Диплом, курсовая, контрольная работа
Помощь в написании студенческих работ

Пространственная структура комплексов и механизм каталитического действия фермента SAICAR-синтазы Saccharomyces cerevisiae

Диссертация: Пространственная структура комплексов и механизм каталитического действия фермента SAICAR-синтазы Saccharomyces cerevisiae
ДиссертацияПомощь в написанииУзнать стоимостьмоей работы

Два из представленных комплексов, тройной комплекс и комплекс с аспарагиновой кислотой, исследованы при разрешении lA. Высокое разрешение позволило не только впервые определить положение малой молекулы — аспарагиновой кислоты, но также получить наиболее полную информацию о структуре фермента, подвижности боковых групп и основной цепи аминокислотных остатков белка и, наконец, обнаружить… Читать ещё >

Содержание

  • Список употребляемых в диссертации сокращений
  • Глава 1. Литературный обзор

1. Биосинтез пуриновых нуклеотидов. 8 1.2 SAICAR-синтаза Saccharomyces cerevisiae. 12 1 2 1 Биохимические свойства фермента SAICAR-синтазы Saccharomyces cerevisiae.. 14 1 2 2 Пространственная структура SAICAR-синтазы Saccharomyces cerevisiae.

1 2 3 Сравнение структуры SAICAR-синтазы с другими АТР-зависимыми ферментами цикла биосинтеза пуриновых нуклеотидов

Глава 2. Рентгеноструктурное исследование комплексов SAICAR-синтазы Saccharomyces cerevisiae.

2.1 Получение и очистка фермента.

2 2 Исследование комплекса (SS+ASP).

2

1. Получение кристаллов.

2.2.2. Измерение интенсивностей дифракционных отражений

2.

3. Определение и уточнение структуры комплекса (SS+ASP) 26 2 2 4 Анализ качества модели.. 29 2 2 5 Структура комплекса (SS+ASP). 29 2 3 Исследование комплексов с аденозинтрифосфатом, (SS+ATP)-I и (SS+ATP)-II

2 3 1 Получение кристаллов комплексов с аденозинтрифосфатом

2.

2. Измерение интенсивностей дифракционных отражений 35 2 3 3 Определение структуры комплексов с АТР

2 3.4 Анализ качества моделей.

2.3.5 Структуры комплексов (SS+ATP)-I и (SS+ATP)-II

2.4. Исследование комплекса с AICAR и янтарной кислотой (SS+AIC+SUC).

2.4.1. Получение кристаллов комплексов с AICAR и янтарной кислотой

2.4.2. Измерение интенсивностей дифракционных отражений

2.4 3 Определение структуры комплекса (SS+AIC+SUC)

2.4 4 Анализ качества модели

2 4 5 Структура комплекса (SS+AIC+SUC).

2.5. Исследование комплекса с аденозинтрифосфатом, AICAR и янтарной кислотой (SS+ADP+AIC+SUC).

2 5.1 Получение кристаллов комплекса (SS+ADP+AIC+SUC).

2.5 2 Измерение интенсивностей дифракционных отражений. 56 2 5 3 Определение структуры комплекса (SS+ADP+AIC+SUC).

2.5.4 Анализ качества модели.

2.5.5. Структура комплекса (SS+ADP+AIC+SUC).

2.6. Исследование комплекса с SAICAR (SS+SAICAR).. 78 2 6.1. Получение кристаллов комплексов с SAICAR.

2.6 2 Измерение интенсивностей дифракционных отражений

2

3. Определение структуры фермент-субстратного комплекса

2

4. Анализ качества модели.

2

5. Структура комплекса (SS+ SAICAR).

Глава 3. Сравнение пространственной структуры SAICAR-синтазы Saccharomyces cerevisiae с пространственными структурами SAICAR-синтаз Thermatoga maritima и Е coll.

3.1. Сравнение с SAICAR-синтазой Thermatoga maritima.

3.2. Сравнение с SAICAR-синтазой Е coli.

Глава 4. Механизм каталитической реакции SAICAR-синтазы

4.1. Предлагаемые модели механизмы каталитической реакции

SAICAR-синтазы.

