОФС «Определение измельченности порошков и сита» [24].

2) В качестве параметров для сравнительной характеристики процесса экстрагирования сырья были выбраны время наступления равновесного состояния и коэффициент вымывания [61].

3) Определение. коэффициента вымывания (параметра, характеризующего период «быстрой экстракции») для сырья с различной измельченностью было проведено графоаналитическим способом, путем построения графика зависимости между истощенностью сырья и временем экстрагирования [61].

4) Насыпная масса материалов была определена по методике, предложенной В. Д. Пономаревым [61] на устройстве для вибрационного уплотнения порошков 545Р — АК — 3. Расчеты проводили по формуле: в у = —, где л у — насыпная масса, г/см ;

0 — масса сырья, г;

Вд — объем, занимаемый сырьем, см. 5) Выбор ёмкости диффузоров для проведения процесса экстрагирования осуществляли по методике И. А. Муравьева и Ю. Г. Пшукова [51]. Расчеты проводили по формулам: = В2+ОхА где.

1 — объем перколятора, см3;

В2 — объем заливаемого экстрагента, см3- в — масса сырья, гД — коэффициент вытеснения.

Д — В-,.

А = ¦

Г’В°, где.

В] - суммарный объем, занимаемый сырьем и экстрагентом, см3- Во — объем, занимаемый сырьем, см3- у — насыпная масса, г/см3.

6) При определении оптимального соотношения «сырье: экстрагент» ориентировались на необходимую величину «зеркала» экстрагента (свободный слой экстрагента не менее 3 мм) над поверхностью сырья с выбранной измельченностью.

7) Описание (внешний вид, вкус и запах) экстракта проводили органолептически. Растворимость определяли по методике ГФ XII изд. ОФС 42−4 907 «Растворимость» [23].

8) Содержание тяжёлых металлов в экстракте определяли по методике ГФ XI изд. ОФС «Экстракты» [24].

9) Микробиологическую чистоту кукурузы столбиков с рыльцами, экстракта и лекарственных форм на их основе определяли по методикам ГФ XII изд. ОФС 420 067−07 «Микробиологическая чистота» на базе Барнаульского филиала ФГУ «Федеральный центр гигиены и эпидемиологии по железнодорожному транспорту».

10) Потерю в массе при высушивании (X, %) сырья и экстракта определяли стандартным методом по методикам ГФ XI изд. (ОФС «Определение влажности лекарственного растительного сырья» и ОФС «Экстракты») высушиванием навески в предварительно высушенных до постоянной массы и взвешенных бюксах в сушильном шкафу в течение двух (пяти) часов.

11) Гигроскопичность (способность поглощать влагу) оценивали по методике определения потери в массе при высушивании после выдерживания бюкса с навеской в камере с относительной влажностью воздуха 100% в течение 24 часов.

12) Отсыреваемость материалов оценивали по методике определения потери в массе при высушивании после выдерживания бюкса с навеской на воздухе с относительной влажностью 60−65% в течение 24 часов.

13) Фракционный (гранулометрический) состав изучаемого экстракта определяли ситовым анализом с помощью стандартного набора сит (диаметр отверстий 2,0, 1,0, 0,5, 0,4, 0,3, 0,2 и 0,1 мм) по методике ГФ XI изд. ОФС «Определение измельченности порошков и сита» [24].

14) Сыпучесть определяли на виброустройстве для снятия характеристик сыпучих материалов ВП — 12А по стандартной методике. Расчет проводили по формуле [44]:

V — сыпучесть, г/сек;

М — масса навески, г;

Т — полное время опыта, сек;

20 — время утряски, сек.

15) Угол естественного откоса (угол между образующей конуса из сыпучего материала и горизонтальной плоскостью) определяли с помощью прибора ВП — 12А. При интерпретации результатов экспериментов учитывали то, что угол естественного откоса для хорошо сыпучих материалов должен изменяться в пределах от 25 до 30°, для связных материалов от 60 — 70° [44].