2. Каталитический механизм SAICAR-синтазы Saccharomyces serevisiae.

Пространственная структура комплексов и механизм каталитического действия фермента SAICAR-синтазы Saccharomyces cerevisiae (реферат, курсовая, диплом, контрольная)

Пуриновые и пиримидиновые нуклеотиды — важнейшие участники клеточного метаболизма как в низших, так и в высших живых организмах. Помимо того, что они являются мономерными единицами нуклеиновых кислот и играют ключевую роль в репликации ДНК и энергетическом обмене клетки, они также выполняют функции регуляторов, сигнальных молекул и кофакторов ферментов. В связи с этим изучение структуры и действия ферментов, участвующих в их биосинтезе, может быть использовано для создания антисептических и противоопухолевых лекарств на основе специфических ингибиторов пуринового биосинтеза de novo [1]-[9]. Синтез de novo пуриновых и пиримидиновых мононуклеотидов в клетках осуществляется в ходе цепочки превращений из низкомолекулярных азотистых предшественников и является в значительной степени инвариантным процессом для известных биологических организмов [10]. Цикл пуринового биосинтеза осуществляется за 10 ступеней в высших организмах и за 11 ступеней (включая дополнительную промежуточную ступень) в большинстве микроорганизмов [11], последовательно превращающих 5-фосфорибозил-1-пирофосфат в инозинмонофосфат (IMP), который за два следующих шага преобразуется либо в аденозинмонофосфат (AMP), либо в гуанозинмонофосфат (GMP). Стремительное развитие в последние годы методов рентгеновской кристаллографии позволило значительно увеличить количество расшифрованных белковых структур. Однако, несмотря на то, что в настоящее время известны пространственные структуры всех ферментов, осуществляющих 11 этапов синтеза de novo IMP, пространственные структуры комплексов ферментов с лигандами (субстратами, ингибиторами или продуктами), дающие информацию, необходимую для понимания механизма их каталитического действия, определены только для пяти из них [12]. Более того, ни для одного из 6-ти ферментов этого цикла, использующих в качестве субстратов АТР, мононуклеотид и малую молекулу, не исследован комплекс, содержащий все три субстрата одновременно, а также отсутствуют экспериментальные данные для определения положения малой молекулы. Данная работа, выполненная с использованием методов рентгеноструктурного анализа, восполняет эти пробелы в отношении SAICAR-синтазы, фермента, катализирующего восьмую ступень биосинтеза пуриновых нуклеотидов. В ней представлены пространственные структуры 6-ти комплексов SAICAR-синтазы с лигандами:

• аспарагиновой кислотой (SS+ASP);

• аденозинтрифосфатом (SS+ATP)-I и (SS+ATP)-II;

• аналогами субстратов AICAR и янтарной кислотой (SS+AIC+SUC);

• аденозинтрифосфатом и аналогами субстратов AICAR и янтарной кислотой (SS+ADP+AIC+SUC);

• продуктом реакции SAICAR (SS+SAICAR).

Два из представленных комплексов, тройной комплекс и комплекс с аспарагиновой кислотой, исследованы при разрешении lA. Высокое разрешение позволило не только впервые определить положение малой молекулы — аспарагиновой кислоты, но также получить наиболее полную информацию о структуре фермента, подвижности боковых групп и основной цепи аминокислотных остатков белка и, наконец, обнаружить конформационные изменения активного центра молекулы фермента, сопровождающие реакцию. Данные, полученные из структур комплексов, о расположении и характере связывания субстратов и продуктов в белковой молекуле, а также о конформационных изменениях ее активного центра позволили предложить механизм каталитической реакции SAICAR-синтазы и могут быть полезны для понимания каталитического механизма других ферментов, осуществляющих синтез амидной связи.

В связи с вышесказанным ОСНОВНЫМИ ПОЛОЖЕНИЯМИ, ВЫНОСИМЫМИ НА ЗАЩИТУ, являются:

1. Определенные методами рентгеноструктурного анализа пространственные структуры 6-ти комплексов фермента SAICAR-синтазы;

2. места и характер связывания субстратов в активном центре фремента;

3. конформационные изменения молекулы SAICAR-синтазы при связывании субстратов;

4. предполагаемый механизм каталитического действия SAICAR-синтазы.

Основные результаты и выводы.

1. Определена и уточнена пространственная структура комплекса фермента SAICAR-синтазы с субстратом аспарагиновои кислотои с разрешением 1.0 А. Определены место и характер связывания молекулы аспарагиновой кислоты в активном центре фермента.

2. Определены и уточнены пространственные структуры двух комплексов фермента SAICAR-синтазы с аденозинтрифосфатом с разрешением 1.4 и 2.05 А. На основании сравнения связывания молекулы АТР в активном центре фермента получено рентгеноструктурное подтверждение установленной биохимическими исследованиями зависимости конформации фосфатных групп АТР от концентрации ионов магния.

3. Определена и уточнена пространственная структура комплекса фермента SAICAR-синтазы с аналогами субстратов AICAR и янтарной кислотой с разрешением 1.3 А. Определены место и характер связывания молекулы янтарной кислоты и частично молекулы AICAR в активном центре фермента.

4. Определена и уточнена пространственная структура комплекса фермента SAICAR-синтазы с аденозинтрифосфатом и аналогами субстратов AICAR и янтарной кислотой с разрешением 1.0 А. Определены место и характер связывания молекул АТР и AICAR в активном центре фермента. Молекулы янтарной кислоты обнаружены в побочных местах связывания.

5. Определена и уточнена пространственная структура комплекса фермента SAICAR-синтазы с продуктом ферментативной реакции SAICAR с разрешением 2. о А.

Определено место и характер связывания молекулы SAICAR в активном центре фермента.

6. В результате сравнения структур полученных комплексов выявлены конформационные изменения белковой молекулы, сопровождающие реакцию.

7. На основании анализа пространственной структуры активного центра полученных комплексов, а также выявленных конформационных изменений предложен возможный механизм каталитической реакции SAICAR-синтазы.

8. Координаты и соответствующие структурные факторы исследованных комплексов размещены в банке данных белковых структур Protein Data Bank с идентификационным номерами 10BD, 10BG, 2CNQ, 2CNU и 2CNV.

Автор выражает глубокую благодарность.

B.Р. Мелик-Адамяну за руководство диссертационной работой, обсуждение результатов и поддержку;

A.И. Гребенко за предоставление превосходных кристаллов, позволивших собрать экспериментальные данные высокого разрешения, и дружеское участие;

C.В. Антонюк за помощь в получении и обработке данных и участие в обсуждении результатов;

B.C. Ламзину за предоставление возможности использовать оборудование и компьютеры EMBL для выполнения работы;

И.П. Курановой за ценные советы по ходу работы и благожелательное отношениевсем сотрудникам Лаборатории белковой кристаллографии за моральную поддержку и интерес, проявленный к работе.