16) Адсорбционную активность энтеросорбентов и таблетируемых смесей определяли по способности сорбировать метиленовый синий (маркер токсинов среднемолекулярной структуры) с последующим спектрофотометрическим определением остаточной концентрации метиленового синего в растворе [65].

17) Прессуемость материалов оценивали по прочности таблеток на сжатие с помощью устройства для определения прочности таблеток АК 9 М-00−00 ПС. Таблетки получали на лабораторном гидравлическом прессе при давлении прессования 120 кгс/см2 [9].

18) Прочность таблеток на истирание определяли согласно требованиям ГФ XI изд. ОФС «Таблетки» на приборе для определения прочности таблеток на истирание ИС1 [24].

19) Распадаемость таблеток и капсул определяли согласно требованиям ГФ XI изд. ОФС «Таблетки» на лабораторном идентификаторе процесса — приборе 545 Р-АК-1 «Качающаяся корзинка» [24].

20) Оценку качества лекарственных форм по тесту «Растворение» проводили согласно ОФС 42−0003−00 «Растворение» с использованием прибора для растворения лекарственных веществ из таблеток и капсул АК 7 М-00−00 ПС («Вращающаяся корзинка»). При испытании корзинка вращалась в среде растворителя (растворитель вода очищенная, объем — 500 мл) со скоростью 100 об/мин. В процессе определения с помощью термостата поддерживали температуру 37±1° С. Через 45 минут отбирали пробу раствора, фильтровали и в фильтрате проводили количественное определение флавоноидов по усовершенствованной нами методике (раздел 3.1.2).

2.5. Методы фармакологических исследований.

1) Эксперименты in vivo проводили в зимне-весенний период на сертифицированных животных обоего пола (135 крыс линии Wistar и 30 нелинейных белых мышей), предоставленных Институтом цитологии и генетики СО РАН. Животные находились в стандартных условиях содержания при естественном световом режиме, свободном доступе к воде и пище. Для проведения опытов формировались группы методом случайной выборки из особей, имеющих близкую массу тела, контролируемую периодическим взвешиванием для коррекции количества вводимых препаратов.

2) Эксперименты на животных осуществляли при строгом соблюдении требований Европейской конвенции «О защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных или иных научных целей» (Страсбург, 1986 г.) и «Правил лабораторной практики в Российской Федерации» (приказ МЗ РФ № 708н от 23.08.2010 г.).

3) Изучение острой токсичности экстракта кукурузы столбиков с рыльцами сухого осуществляли согласно «Методическим указаниям по изучению общетоксического действия фармакологических веществ» [68] на 30 крысах массой тела 230−250 г и на 30 мышах массой 19−21 г. а) Животные каждого вида были разделены на 3 группы, по 5 самок и 5 самцов в каждой. Препарат вводили в дозах 3000, 5000, 7000 мг/кг для крыс и 7000, 11 700 и 16 300 мг/кг для мышей в виде водного раствора в 2−3 приема в течение 6 часов. При выборе доз исходили из растворимости экстракта и максимальных объемов жидкости, рекомендуемых для перорального введения экспериментальным животным. б) Токсическое действие исследуемого препарата оценивали по клинической картине интоксикации и выживаемости животных в течение 14 дней. Массу тела животных регистрировали до введения препарата и на 14 сутки наблюдения [68].

4) Гепатопротекторную активность экстракта кукурузы столбиков с рыльцами сухого и его смесей с энтеросорбентами изучали на модели экспериментального острого гепатита, индуцированного тетрахлорметаном. Эксперименты проводили на 105 крысах массой 195−245 г (по 15 животных в группе). а) Экспериментальный острый гепатит вызывали путем внутрижелудочного введения животным 1 мл 25% раствора тетрахлорметана в персиковом масле в течение 6 суток. Экспериментальные препараты и препарат сравнения «Легалон» вводили перорально в виде суспензии в крахмальном клейстере 2% один раз в сутки в течение 21 дня после формирования модельной патологии. Экспериментальные группы животных и режим назначения препаратов представлены в табл. 2.1.