Показать весь текст

Список литературы

  1. Bal, J. and Pieniazek, N.J. Detection of 5-amino-4-imidazole-N-succinocarboxamide ribotide and hypoxanthine accumulation. A simple method for identification of some purine auxotrophs. J Chromatogr, 1979. 169: p. 474−6.
  2. Wadman, S.K., et al. Detection of inherited adenylosuccinase deficiency by two dimensional thin layer chromatography of urinary imidazoles. Adv Exp Med. Bio}, 1986. 195 Pt A: p. 21−5.
  3. Van den Bergh, F., et al. Functional studies in fibroblasts of adenylosuccinase-deficient children. J Inherit Metab Dis, 1993. 16(2): p. 425−34.
  4. Van den Bergh, F., et al. Adenylosuccinase activity and succinylpurine production in fibroblasts of adenylosuccinase-deficient children. Adv Exp Med Biol, 1991. 309B: p. 277−80.
  5. Mathews, C.K.V.H., K.E. Biochemistry, 1996(Menlo Park, CA, USA: Benjamin/Cummings).
  6. Kappock, T.J., Ealick, S.E. and Stubbe, J. Modular evolution of the purine biosynthetic pathway. Curr Opin Chem Biol, 2000. 4(5): p. 567−72.
  7. Bernstein, F.C., Tasumi, M. The Protein Data Bank: a computer-based archival file for macromolecular structures. J. Mol. Biol., 1977. 112: p. 535−542.
  8. T.T., Коровкин, Б.Ф. Биологическая химия. 1998, Москва: Медицина.
  9. Miller, R.W. and Buchanan, J.M. Biosynthesis of the purines: XXVII. N-(5-amino-l-ribosyl-4-imidazolylcarbonyl)-L-aspartic acid 5'-phosphate kinosynthetase. J. Biol. Chem., 1962. 237: p. 458−490.
  10. Hartman, S.C. and Buchanan, J.M. Biosynthesis of the purines.
  11. XXII. 2-Amino-N-ribosylacetamide-5'-phosphate kinosynthase. J Biol Chem, 1958. 233(2): p. 456−61.
  12. Kornberg, A., Lieberman, I., Simms, E.S. Enzymatic synthesis of purine nucleotides. J Biol Chem., 1955. 215(l)(Jul-): p. 417−27.
  13. Mathews, I.I., Kappock, T.J., Stubbe, J.A. and Ealick, S.E. Crystal structure of Escherichia coli PurE, an unusual mutase in the purine biosynthetic pathway. Structure, 1999. 7(11): p. 1395−1406.
  14. Lukens, L.N. and Buchanan, J.M. Biosynthesis of the purines.
  15. XXIII. The enzymatic synthesis of N-(5-amino-l-ribosyl-4-imidazolylcarbonyl)-L-aspartic acid 5'-phosphate. J Biol Chem, 1959. 234(7): p. 1791−8.
  16. Ostanin, K.V., et al. Isolation and properties of phosphoribosyl-succinocarboxamide-aminoimidazole synthetase from the yeast Saccharomyces cerevisiae. Biokhimiya (USSR), 1989. 54: p. 12 651 273.
  17. Bairoch, A. SwissProt Protein Sequence Databank User Manual. 1990, EMBL Data Library: Heidelberg, FRG.
  18. Altschul, S.F., Madden, T.L., Schaffer, A.A., Zhang, J., Zhang, Z., Miller, W. & Lipman, D.J., Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs. Nucl. Acids Res., 1997. 25: p. 3389−3402.
  19. Alenin, V.V., et al. Substrate specificity of Phosphoribosyl-aminoimidazole-succinocarboxamide-synthetase (SAICAR-synthetase) of the yeast Saccharomyces cerevisiae. Biokhimiya (USSR), 1992. 57(6): p. 845−855.
  20. ISIS/DRAW, http://www.liv.ac.uk/ctichem/isis.html, 1994.
  21. Myasnikov, A.N., et al. The Saccharomyces cerevisiae ADE1 gene: structure, overexpression and possible regulation by general amino acid control. Gene, 1991. 109(1): p. 143−7.
  22. B.B., Домкин, В.Д. Синтез аналогов 5-амино-4-карбокси-1 -(5'-фосфо-Ь-0-рибофуранозил)имидазола (КАИР). ЖОХ, 1974. 45(6).
  23. Tyagi, А.К., et al. Determinants of the toxicity of L-alanosine to various organs of the mouse. Toxicology, 1981. 21(1): p. 59−69.
  24. Grebenko, A.I., et al. Crystallization and preliminary X-rayinvestigation of phosphoribosylaminoimidazolesuccinocarboxamidesynthase from the yeast Saccharomyces cerevisiae. J. Mol. Biol., 1992. 228: p. 298−299.е^енко
  25. B.M., Г.А.И., Барынин B.B., и др. Пространственная структура SAICAR-синтазы из дрожжей Saccharomyces cerevisiae с разрешением 1.9 А. Кристаллография., 1996. 41(2): р. 293.
  26. Levdikov, V.M., et al. The structure of SAICAR synthase: an enzyme in the de novo pathway of purine nucleotide biosynthesis. Structure, 1998. 6(3): p. 363−76.
  27. Delano, W.L. The PyMOL Molecular Graphics System. http://ww.pvmol.org, 2002.
  28. Schulz, G.E. Binding of nucleotides to proteins. Curr. Opin. Struct. Biol., 1992. 2: p. 61−67
  29. Rossman, M.G., Moras, D. & Olsen, K.W. Chemical and biological evolution of a nucleotide-binding protein. J. Mol.Biol., 1974. 250: p. 194−199.
  30. Rossman, M.G., Lilijas, A., Branden, C.-I. & Banaszak, L.J. Evolutionary and structural relationships among dehydrogenases In The Enzymes, 1975. 1 lA (3rd edition): p. 61−102.
  31. Flaherty, K.M., DeLuka-Flaherty, C. & McKay, D.B. Three-dimensional structure of the ATPase fragment of a 70K heat-shock cognate protein. Nature, 1990. 346: p. 623−628.
  32. Flaherty, K.M., McKay, D. B, Kabsch, W. & Holmes, K.S. Similarity of the tree-demensional structure of actin and the ATPase fragment of a 70K heat-shock cognate protein. Proc. Natl. Acad. Sci, 1991. 88(USA): p. 5041−5045.
  33. Kabsch, W, Mannherz, H.G., Suck, D, Pai, E.F. & Holmes, K.C. Atomic structure of the actin: DNase I complex. Nature, 1990. 347(37−44).
  34. Matsuda, K, Mizugichi, K, Nishioka, T, Kato, H, Go, N. & Oda, J. Crystal structure of glutathione synthetase at optimal pH: domain architecture and structural similarity with other proteins. Protein Eng., 1996. 9: p. 1083−1092.
  35. Waldrop, G. L, Rayment I. & Holden H.M. Three-dimentional structure of the biotin carboxylase subunit of acetyl-CoA carboxylase. Biochemistry, 1994. 33: p. 10 249−10 256.
  36. Artymiuk, P.J., Poirrette, A.R., Raice, D.W. & Willett, P. Biotin carboxylase comes into the fold. Nat. Struct. Biol., 1995. 3: p. 128 132.
  37. Fan, C., Moews, P.C., Walsh, C.T. & Knox, J.R. Vancomycin resistance: structure of D-alanine: D-alanine ligase at 2.5 a resolution. Science, 1994. 266: p. 439−443.
  38. Hubbard, T.J.P., Murzin, A.G., Brenner, S.E. & Chothia, C. SCOP: a structural classification of proteins database. Nucl. acids Res., 1997. 25: p. 236−239.
  39. Knighton, D.R., et al., & Sowadski, J.M. Crystal structure of the catalitic subunit of cyclic adenosine monophosphate-dependent protein kinase. Science, 1991. 253: p. 407−414.
  40. Wang, W., Kappock, T.J., Stubbe, J., Ealick, S.E. X-ray crystal structure of glycinamide ribonucleotide synthatase from Escherichia coli. Biochemistry, 1998. 37: p. 15 647−15 662.
  41. Thoden, J.B., Kappock, T.J., Stubbe, J., Holden, H.M. Three-dimentional structure of N5-carboxyaminoimidazole ribonucleotide synthetase: a member of ATP grasp protein superfamily. Biochemistry, 1999. 38(15 480−15 492).
  42. Thoden, J.B., Firestine, S., Nixon, A., Benkovic, S.J. and Holden, H.M. Molecular structure of Escherichia coli PurT-encoded glycinamide ribonucleotide transformylase. Biochemistry, 2000. 39: p. 8791−8802.
  43. Hoi, W.G.J., van Duijnen, P.T. & Berendsen, H.J.C. The a-helix dipole and the properties of proteins. Nature, 1978. 273(8 June): p. 443−446.
  44. , D.R., & Segal, D.M. Protein crystallization: micro techniques involving vapour diffusion. Methods in Enzymology, 1971. 22: p. 266−269.
  45. Popov, A.N. and Bourenkov., G.P. Choice of data-collection parameters based on statistic modelling. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr., 2003. 59: p. 1145−53.
  46. Otwinowski, Z. and Minor, W. Processing of X-ray diffraction data collected in oscillation mode., in Methods in Enzymology. 1997. p. 307−326.
  47. Murshudov, G.N., Vagin, A.A. and Dodson, E.J. Refinement of macromolecular structures by the maximum-likelihood method. Acta Crystallogr., 1997. D53: p. 240−255.
  48. Lamzin, V.S. and Wilson, K.S. Automated refinement of protein models. Acta Crystallogr., 1993. D49: p. 129−147.
  49. Jones, T.A., et al. Improved methods for building protein models in electron density maps and the location of errors in these models. ActaCryst., 1991. A47: p. 110−119.
  50. Jones, T.A. and Kjeldgaard, M. Electron-density map interpretation. MethEnzymol, 1997. 277: p. 173−208
  51. Sheldrick, G.M. Program for the solution of crystal structures. University of Groningen, Germany, 1997.
  52. Cruickshank, D.W.J. Remarks about structure precision. Acta Crystal., D, 1999. 55: p. 583−601.
  53. Laskowski, R.A., et al. PROCHECK: a program to check the stereochemical quality of protein structures. J. Appl. Cryst.,. 1993. 26: p. 283−291.
  54. Ramachandran, G. N, Ramakrishnan, C. and Sasisekharan, V. Stereochemistry of polypeptide chain conformations. J. Mol. Biol, 1963. 7: p. 95−99.
  55. Vagin, A.A. and Teplyakov A. MOLREP: an automated program for molecular replacement. J. Appl. Cryst, 1997. 30: p. 1022−1025.
  56. Collaborative Computational Project, The CCP4 Suite: Programs for Protein Crystallography. Acta Cryst, 1994. D50: p. 760−763.
  57. Jones, T.A. A graphics model building and refinement system for macromolecules. J. Appl. Cryst, 1978. 11: p. 268−272.
  58. Esnouf, R.M. Further additions to MolScript version 1.4, including reading and contouring of electron-density maps. Acta Crystallography 1999. D55: p. 938−940.
  59. Martz, E. Protein Explorer, http://proteinexplorer.org, 2005.
  60. Zhang, R, et al. Structure of SAICAR synthase from Thermotoga maritima at 2.2 angstroms reveals an unusual covalent dimer. Acta Crystallograph. SectJ7 Struct JBioLCryst. Commun, 2006. 62(Pt 4): p. 335−9.
  61. Ginder, N. D, et al. Nucleotide Complexes of Escherichia coli Phosphoribosylaminoimidazole Succinocarboxamide Synthetase. J. BioUChem, 2006. 281(30): p. 20 680−8.
  62. Antonyuk, S. V, et al. X-ray diffraction study of the complexes of SAICAR synthase with Adenosinetriphosphate. Crystallography Reports, 2001. 46(4): p. 620−625.
  63. Nelson, S. W, et al. Mechanism of action of Escherichia coli phosphoribosylaminoimidazolesuccinocarboxamide synthetase. Biochemistry, 2005. 44(2): p. 766−74.
  64. Fromm, H.J. On the equilibrium and mechanism of adenylosuccinate synthetase. Biochem. Biophys. Acta, 1958. 29: p. 255−262.
  65. Honzatko, R.B., Stayton, M.M. nd Fromm, H.J. Adenylosuccinate synthetase: recent developments. Adv. Enzymol. Relat. Areas Mol. Biol, 1999. 73: p. 57−102.
  66. Honzatko, R.B.a.F, H.J. Structure function studies of adenylosuccinate synthetase from Escherichia coli. Arch. Biochem. Biophys, 1999. 370: p. 1−8.
  67. Poland, B. W, Silva, M. M, Serra, M. A, Cho, Y, Kim, K. H, Harris, E.M.S. and Honzatko, R.B. Crystal structure of adenylosuccinate synthetase from Escherichia coli. J. Biol. Chem, 1993. 268(december 5): p. 25 334−25 342.
  68. Markham, G.D. and Reed, G.H. J. Biol. Chem, 1978.253: pp.61 846 189.
Заполнить форму текущей работой

На отлично!